全 文 ：文章编号:1001-4829(2002)01-0116-04
　　收稿日期:2001-09-17
　　基金项目:国家自然科学基金重点项目(3920040)
作者简介:乙引(1967-),男 ,重庆合川人 ,博士 ,副教授 ,现主要
从事植物生理和生物化学的教学与研究工作。
高粱根质膜的纯化和膜蛋白的提取
乙　引1 ,汤章城2 ,倪晋山2 ,洪　鲲1
(1.贵州师范大学生物科学技术系 ,贵州贵阳　550001;2.中国科学院上海植物生理研究所 ,上海　200032)
摘　要:利用高粱根作为实验材料 ,用不连续蔗糖密度梯度和 Dex tran T -500/PEG-3350两相法
探讨了纯化质膜的过程 ,以及去垢剂对 K+运输蛋白的增溶效率。结果表明 ,由 6 mL 40%(W/
W),4 mL 34%(W/W)和 4mL 22%(W/W)蔗糖组成的不连续蔗糖梯度 ,经80 000×g 离心3 h后 ,
在34%～ 40%界面处富含质膜 。在质膜 K+运输蛋白的增溶效果上 , 6.5 mmol/L CHAPS最为理
想。
关键词:质膜;膜蛋白;纯化;提取
中图分类号:S514　　　文献标识码:A
Purif ication of sorghum root plasma membrane and extraction of
plasma membrane protein
YI Yin1 , TANG Zhang-cheng2 , NI Jin-shan2 ,HONG Kun1
(1.Department of Biological S cience and Technology ,Guizhou Normal University , Guiyang 550001 , China;2.Shanghai Inst itute of Plant
Physiology ,Academia Sinica , Shanghai 200032 , China)
Abstract:This paper described the procedure of membrane puri fication by step sucrose gradient and Dext ran T-500/ PEG-3350 ,and the so-
lut ion eff iciency of K + t ransport protein.The results show ed that plasma membrane was mainly dist ributed betw een 34% t o 40% sucrose
solution , af ter centrifuged at 80 , 000×g for 3 h.In addi tion , 6.5mmol/ L CHAPS was the best concent ration for the solution of K + t rans-
port protein.
Key words:plasma membrane;PM protein;pu rif icat ion;extraction
　　质膜蛋白在细胞代谢过程中起着非常重要的作
用。它既可以作为结构蛋白构建细胞膜骨架 ,而且
还参与了细胞的物质运输和信号传递[ 1] 。在对质
膜蛋白结构和功能关系的研究中 ,往往需要提取质
膜 ,增溶目的蛋白 。但是 ,对如何提高质膜纯度 ,增
加膜蛋白的溶解效率的研究很少。本研究利用高粱
根作为实验材料 ,试图通过对 K+运输蛋白的增溶
效果 ,找出最佳的提取和纯化条件 。
1　材料与方法
1.1　材料
高粱(Sorghum vargula Jinza No.5)种子经
0.1%HgCI2灭菌 10min ,流水中吸胀 4 h , 25 ℃暗萌
发 24 h 后 ,转入人工气候室(温度 28 ℃,光暗周期
15 h/9 h ,光照强度 18 000 Lux ,相对湿度 70%),用
Hoagland营养液培养至 2.5叶期 ,然后以-0.5M pa
PEG(聚乙二醇)处理 10 h。
1.2　质膜的分离和纯化
质腊分离参照 Dupont等(1988)的方法[ 2] 。所
有操作过程均在 0 ～ 4 ℃下进行。取高粱根 ,称重 ,
加入 2倍(W/V)体积预冷的研磨介质(缓冲液 I),
介质含 0.25mol/L 蔗糖 ,5mmol/L 乙二醇双乙胺醚
-N , N′-四乙酸(EG TA), 1 mmol/L 二硫苏糖醇
(DTT), 0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PM SF),0.5%
小牛血清蛋白(BSA),1.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)
和 25 mmol/L Tris-Mes pH 7.6 ,抽气 5 min ,使研磨
介质渗入 。经研磨 ,四层纱布过滤 ,1000×g离心 20
min ,除去未破碎细胞。上清液经 10 000×g 离心 20
116
西　南　农　业　学　报
Sou thw est China Journal of Agricultural S ciences
　　　　　　　　　　　　　　2002年 15卷 1期
Vol.15　　No.1
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2002.01.029
min ,再 80 000×g 45min ,沉淀悬浮于含 0.25mol/L
蔗糖 , 1 mmol/L DT T , 0.2%BSA , 25 mmol/L Tris-
Mes pH 7.2 的缓冲液 Ⅱ中 ,置于不连续蔗糖梯度 ,
梯度分别由 6mL 40%(w /w),4 mL 34%(W/W)和
4mL 22%(W/W)蔗糖组成 ,经 80 000×g 离心 3 h 。
