全 文 ：甘木通总黄酮保护H2O2 诱导的 PC12 细胞损伤
黄海潮1， 聂 阳1， 张小红1， 朱庆玲1， 巫 玮1， 周 捷2
( 1． 广东食品药品职业学院实验实训中心，广东 广州 510520; 2． 中山大学肿瘤防治中心药学部，广东
广州 510060)
收稿日期: 2015-05-26
基金项目: 广东省中医药局中医药强省项目 ( 20141197) ; 广东省医学科学技术研究基金项目 ( B2013071) ; 广东食品药品职业学院自
然科学项目 ( 2012YZ007)
作者简介: 黄海潮 ( 1982—) ，男，硕士，实验师，从事活性物质筛选研究。Tel: ( 020) 28854990，E-mail: huanghac@ gdyzy． edu． cn
摘要: 目的 探讨甘木通 ( Clematis filamentosa) 总黄酮 ( TFC) 对 H2O2 引起的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 ( PC12 细
胞) 损伤的保护作用。方法 用 H2O2 损伤 PC12 细胞建立神经元氧化应激损伤模型，噻唑蓝 ( MTT) 法检测细胞存
活率，观察甘木通总黄酮对神经元损伤的作用; 形态学以及 Hoechst 33258 染色观察 TFC 对细胞形态的影响; 生化法
测定超氧化物歧化酶 ( SOD) 活性以及丙二醛 ( MDA) 的量。结果 与 200 μmol /L H2O2 诱导的模型组对比，中 ( 10
μg /mL) 、高 ( 100 μg /mL) 剂量甘木通总黄酮预处理细胞形态好于模型组，细胞活性明显增强 ( P ＜ 0. 05) ，细胞内
的 SOD活性增强 ( P ＜ 0. 05 ) ，MDA 水平减低 ( P ＜ 0. 05 ) 。结论 甘木通总黄酮对 H2O2 引起的神经损伤有保护
作用。
关键词: 甘木通; 总黄酮; PC12 细胞; SOD; MDA
中图分类号: R285. 5 文献标志码: A 文章编号: 1001-1528( 2015) 12-2585-05
doi: 10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 12. 003
Neuroprotective effects of total flavones from Clematis filamentosa against H2O2-
induced injury to PC12 cells
HUANG Hai-chao1， NIE Yang1， ZHANG Xiao-hong1， ZHU Qing-ling1， WU Wei1， ZHOU Jie2
( 1． Experiment Center of Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China; 2． Department of Pharmacy，SUN YAT-SEN Uni-
versity Cancer Center，Guangzhou 510060，China)
ABSTRACT: AIM To study neuroprotective effects of total flavones from Clematis filamentosa ( TFC) on H2O2-
induced injury to rat pheochromocytoma cells ( PC12 cells) ． METHODS The viability of PC12 cells injured by
H2O2 was determined by MTT assay． The cellular morphology was observed by Hoechst 33258 staining to evaluate
protective effects of TFC on the injured cells． The SOD viability and MDA levels were detected by biochemical
methods． RESULTS Compared with the model group，cell viability and SOD activity of TFC pretreated groups
( 10 μg /mL，100 μg /mL) were higher ( P ＜ 0. 05) and the MDA level was lower ( P ＜ 0. 05) obviously．
CONCLUSION TFC shows neuroprotective effects on PC12 cells injured by H2O2 ．
