全 文 ：收稿日期:2009-01-06;　修订日期:2010-04-19
基金项目:吉林通化师范学院自然科学科研基金项目(No.200941)
作者简介:胡彦武(1980-),男(民族),吉林四平人 ,现任通化师范学院制
药与食品科学系讲师 ,硕士学位 ,主要从事生药有效成分的分离鉴定及生
物活性研究工作.
黄花忍冬茎和叶提取液中绿原酸
的检测及其体外抑菌研究
胡彦武1 ,李敏玲 2 ,王　娇 1 ,王　迪1
(1.通化师范学院 ,吉林 通化　134002;　2.吉林省通化振国药业有限公司 ,吉林通化　134110)
摘要:目的 测定黄花忍冬茎和叶中绿原酸的含量 , 考察其抑菌效果。方法 采用 HPLC法对黄花忍冬茎和叶中绿原酸含
量进行测定 , 最小抑菌浓度(MIC)测定法对其抑菌效果进行考察。结果 黄花忍冬茎木质部 、韧皮部和叶中绿原酸的含量
分别为 0.34%, 0.27%, 0.11%。黄花忍冬茎和叶提取液对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作
用。结论 黄花忍冬茎和叶中均含有绿原酸 , 其含量和抑菌效果因部位的不同而有差异。
关键词:黄花忍冬;　茎和叶;　绿原酸;　抑菌
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.081
中图分类号:R284.1　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)12-3205-01
　　忍冬属是忍冬科中较大的属之一 ,现知全世界约有 200种 ,
我国约 100种 ,该属植物多为直立或攀援状灌木 ,许多忍冬可供
药用 [ 1] 。其中黄花忍冬 LonicerachrysanthaTurcz.是其中一种 ,主
要分布于东北 、西北 、华北。绿原酸成分一直被认为是忍冬属植
物中的主要有效成分 ,现代药理研究表明 , 其具有抗菌抗病毒等
药理作用。本实验采用准确可靠 、专属性强的 HPLC法对黄花忍
冬茎及叶中绿原酸的含量进行测定 ,并对其提取液的抑菌效果进
行了评价 , 以期评价黄花忍冬不同部位的药用价值 , 为其资源合
理开发利用提供一定参考依据。
1　仪器及试药
美国 Agilent1100型高效液相色谱仪(包括 1100四元泵 、柱
温箱 、二级管阵列检测器 、Agilent化学工作站), KQ-200KDB超
声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司), AL104 1/10万电子
分析天平(梅特勒 -托利多仪器上海有限公司)。绿原酸对照品
(中国药品生物制品检定所 , 批号:110753 -200413), 黄花忍冬
茎 、叶采自通化师范学院校园周边 , 经通化师范学院于俊林教授
鉴定。大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌等均由通化师
范学院制药与食品科学系微生物实验室提供。水(娃哈哈纯净
水),乙腈 , 甲醇为色谱纯 ,磷酸为分析纯。
2　方法与结果 [ 2 , 3]
2.1　色谱条件 色谱柱:PhenomsilC18(5 μm, 150 mm×4.6 mm)
柱;流动相:乙腈 -0.4%磷酸溶液(13∶87);检测波长 327nm;柱
温 25℃;流速 0.8 ml/min;理论板数按绿原酸峰计算应不低于
1 000。
2.2　对照品溶液配制 精密称取绿原酸对照品约 10 mg, 加体积
分数 50%甲醇定容到 10ml棕色容量瓶中 , 制成每浓度为 1 mg/
ml的溶液 , 从中精密量取 1 ml置 25 ml棕色容量瓶中 , 加体积分
数 50%甲醇定容 , 即得浓度为 0.04 mg/ ml对照品溶液 ,备用。
2.3　供试品溶液制备 取黄花忍冬茎木质部 、茎韧皮部和叶粉末
各约 1 g,精密称定 ,加体积分数 50%甲醇 50 ml,精密称定重量 ,
超声处理 30 min, 补足减轻的重量 , 摇匀 , 滤过 , 精密量取续滤液
5 ml,置 25 ml棕色量瓶中 , 加 50%甲醇至刻度 , 摇匀。 0.45 μm
微孔滤膜滤过 , 弃初滤液 ,取续滤液作为样品溶液。
2.4　线性关系的考察 精密吸取绿原酸对照品溶液 5, 10, 15,
20, 25μl进样 , 按上述色谱条件测定峰面积 , 以对照品进样量 X
为横坐标 , 峰面积值 Y为纵坐标 ,绘制标准曲线 , 回归方程为 Y=
416.074 5X+0.671 5, r=0.999 8(n=5), 结果表明绿原酸在
0.20 ～ 1.00 μg范围内 ,具有良好的线性关系。
2.5　含量测定方法考察 精密度试验结果显示 , RSD=1.30%(n
