全 文 ：256 食品与药品 Food and Drug 2012年第 14卷第07期
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木芙蓉叶总黄酮提取纯化工艺的研究
付信宝，孙运峰，张 佩，周长征*
（山东中医药大学药学院，山东 济南250355）
摘 要：目的 研究提取纯化木芙蓉叶总黄酮的工艺。方法 采用正交试验优选总黄酮的最佳提取条件并用聚酰胺纯化。结
果 最佳提取条件为提取3次，乙醇浓度50 %，料液比1:10，提取时间1.5 h。聚酰胺纯化条件为上样浓度2.25 mg/mL，乙醇
解吸浓度70 %，解吸速率2 BV/h，洗脱液用量为2.5 BV。结论 利用本实验的优化工艺可使总黄酮纯度达到60 %，工艺可
行。
关键词：木芙蓉叶；总黄酮；聚酰胺
中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2012）07-0256-05
收稿日期：2011-07-05
作者简介：付信宝（1986-），男，山东临沂人，硕士研究生，药剂学专业
*通讯作者：周长征，副教授，硕士生导师，E-mail:zcznfj@sina.com
The Study of Extraction and Purifi cation of the total Flavonoids of Hibiscus mutabilis Leaf
FU Xin-bao,SUN yun-feng, ZHANG pei,ZHOU chang-zheng
(Coollege of Medicine，Shandong University of traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)
Abstract: Objective To study the optimum extraction and purification of the total flavonoids from the leaves of
Hibiscus mutabilis. Methods The orthogonal design was used to fi nd the optimum extraction conditions and purifi ed
extracts with polyamide. Results Optimum extraction conditions: the concentration of ethanol was 50 %, the ratio
of material to solvent was l:10, extraction for 3 times and 1.5 hours each time. Polyamide purifi cation conditions: the
concentration of adsorption solution was 2.25 mg/mL, and the fl owing rate of desorption was 2 BV/h. In the course
of elution, the resin column chromatography was eluted with 2.5 BV 70 % ethanol. Conclusion The total fl avonoids
purity can reach 60 % by the conditions, the technology is feasible.
Key Words: Hibiscus mutabilis leaf; total fl avonoids; polyamid
木芙蓉叶为部颁法定药材，又名芙蓉花叶，为锦
葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的叶，味微辛而
滑，无毒，有凉血、解毒、消肿、止痛等功效[1-2]。
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木芙蓉对滴虫、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌
有抑制作用且具抗炎活性[3]。近年研究证明，木芙蓉
花、叶中含有芸香苷等黄酮类化合物[4]。本实验研究
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了木芙蓉叶总黄酮提取纯化工艺，为进一步研究木芙
蓉叶的有效成分打下基础。
1 仪器与试剂
UV-3010紫外分光光度计（日本岛津）；FD-1C-
50冷冻干燥机（西安德派生物）；层析柱2.6 cm×40 cm，
3.0cm×90 cm（上海同兴化工）。
芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；聚酰
胺树脂（30~60目，60~80目，天津立龙化工）；乙
醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠
（国药集团），均为分析纯。
2 含量测定方法
2.1 标准曲线的绘制
取105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品25 mg，精密