KEY WORDS: Clematis filamentosa; total flavone; rat pheochromocytoma cells ( PC12 cells) ; SOD; MDA
脑中风是一组以脑部缺血及出血性损伤症状
为主要临床表现的疾病，又称脑卒中或脑血管意
外。其病因是由于脑血流供应障碍引起缺血和缺
氧而导致局限性脑组织缺血性坏死或脑软化的疾
病［1］。自由基诱导的脂质过氧化被认为是脑缺血
及缺血后再灌注损伤的主要机制之一，使用 H2O2
诱导神经元凋亡，模拟氧化应激水平的升高对神
经元的毒性作用是目前研究脑缺血中风的主要细
胞模型［2］。
甘木通为毛茛科丝铁线莲 ( Clematis filamento-
sa Dunn) 的叶，民间俗称为 “眼蛇药”，有活血
通脉降压、镇静安神之功效。据 《全国中草药汇
编》记载，甘木通对脑血管意外引起的中风偏瘫
患者均有治疗作用。目前，对于甘木通研究集中在
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心血管系统方面［3］，其在神经系统尤其在脑中风
中的作用还未见相关的文献报道。课题组通过提取
分离甘木通总黄酮 ( total flavones from Clematis fila-
mentosa，TFC) ，运用形态和功能与神经元相似的
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 ( PC12 细胞) 研究其
神经保护作用，丰富其药物治疗的理论，便于其深
入开发研究。
1 仪器与材料
1. 1 细胞与试剂 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞
( PC12 细胞) ( 购自中国医学科学院细胞研究所) ;
甘木通药材 ( 购于广东康美药业中药饮片厂) ; 细
胞培养瓶、24 孔板、96 孔板 ( 美国 Corning 公
司) ; DMEM培养基，马血清 ( 美国 Gibco 公司) ;
胎牛血清 ( FBS) ( 杭州四季青公司) ; 胰蛋白酶
( 美国 Amresco 公司分装) ; Triton X-100、噻唑蓝
( MTT) 、二甲基亚砜 ( DMSO ) ( 美国 Sigma 公
司) ; 磷酸缓冲液 ( PBS) ( pH 7. 2) ( 杭州吉诺生
物医药技术有限公司) ; 其他试剂均为分析纯。
1. 2 仪器 水平离心机 ( 湘仪离心机厂) ; 荧光
倒置显微镜 ( 德国 Leica 公司) ; CO2 细胞培养箱、
二级生物安全柜 ( 美国 Thermo 公司 ) ; 酶标仪
( 美国 BIO-TEK公司) 。
2 方法与结果
2. 1 甘木通总黄酮的制备 甘木通药材干燥
后，粉碎备用，根据文献［4］采用表面活性剂 －
超声协同提取，甘木通总黄酮得率为 1. 06%。
所得总黄酮用 DMEM 培养基超声溶解，无菌过
滤备用。
2. 2 细胞培养 将 PC12 细胞接种于含有 5% FBS
和 5%马血清、100 U /mL 青霉素、0. 1 mg /mL 硫
酸链霉素的 DMEM 培养基中，于 37 ℃、饱和湿
度、5% CO2 细胞培养箱中培养 24 h 后换液一次，
细胞接种第 3 天，用 0. 25%的胰酶消化传代。细
胞传代至第 4 代，取对数生长期 PC12 细胞，调整
细胞数至 4 × 104 个 /mL单细胞悬液，接种于 96 孔
细胞培养板中，每孔加入 100 μL 单细胞悬液，在
37 ℃、体积分数 5% CO2 培养箱中培养至细胞融
合度达到 90%时，更换成无血清 DMEM 培养基，
实验待用。
2. 3 甘木通总黄酮对 PC12 细胞增殖的影响 取
实验待用细胞，于每孔加入不同质量浓度的甘木通
总黄酮，使其最终分别为 0、0. 1、1、10、100、
1 000 μg /mL。并设空白调零孔 ( 只加 DMEM 培养
基，不加细胞) 。每组均设 5 个复孔，培养48 h，
每孔加入 5 mg /mL MTT 10 μL，37 ℃继续培养4 h，
弃上清液，每孔加入 DMSO 100 μL，用酶标仪检
测各孔在 490 nm 波长下的吸光度 ( D) 值。通过
吸光度值高低反映细胞的活力。细胞活性计算如
下: 细胞活性( % ) = D药物组 /D空白细胞组 × 100%
2. 4 H2O2 对 PC12 细胞的作用 取实验待用细胞，
于每孔加入不同量的 H2O2，使其终质量浓度分别
为 0、50、100、200、400、800 μg /mL。每组均设
5 个复孔，培养 12 h，每孔加入 5 mg /mL MTT
10 μL，37 ℃继续培养 4 h，弃上清液，每孔加入
DMSO 100 μL，用酶标仪检测各孔在 490 nm 波长
下的吸光度 ( D) 值。