=3), 表明仪器较精密度良好;稳定性试验结果显示 , RSD=
1.15%(n=5),表明供试品溶液在 24 h内基本稳定;重复性试验
结果显示 , RSD=1.14%(n=5),表明方法的重现性良好;加样回
收率试验结果显示 ,平均回收率为 96.81%, RSD值为 1.99%(n
=5), 表明测定方法稳定可靠。
2.6　样品中绿原酸的测定 取供试品溶液制备方法制备的黄花
忍冬茎和叶提取液 10 μl, 按上述色谱条件 , 平行进样 3次 , 测得
黄花忍冬茎和叶中绿原酸含量。结果见表 1。
表 1　黄花忍冬茎和叶中绿原酸含量测定结果
编号 部位 绿原酸平均含量(%) RSD(%)
1 茎韧皮部 0.27 1.14
2 茎木质部 0.34 0.97
3 叶 0.11 1.03
　　n=3
2.7 　抑菌试验
2.7.1　黄花忍冬茎和叶提取液的制备 取黄花忍冬茎木质部 、茎
韧皮部和叶粉末各约 2 g, 精密称定 ,各加体积分数 50%甲醇 50
ml, 进行超声波提取 ,所得滤液进行旋转蒸发浓缩后 ,装入锥形瓶
中 , 制成浓度为 0.1g/ml的药液 , 高压蒸气(121℃, 10 min)灭菌
后 , 置 4℃冰箱中保藏备用。
2.7.2　种菌液的制备 选取常用于绿原酸抑菌试验的几种菌种:
大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽胞杆菌 , 分别在肉汤培养基
37℃下培养 24 h后 ,经振荡 、搅匀 , 采用灭菌水稀释菌悬液后备
用。
2.7.3　黄花忍冬茎和叶提取液对供试菌的抑菌作用 取直径 6
mm的滤纸片分别放入黄花忍冬茎木质部 、茎韧皮部和叶提取液
中 , 并将各部位提取液置于 30℃水浴锅中浸泡 4 h。取出滤纸
片 , 自然风干。将各种供试菌悬液分别用无菌棉均匀涂抹于含琼
脂的无菌平板中 ,然后用无菌镊子夹取含浸出液的滤纸片平整贴
于含菌平板上 ,每皿贴 2 ～ 4片 , 细菌培养箱中 36℃培养下 24 h,
测量滤纸片周围抑菌圈直径大小 ,比较抑菌效果。结果见表 2。
2.7.4　最低抑菌浓度(MIC)的测定 用琼脂培养基稀释黄花忍
冬茎和叶提取液为一系列连续倍比稀释液 ,将其分装于试管中并
加入种菌液 0.05ml, 37℃下培养 48 h, 以含药量低而肉眼看不见
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.12 时珍国医国药 2010年第 21卷第 12期
细菌生长的一管含药量为药物对该菌种的 MIC。结果显示 ,黄花
忍冬茎木质部 、茎韧皮部和叶片提取液对大肠杆菌的 MIC分别
为 0.05 g/ml、 0.025 g/ml和 0.025 g/ml, 对金黄色葡萄球菌的
MIC分别为 0.05 g/ml、0.025 g/ml和 0.0125 g/ml, 对枯草芽孢
杆菌的 MIC分别为 0.05 g/ml、0.05 g/ml和 0.05 g/ml。说明对
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强。
表 2　黄花忍冬不同部位提取液的抑菌效果
菌种 抑菌圈直径 l/mm茎木质部 茎韧皮部 叶
大肠杆菌 8.20 9.50 9.20
金黄色葡萄球菌 6.30 8.20 10.00
枯草芽孢杆菌 4.50 4.50 4.50
3　讨论
黄花忍冬叶 、茎木质部及茎韧皮部中均含有绿原酸 , 且茎木
质部 (0.34%)>茎韧皮部(0.27%)>叶(0.11%)。表明黄花
忍冬具有药用开发利用价值。
黄花忍冬叶 、茎木质部及茎韧皮部的提取液对大肠杆菌 、金
黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用 ,其抑菌强度
与各部位所含绿原酸量的高低无线性关系 ,表明黄花忍冬各部位
提取液中除含有绿原酸外 , 还含有其它的抑菌成分 , 其抗菌效果
亦是所有抑菌物质发生协同作用。
参考文献:
[ 1 ] 　于加平 ,王夕宇 ,马中宇.黄花忍冬果实中绿原酸的提取及含量测
定 [ J] .安徽农业科学 , 2008, 36(6):2199.
[ 2 ] 　中国药典委员会.中国药典 , Ⅰ 部 [ S] .北京:化学工业出版社 ,
2005:152.
[ 3 ] 　梅　林.秀山金银花 、叶 、茎中绿原酸的检测及其抑菌作用研究
[ J] .中国药业 , 2007, 16(3):5.
收稿日期:2009-12-17;　修订日期:2010-05-10
基金项目:广东医学院重点学科建设基金(No.ZK9404)
作者简介:李　蓉(1974-),女(壮族),广西田东人 ,现任广东医学院讲师 ,
硕士学位 ,主要从事肿瘤防治工作.