称定，置入25 mL容量瓶，加15 mL甲醇溶解，加水
定容至刻度，摇匀，配成浓度为1 mg/mL对照品溶
液。分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，
2.5 mL，分别置入25 mL容量瓶，用水均补至5 mL，
加5 %亚硝酸钠溶液0.6 mL，混匀，静置6 min，加
10 %硝酸铝溶液0.6 mL，混匀，放置6 min，加4 %
氢氧化钠溶液3 mL，再用70 %乙醇定容至刻度，摇
匀，静置15 min，以相应的试剂为空白，在510 nm[4]
波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐
标，绘制标准曲线，得出线性回归方程：A=13.08C－
0.005 8（R2=0.999 6），线性关系良好。
2.2 样品提取与制备方法
用高速粉碎机粉碎干木芙蓉叶，过100目筛备
用。取9份药材粉各3.00 g，精密称定，按照表3方案
试验，提取液过滤、浓缩后定容至100 mL容量瓶待测。
2.3 稳定性
室温放置4，6，8，10，15，20，25，30，35 min，
分别测定吸光度，结果表明，10 min后吸光度值发生
变化，故显色后必须在10 min内测定。
2.4 精密度
取同一木芙蓉叶提取液6份，经显色后测定溶液
的总黄酮含量，平均含量0.56 mg/mL，RSD 1.31 %。
2.5 加样回收
精密量取2.25 mg/mL样品溶液10 mL，加1 mg/mL
芦丁对照品溶液2 mL，按测定样品中总黄酮的方法测
定，平行做3次，结果测得平均回收率95.66 %，RSD
1.61 %。
表1 木芙蓉叶4种提取方法比较
方法 总黄酮含量/mg·g-1
回流法 21.06
渗漉法 11.21
超声法 15.49
索氏提取法 13.58
表2 正交试验因素水平表
表3 正交试验设计及结果
表4 正交试验方差分析表
水
因素
A提取次数 B乙醇浓度/% C料液比 D提取时间/h
1 1 40 1: 8 1
2 2 50 1:10 1.5
3 3 60 1:12 2
试验号 A B C D 总黄酮提取量/mg·g-1
1 1 1 1 1 15.34
2 1 2 2 2 17.63
3 1 3 3 3 18.17
4 2 1 2 3 20.34
5 2 2 3 1 21.23
6 2 3 1 2 20.58
7 3 1 3 2 22.79
8 3 2 1 3 21.56
9 3 3 2 1 22.17
K1 17.047 19.480 19.160 19.580
K2 20.717 20.140 20.047 20.333
K3 22.173 20.307 20.730 20.023
R 5.126 0.817 1.570 0.753
因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 显著性
A 41.873 2 48.690 19.000 *
B 1.117 2 1.299 19.000
C 3.718 2 4.323 19.000
D 0.860 2 1.000 19.000
3 提取工艺优化
3.1 木芙蓉叶4种提取方法比较
结果表明，乙醇回流法提取木芙蓉叶总黄酮效果
最好，所以选用此法进行工艺优化试验[6]。
3.2 正交试验及结果
直观分析测定结果表明，影响木芙蓉叶总黄酮提
取的因素为A>C>B>D。另由表4方差分析可见，提取
次数A对木芙蓉叶总黄酮的提取有显著影响，乙醇浓
度、料液比和提取时间对总黄酮的提取影响不大，综
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合分析得到最佳提取工艺为A3B2C2D2，即提取3次，
乙醇浓度50 %，料液比1:10，提取1.5 h。
3.3 验证试验
表6 不同目数聚酰胺静态吸附效果
目数 静态吸附量/mg·g-1 吸附率/% 解吸率/% Y
30～60 18.74 87.53 91.18 0.798
60～80 17.26 85.66 91.05 0.780
表7 上样液浓度对吸附的影响
上样浓度/mg·mL-1 吸附量/mg·g-1
2.25 15.12
1.88 14.97
1.61 15.02
1.41 14.91
1.25 14.89
1.13 14.57
4.3.2 不同目数聚酰胺静态吸附量试验 取已处理的不
同目数的聚酰胺各2.0 g，置入100 mL锥形瓶。加入
20 mL上样液，隔10 min振摇30 s，持续2 h，静置24
h，过滤，测定滤液中总黄酮浓度。滤出静态饱和吸
附后的树脂，吸干表面水分，再精密加入70 %乙醇50
mL，隔10 min振摇30 s，持续2 h，静置24 h，过滤，
测定滤液中的总黄酮浓度，结果见表6。
表5 验证试验结果
编号 总黄酮提取量/mg·g-1
1 23.01
2 22.37
3 23.04
由表5可见，采用最佳提取工艺条件提取木芙蓉
叶总黄酮，工艺重现性较好，RSD 0.83 %。
4 纯化工艺优化及结果
单位吸附量 =（初始浓度－余下浓度）×溶液体
积/树脂质量，
吸附率 =（初始浓度－余下浓度）/初始浓度×
100 %，