2. 5 不同质量浓度 TFC对 H2O2 引起 PC12 细胞损
伤的影响 取“2. 2”项实验待用细胞，实验分组
为空白细胞组，H2O2 损伤组 ( 200 μmol /L H2O2 ) ，
并参照相关文献［5］设置阳性对照组 ［200 μmol /L
H2O2 +200 μmol /L维生素 E ( VE) ］，低 ( 200 μmol /
L H2O2 + 1 μg /mL TFC) 、中 ( 200 μmol /L H2O2 +
10 μg /mL TFC ) 、高剂量保护组 ( 200 μmol /L
H2O2 + 100 μg /mL TFC) ，TFC先加入 PC12 细胞中
预保护 24 h，再加入终浓度为 200 μmol /L的 H2O2
作用 12 h，用 MTT 法观察 TFC 对 H2O2 引起 PC12
细胞损伤的影响。
2. 6 TFC对 PC12 细胞形态的影响 取实验待用
细胞，实验分成 空 白 细 胞 组、H2O2 损 伤 组
( 200 μmol /L H2O2 ) 、TFC 预保护组 ( 200 μmol /L
H2O2 + 100 μg /mL TFC) 、阳性对照组( 200 μmol /L
H2O2 + 200 μmol /L VE) 。先加入药物预处理 12 h，
再加入终浓度为 200 μmol /L的 H2O2 作用 12 h 后，
用倒置显微镜观察细胞形态变化。再加入 4%的多
聚甲醛固定，用 10 μg /mL的 Hoechst 33258 对细胞
进行染色 10 min 后，用荧光倒置显微镜观察细胞
形态。
2. 7 甘木通总黄酮对 PC12 细胞中 SOD、MDA 量
的影响［6］ 实验分组为空白细胞组，H2O2 损伤组
( 200 μmol /L H2O2 ) ，低 ( 200 μmol /L H2O2 +
1 μg /mL TFC) 、中 ( 200 μmol /L H2O2 + 10 μg /mL
TFC) 、高剂量保护组 ( 200 μmol /L H2O2 + 100
μg /mL TFC) 。细胞接种于 24 孔板，先加入 TFC
预处理 12 h，再加入终浓度为 200 μmol /L的 H2O2
作用 12 h 后，去除原培养液，用 PBS 洗 2 遍，每
孔加入 0. 1 mol /L 的 PBS 和 0. 05 mmol /mL 的 ED-
TA ( pH 8. 0) 1 mL，再加入 50 μL 1%的 Triton X-
100，将培养板置振荡器振荡 1 min 使之溶解，加
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入 25%的 H3PO4 100 μL，12 000 r /mim 于 4 ℃离
心 1 h，取上清液，按说明书测定 SOD 活性和
MDA水平。
2. 8 统计分析 所有数据均用 x ± s表示，用 SPSS
18. 0 软件对数据进行统计分析，组间比较采用单
因素方差分析，以 P ＜ 0. 05 为差异具有统计学
意义。
3 结果
3. 1 不同质量浓度 TFC 对 PC12 细胞活性的影响
结果所示在 0 ～ 100 μg /mL 范围内，TFC 对细胞
的活性没有明显影响 ( P ＞ 0. 05 ) ，当达到
1 000 μg /mL时，TFC 对细胞的活性下降较明显
( P ＜ 0. 05 ) ; 因此，后面的实验设计不超过
100 μg /mL。结果如图 1 所示。
注: 与空白细胞组比较，* P ＜ 0. 05
图 1 甘木通总黄酮对 PC12 细胞活性影响 ( x ± s，n =5)
Fig. 1 Effects of TFC on cell viability in PC12 ( x ± s，n =
5)
3. 2 H2O2 对 PC12 的损伤作用 H2O2 对 PC12 细
胞的抑制作用明显，在 H2O2 达到50 μmol /L时，
细胞增值率明显下降 ( P ＜ 0. 05 ) ，随着浓度的加
大，细胞活性降低明显，当超过 400 μmol /L 时，
抑制趋缓，表明在该浓度下，接近最大抑制浓度。
结合实验结果，参考对比相关文献［5-8］，选择
H2O2 损伤 PC12 细胞的浓度为 200 μmol /L，见
图 2。
3. 3 TFC对 H2O2 引起 PC12 细胞氧化损伤的作用
H2O2 明显抑制 PC12 细胞的活性，在低剂量 TFC
预保护下，H2O2 对细胞的损伤程度减轻，但作用
不明显 ( P ＞ 0. 05 ) ，在中高剂量 TFC 下，TFC 的
保护作用明显，细胞损伤程度明显减少 ( P ＜
0. 05) 。阳性对照组对 H2O2 引起的细胞损伤同样
具有保护作用。结果见图 3。
3. 4 TFC对 H2O2 损伤 PC12 细胞形态的影响 分
别用倒置显微镜和荧光显微镜观察，空白细胞组呈