＊通讯作者简介:黄培春(1954-), 男(汉族),广东廉江人 , 现任广东医学
院教授 ,硕士研究生导师 ,硕士学位 ,主要从事肿瘤的预防与治疗工作.
漆树黄酮对人肝癌细胞株 HepG2增殖 、
生长周期和细胞凋亡的影响
李　蓉 1 ,黎小兵 1 ,蔡康荣2 ,黄培春 1＊
(1.广东医学院病理生理学教研室 ,广东 湛江　524023;　
2.广东医学院分析中心 ,广东 湛江　524023)
摘要:目的 观察漆树黄酮对人肝癌细胞株 HepG2细胞生长增殖和生长周期的影响 , 并初步探讨其作用机制。 方法 采
用 MTT比色法研究漆树黄酮对人肝癌细胞株 HepG2细胞生长抑制作用;通过流式细胞仪检测 DNA含量 , 分析细胞周期
的分布。结果 MTT实验结果表明较高浓度的漆树黄酮对人肝癌细胞株 HepG2细胞具有直接的抑制作用 ,并呈剂量和时
间依赖性 , 200 μmol· L-1的漆树黄酮作用于人肝癌细胞株 HepG2细胞 72 h后 ,对细胞生长的抑制率最高可达 53.78%,
同对照组相比(P<0.01);流式细胞术实验结果表明 ,不同浓度的漆树黄酮作用于人肝癌细胞株 HepG2 12 h后 ,可使 G
1
期肿瘤细胞增多 , 引起 G1期阻滞 , 作用时间为 24 h、48h时 , 则可引起 S期阻滞;同时 , 不同浓度的漆树黄酮在不同的时
间点都可使 HepG2细胞出现明显的凋亡峰。结论 漆树黄酮具有直接抑制肿瘤细胞生长的作用 ,其机制可能与引起细胞
周期阻滞和诱导凋亡有关。
关键词:漆树黄酮;　肝癌;　HepG2;　增殖;　生长周期;　凋亡
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.082
中图分类号:R285.5;R735.7　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)12-3206-03
　　肝细胞癌是肝癌最常见的类型 ,在世界范围内是肿瘤患者肿
瘤死亡的主要原因之一 [ 1] 。在过去的二十多年里其发病率显著
上升。手术切除一直被认为是最佳治疗方法 ,但只有小部分患者
适宜于手术 , 而且手术之后复发率高。用于防止复发的方法包括
术前化疗栓塞和术后新辅助化疗 , 都没有被证明是有益的 [ 2] 。
因此 , 寻找能够更有效的治疗和预防这种恶性肿瘤的药物是有必
要的。最近 , 利用饮食中存在的物质用于肿瘤的预防或治疗受到
人们的广泛关注。漆树黄酮(Fisetin), 3, 3′, 4′, 7-四羟基黄酮 ,
被发现是存在于烟树中的可食用植物黄酮 ,同时也广泛存在于水
果和蔬菜中 , 例如草莓 、洋葱 、黄瓜 、苹果 、葡萄和柿子 , 含量 2 ～
160μg/g[ 3] 。据报道漆树黄酮具有抗氧化 [ 4] 、抗炎症 [ 5]等生理
活性 , 对于心血管疾病及肿瘤的防治作用一直备受国外关注 ,目
前的研究发现漆树黄酮在体外能抑制多种肿瘤细胞的生长与增
殖 , 如胰腺癌 、前列腺癌 、结直肠癌等 , 其机制广泛 ,但对肝癌的研
究则相对较少 , 为了解漆树黄酮对肝癌的抑癌效果 ,进一步开发
漆树黄酮的药用价值 , 本文就漆树黄酮体外对人肝癌细胞株
HepG2细胞增殖 、生长周期和凋亡的影响进行了研究。
1　材料与仪器
1.1　细胞株 人肝癌细胞株 HepG2由广东省天然药物研究与开
发重点实验室中心提供 , 均以含 10%小牛血清 、青霉素 100 U/
ml、链霉素 100μg/ml的 RPMI-1640培养基 37℃、5% CO2培养
箱培养 。
1.2　药品和试剂 漆树黄酮购自 sigma公司 , 碘化丙啶 、核糖核
酸酶 、噻唑蓝 、二甲基亚砜均为 sigma公司产品 , 北京鼎国公司分
装;小牛血清为杭州四季春公司产品 , RPMI-1640为 GIBCO公
司产品 ,其他试剂均为国产分析纯。
1.3　仪器 培养箱(日本 HITEL公司), thermoelectroncorpora-
tionvarisskanflash酶标仪 、EPICSXL型流式细胞仪(COUNTER美
国)。
2　方法
2.1　实验分组 实验分为①空白组:每孔仅为 1640培养液 ,在测
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.12