解吸率 =解吸液黄酮浓度×解吸液体积/解吸前黄
酮含量× 100 %，
根据吸附率和解吸率确定采用聚酰胺树脂较好。
4.1 聚酰胺的预处理
聚酰胺用95 %乙醇浸泡24 h，蒸馏水洗至无醇
味，滤干水分，干燥备用。
4.2 上样液的制备
取木芙蓉叶粗粉适量，按最佳工艺条件提取，提
取液浓缩至无醇味，然后加1 BV水加热溶解，过滤。
滤液用水定容于2 L容量瓶，作为上样液，浓度为2.25
mg/mL。
4.3 聚酰胺对木芙蓉叶总黄酮的静态吸附量实验
用分光光度法解吸附聚酰胺溶液，测定初始和洗
脱溶液中总黄酮浓度，根据总黄酮的解吸附量计算吸
附和解吸率。
4.3.1 预试验 准确称取已经处理的聚酰胺2.0 g备用。
再精密移取上样液100 mL，置入250 mL锥形瓶，摇
匀。投入聚酰胺，隔10 min振摇30 s，持续2 h，静置
24 h，聚酰胺充分吸附后，测定吸光度值；滤出吸附
饱和的聚酰胺，滤纸上吸干样液，置入250 mL锥形
瓶，再精密加入70 %乙醇100 mL解吸附，隔10 min振
摇30 s，持续2 h，静置24 h。聚酰胺充分吸附后再测
定吸光度值，计算饱和吸附量为19.20 mg/g，解吸率
91.12 %。实验结果较理想，故选择聚酰胺对木芙蓉
叶总黄酮进行纯化试验。
由表6可见，两种目数的聚酰胺树脂静态吸附量
（mg/g）相差较小。
4.4 聚酰胺木芙蓉叶总黄酮的动态吸附量实验
准确称取已经处理的聚酰胺2.0 g，装入层析柱，
精密移取上样液50 mL，上样，以2 BV/h流速过柱，
收集过柱液，定容于50 mL容量瓶，测定吸光度值。
通过线性回归方程，计算过柱液中总黄酮浓度为
0.612 mg/mL，计算得动态吸附量为15.30 mg/g。
4.5 上样液浓度对吸附的影响
准确称取已经处理的聚酰胺6份，每份约2.0 g，
装入层析柱备用；再精密移取6份上样液，每份50
mL，分别加0，10，20，30，40，50 mL水，混匀后
上样，以2 BV/h流速过柱，收集过柱液，定容于100
mL容量瓶中，测定吸光度值计算，结果见表7。
4.6 流速对吸附的影响
准确称取已经处理的聚酰胺6份，每份约2.0 g，
装入层析柱备用；再精密移取6份上样液，每份50 mL，
上样，分别以1，2，3，4，5，6 BV/h流速过柱，过
柱液定容于100 mL容量瓶，测定吸光度值，以流速为
横坐标，总黄酮吸附率为纵坐标绘图。
食品与药品 Food and Drug 2012年第 14卷第07期 259
4.7 泄露曲线的考察
准确称取已经处理的聚酰胺2.0 g，装入层析柱备
用；再移取上样液100 mL上样，以2 BV/h流速过柱，
收集过柱液，每10 mL作为1个流分，测定各流分中总
黄酮吸光度值。以累计总体积为横坐标，总黄酮浓度
为纵坐标作图。
图1 流速对聚酰胺吸附的影响
吸
附
率
/m
g•
g-
1
流速/BV·h-1
表8 验证试验结果
试验编号 总固物量/mg 总黄酮量/mg 总黄酮含量/%
1 27.03 16.03 59.23
2 28.41 17.76 62.52
3 27.93 17.15 61.41
平均 27.79 16.98 61.02
4.8 洗脱液的选择
分别精确称取已经处理的聚酰胺4份，每份2 g，
按2.2方法让聚酰胺吸附饱和后装柱，用100 mL蒸馏
水洗脱后分别用30 %，50 %，70 %，90 %乙醇溶液
100 mL以2 BV/h流速过柱，收集洗脱液计算解吸率。
4.9 洗脱液用量的考察
准确称取已经处理的聚酰胺4.0 g，装入层析柱
备用；精密移取上样液20 mL上样，以2 BV/h流速过
柱，先用蒸馏水约80 mL洗脱至收集液无色，加三氯
化铁试液无颜色反应；再用20 %乙醇80 mL洗脱至收
集液加三氯化铁无颜色反应，以及无紫外吸收；最后
用70 %乙醇以2 BV/h流速洗脱，收集过柱液，每10
mL作为1个流分，测定各流分中总黄酮吸光度值。以
洗脱体积为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线。
4.10 验证实验
根据优化试验结果，确定木芙蓉叶总黄酮纯化
工艺：称取处理好的聚酰胺（30～60目）10 g，湿法
装柱（柱长120 cm，直径4 cm），取上样液50 mL上
样，依次用500 mL蒸馏水、20 %乙醇250 mL、70 %
乙醇300 mL洗脱，收集洗脱液，平行试验3次，测定
总黄酮浓度，冷冻干燥，得总固物，测定纯度，结果
见表8。
5 小结
以正交试验优选木芙蓉叶总黄酮最佳提取工艺
为A3B2C2D2，即提取3次，乙醇浓度50 %，料液比
1:10，提取时间1.5 h，验证试验说明该工艺可行；优
化木芙蓉叶总黄酮纯化工艺，得到最优纯化工艺为：
上样浓度2.25 mg/mL，乙醇解吸浓度 70 %，解吸速
率2 BV/h，洗脱液用量2.5 BV。用聚酰胺纯化后，总
黄酮纯度达到60 %，比纯化前提高了15 %，对实际
生产具有指导意义。
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收稿日期：2012-01-09
作者简介： 丁嘉信，硕士，从事新药新剂型研究 E-mail:dingjiaxin007@163.com
*通讯作者：田景振，博士，教授，泰山学者，博士生导师，从事新药新剂型与新技术研究 Tel:0531-89628080,