注: 与空白细胞组比较，* P ＜ 0. 05
图 2 H2O2 对损伤 PC12 细胞活性影响 ( x ± s，n =5)
Fig. 2 Effects of H2O2 on cell viability in PC12 ( x ± s，
n =5)
注: 与空白细胞组比较，* P ＜ 0. 05; 与 H2O2 损伤组比较，
#P ＜ 0. 05
图 3 甘木通总黄酮对 H2O2 损伤 PC12 细胞活性的影响
( x ± s，n =5)
Fig. 3 Effects of TFC on PC12 cells viability injured by
H2O2 ( x ± s，n =5)
不规则多角形，Hoechst 染色显示空白细胞组中的
PC12 细胞核呈暗蓝色; 在 H2O2 诱导下，细胞轮
廓变得模糊，Hoechst结果显示，亮蓝色增多明显，
表明细胞碎片增多; 阳性对照组与 TFC 预保护组
显示细胞形态较损伤组完好，细胞贴壁生长明显增
多，细胞形态部分恢复; Hoechst 结果显示细胞碎
片较损伤组减少，结果显示 TFC 能减轻 H2O2 引起
PC12 细胞凋亡的损伤作用。结果见图 4。
3. 5 TFC对 SOD 活性以及 MDA 水平的影响 与
空白细胞组对比，H2O2 损伤组明显减少 SOD 的活
性，MDA水平明显增加。TFC 预保护组中，低剂
量组与模型组没有明显的区别 ( P ＞ 0. 05 ) ，中、
高剂量组与模型组对比，SOD 活性增加明显，
MDA水平降低。结果见表 1。
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注: A ～ D为在倒置显微镜下观察; E ～ H为在荧光显微镜下观察
图 4 甘木通总黄酮对 H2O2 诱导 PC12 细胞损伤形态影响
Fig. 4 Effects of TFC on H2O2-injured PC12 cells morphology
表 1 TFC对 H2O2 损伤 PC12 细胞 SOD 活性和 MDA 水
平的影响 ( x ± s，n =3)
Tab. 1 Effects of TFC pretreatment on activity of SOD
and level of MDA in H2O2-injured PC12 cells
( x ± s，n =3)
组别
剂量 /
( μg·mL －1 )
MDA /
( nmol·L －1 )
SOD /
( U·mL －1 )
空白细胞组 － 3. 24 ± 0. 12 1. 76 ± 0. 08
模型组( H2O2 ) － 5. 15 ± 0. 11* 0. 80 ± 0. 08*
甘木通总黄酮低剂量组 1 4. 96 ± 0. 15 0. 88 ± 0. 06
甘木通总黄酮中剂量组 10 4. 44 ± 0. 19#* 1. 02 ± 0. 09#*
甘木通总黄酮高剂量组 100 4. 20 ± 0. 13#* 1. 23 ± 0. 11#*
注:与空白细胞组比较，* P ＜ 0. 05; 与模型组比较，#P ＜ 0. 05
4 讨论
氧化应激 ( oxidative stress) 是指机体在遭受
各种有害刺激时，体内或细胞内活性氧 ( reactive
oxygen species，ROS) 的产生与抗氧化之间失衡，
从而导致 ROS 在体内蓄积，并引起一系列生物反
应的过程［9］。正常脑组织中含高水平的不饱和脂
肪酸、儿茶酚胺和高水平的氧化代谢，是最易受氧
自由基侵袭的靶器官，加上脑组织清除自由基的能
力较差，对活性氧引起的损伤更加敏感［10］; 因此，
氧化应激等非传统风险因素已成为缺血性卒中
( ischemic stroke，IS) 研究的焦点［11］。MDA 是神
经元脂质过氧化的产物，SOD 是神经元内存在抗
氧化系统中重要的生物酶，MDA 水平以及 SOD 活
性可以评价神经损伤的程度。Hoechst 33258 常用
于检测细胞核完整性。正常的细胞核在染料作用下
颜色暗淡蓝色; 在细胞损伤的情况下，细胞核形态
改变甚至皱缩破裂，表现出核质聚集，并呈现典型
的椭圆状的颜色透亮凋亡核小体。Hoechst 33258
染色可以通过蓝色荧光的强弱以及核小体的大小、
形态反映细胞的完整性以及凋亡损伤情况。
实验结果显示，在 H2O2 诱导 PC12 细胞 12 h，
细胞皱缩明显，碎片增多，Hoechst 33258 核染显
示，细胞损伤严重，透亮的核小体大量出现，MTT
结果显示细胞活性降低明显，SOD 活性降低，
MDA水平升高，表明 H2O2 诱导 PC12 细胞损伤的
细胞氧化应激模型成功。中、高剂量 TFC 预保护
能明显减少细胞损伤中核小体的出现，减少细胞凋
亡的出现并使细胞恢复正常的形态; MTT 结果显
示，TFC 具有明显保护 H2O2 引起的细胞损伤;