E-mail:tianjingzhen@163.com
银杏叶提取物总黄酮紫外分光光度法含量测定的适应性研究
丁嘉信1，李万忠1,2，李慧芬1，崔伟亮1，李荣荣1，胡本岩3，田景振1*
（1.山东中医药大学 山东 济南 250355； 2.潍坊医学院 山东 潍坊 261053；3.龙口经济开发区医院，山东 烟
台 265706）
摘 要：目的 建立适应银杏叶提取物总黄酮含量的紫外分光光度测定法。方法 比较亚硝酸钠–硝酸铝–氢氧化钠、三氯化
铝、盐酸-镁粉、硼酸–柠檬酸、三乙胺5种显色法在350～700 nm波长扫描图谱，分析不同显色方法对银杏叶提取物总黄
酮含量测定的适应性。结果 三氯化铝显色法在0.0898～0.9878 mg/mL范围内与吸光度（A）线性关系良好，回归方程为
y=903.81x+9.6181，r=0.9991，加样回收率为99.3％，RSD=1.5％。样品中总黄酮含量为199.8 mg／g。结论 该方法简便、
快速、可靠、重复性好，可以适用于银杏叶提取物总黄酮含量测定。
关键词：银杏叶提取物；总黄酮；紫外分光光度法；含量测定
中图分类号：TQ460.7+2 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2012）07-0260-04
Adaptability Study on Determination of Total Flavonoids in Extract of Ginkgo biloba Leaves
by Ultraviolet Spectrophotometry
DING Jia-xin1, LI Wan-zhong1,2, LI Hui-fen1, CUI Wei-liang1, LI Rong-rong1, HU Ben-yan3, TIAN Jing-zhen1
(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2.Weifang medical University, Weifang
261053, China；3. Economic Development Hospital of Longkou,Yantai 265706, China)
Abstract: Objective To establish a ultraviolet spectrophotometry method for the determination of total fl avonoids
in extract of Ginkgo biloba leaves. Methods Wavelength-scanning spectra were compared between 350 nm and 700
nm with coloration methods by NaNO2–Al(NO3)3–NaOH, AlCl3, Mg–HCl, boric acid–citric acid and triethylamine,
respectively. Adaptability was analyzed for the determination of total fl avonoids in extract of Ginkgo biloba leaves
with different coloration methods. Results The absorbance and concentration of total fl avonoids had a good linear
relationship in the range of 0.0898-0.9878 mg/mL. The regression equation was y=903.81x+9.6181，r=0.9991. The
average recovery was 99.3％ and the RSD was 1.5%. The total fl avonoids content was 199.8mg／g. Conclusion The
method can be simple, rapid, reliable and reproducible, and can be used for the determination of total fl avonoids in
extract of Ginkgo biloba leaves.
Key Words: extract of Ginkgo biloba leaves；total fl avonoids；ultraviolet spectrophotometry；content determination
银杏叶中化学成分种类繁多，许多成分具有生物
活性，其中含量较高的总黄酮类较受人们关注。银杏
叶提取物中总黄酮在抗菌消炎、抗氧化和治疗心脑血
管疾病等方面具有独特疗效。
测定银杏叶总黄酮含量常用分光光度法[1]和高效
液相色谱法，近年为找到简便准确快速的测定方法，
研究人员从各种角度入手研究了测定银杏黄酮的方
法。总黄酮含量作为质量控制指标，常采用紫外分光
光度法测定，应用较广的有亚硝酸钠–硝酸铝–氢氧化
钠、三氯化铝法[2-3]、盐酸镁粉法[4]、硼酸-柠檬酸法[5]