SOD以及 MDA结果表明 TFC 能降低 H2O2 对神经
元造成的氧化应激的损害，提示 TFC 对神经元的
保护作用与提高 SOD活性，降低 MDA水平有关。
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大蒜素与盐酸小檗碱联用体外抗菌试验
孙 艳， 李 娜， 陆 颖， 余圆圆， 陈 钧*
(江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)
收稿日期: 2015-02-13
作者简介: 孙 艳 ( 1990—) ，女，硕士生，研究方向为天然产物活性成分筛选及应用。Tel: 18261931810，E-mail: yansun901020@
126． com
* 通信作者: 陈 钧 ( 1947—) ，男，博士生导师，教授，研究方向为生物活性成分和新药开发以及生物资源有效成分的分离与应用。
Tel: 13812461762，E-mail: shchen@ ujs． edu． cn
摘要: 目的 研究大蒜素联合盐酸小檗碱对临床常见菌及耐药菌的抗菌效果。方法 采用微量肉汤稀释法测定供试药
物对 4 个常见菌，2 个标准菌，和 2 个耐药菌的最小抑菌浓度 ( MIC) ，微量棋盘稀释法和时间—杀菌曲线法评价两药
对各试验菌株的联合作用。结果 当两药单独应用时，其 MIC值范围分别为大蒜素 156. 25 ( 敏感株) ～ 1250 ( 耐药
株) μg /mL，盐酸小檗碱 78. 125 ( 敏感株) ～ 312. 5 ( 耐药株) μg /mL。当两药联合应用时，部分抑菌浓度指数 ( FI-
CI) 值为 0. 75 ～ 1，为相加作用。从 24 h时间—杀菌曲线可以发现，当两药单独应用时，即使在 4 × MIC 下，也未能
显示杀菌效应，而联用时在相对较低质量浓度下显示出杀菌作用; 还显示出在低于 MIC 下具有弱协同 ( 敏感株) 或
者相加作用 ( 耐药株) 。结论 大蒜素和盐酸小檗碱联合应用，具有良好的抗菌作用。
关键词: 大蒜素; 盐酸小檗碱; 抗菌; 协同作用
中图分类号: R966 文献标志码: A 文章编号: 1001-1528( 2015) 12-2589-07
doi: 10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 12. 004
In vitro antibacterial activity of allicin in combination with berberine hydrochlo-
ride
SUN Yan， LI Na， LU Ying， YU Yuan-yuan， CHEN Jun*
( School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)
ABSTRACT: AIM To study the in vitro activity of allicin ( dially trisulfide ) in combination with berberine
hydrochloride to common and drug-resistant bacteria． METHODS The broth dilution method was used to test
individual minimal inhibitory concentrations ( MIC) of four common，two control and two resistent bacteria． The
checkerboard dilution and time-kill curve tests were performed on antibacterial synergy effects． RESULTS The
MIC of allicin were in the ranges of 156. 25 ( sensitive bacteria) and ～ 1250 μg /mL ( drug-resistant bacteria) ;
the MIC of berberine hydrochloride were in the ranges of 78. 125 ( sensitive bacteria) and ～ 312. 5 μg /mL ( drug-
resistant bacteria) ． The fractional inhibitory concentration index ( FICI) of allicin plus berberine hydrochloride
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