取层间部分 ,用悬浮液Ⅱ稀释 8倍 ,100 000×g 离心
35min ,沉淀用悬浮液悬浮Ⅱ ,液氮下保存。
1.3　膜蛋白的增溶
将两相法得到的质膜悬浮于含有 125 mmol/L
NaCI , 0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA), 0.2
mmol/L DTT , 100mmol/ L 蔗糖 , 1mmol/ L 巯基乙
醇以及 20 mmol/L Tris-HCI(pH7.6)的缓冲液中 ,
使蛋白质含量为 2.5mg/mL ,加入 3-[(3-厚膜丙
基)二甲基氨] -1 -磺酸丙烷(CHAPS), 此时
CHAPS:蛋白质=2∶1 ,冰浴中搅拌 2 h 后 ,提取液在
4 ℃下 100 000×g 离心 45 min ,弃沉淀 ,上清液含溶
解的膜蛋白。
1.4　细胞膜标志酶的测定
H+-ATPase 活力参照 Hodges 等(1972)的方
法测定[ 3] 。反应液中含 3 mmol/L M gSO4 , 3mmol/
L ATP ,30mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)和 2-
(N -吗啉)-乙基磺酸(Mes)组成的缓冲液
(pH6.5),0.05%(V/V)Triton X-100和 10 ～ 30μg
膜蛋白 。以 ATP 的加入启动反应。37 ℃保温 15
min后 ,立即转入冰浴 ,用 50μL 20%三氯醋酸终止
反应 ,测定反应系统中无机磷的释放量。K+激活
H+-ATPase的活力等于 50mmol/ L KCI存在时的
活力与无 KCI 时活力之差 。质膜 、液泡膜 、高尔基
体膜 、内质网膜和线粒体膜标志酶依次为钒酸盐 、硝
酸盐抑制的 K+激活 H+-A TPase , 潜在 IDPase ,
NADH-细胞色素C 还原酶和细胞色素 C 氧化酶。
1.5　K+-ATPase的测定
0.5mL 反应系统中含有 0.25 mol/L 蔗糖 , 25
mmol/L N-2-羟甲基-哌嗪-N′-2-乙基磺酸
(Hepes)-T ris(pH 7.5), 1mmol/L NaN3 ,50mmol/
L NaNO3 , 0.1 mmol/L 钼酸胺 , 3 mmol/L Na2 -
ATP ,0.1mmol/ L EDTA , 0.05% Tri ton X-100 , 3
mmol/L KCI ,20 ～ 50μg 膜蛋白。加入A TP 启动反
应 ,30℃保温 15min ,终止反应后测定无机磷的释放
表 1　高粱根质膜标志酶活性在不连续蔗糖梯度各界面上
的分布
Table 1　Relative distribution of the activities of membrane marker
enzymes in three fractions obtained from a step sucrose gradient
标志酶
Marker enzyme
酶活性 Enzyme activity(μmol/mg·h)
样品/ 22% 22%～ 34% 34%～ 40%
ATP 酶ATPase 25.61(100) 7.22(100) 27.45(100)
+0.1mmol/ L Na3VO4 24.48(95.6) 4.38(60.7) 9.33(34.0)
+50mmol/ L NaNO 3 3.29(12.8) 1.19(16.5) 27.00(98.5)
细胞色素 C氧化酶
Cyt C oxidase
2.32 0.88 0.36
还原型辅酶 I-细胞色
素 C还原酶 NADH-
Cyt C reductase
18.39 8.10 0.26
潜在肌苷二磷酸酶
IDPase
16.34 14.83 1.54
量 。以钒酸钠抑制的酶活为 K+-ATP酶的酶活。
2　结　果
2.1　高粱根质膜的纯化
经蔗糖梯度离心后 ,收集各个蔗糖浓度界面的
细胞膜 ,并测定其膜标志酶的分布(表 1), 结果显
示 ,相对于其它两个组份而言 ,34%～ 40%界面组份
中钒酸钠抑制的 ATPase 活力较高 ,而硝酸钠抑制
的 ATPase 活力较低 。事实上 ,它们分别抑制 66%
和 1.5%K+激活ATP 酶的活力。同时 ,细胞色素 C
还原酶 、细胞色素 C 氧化酶以及潜在 IDPase的活力
都非常低 ,所以可以肯定这个部分富含质膜。另外 ,
还测定了各步骤的纯化效果和得率(表 2)。结果显
示 ,用蔗糖梯度离心方法 ,可将质膜纯化 29倍。
用两相法制备高纯度高梁根质膜的最佳浓度见
图 1。在 5.8%～ 6.6%, PEG-3350和葡聚糖 T -
50显著影响膜的分离效果 。经 5.8%PEG/5.8%葡
聚糖分离后 ,大多数线粒体膜 、液泡膜和质膜均分布
在上相 ,此时质膜无法与其它膜分离 。当多聚物浓
度增加到 6.4%时 ,上相中的液泡膜和线粒体膜逐
渐转移并富集于下相 ,此时质膜虽也有少许转入下
相 ,但基本上仍保留于上相 ,所以质膜得率和纯度都
很高 。当多聚物浓度继续增加到 6.6%时 ,上相质
膜含量降到其最大值(5.8%)时的 82%,而其它膜
的浓度在两相间变化不大 ,这样虽然上相质膜纯度
提高了一点 ,但同时也造成质膜得率大幅度减少 。
表 2　高粱根细胞质膜的纯化过程
Table 2　Procedure of plasma membrane purification from sorghum root
纯化步骤 蛋白含量(mg) ATP 酶活性(μmol/mg·h) 酶比活(μmol/mg·h) 纯度(f old)
S tep Protein ATPase activity Specif ic activity Pu rif icat ion
匀浆液 Homogenizat ion 80.28 114.93 0.96
粗提质膜C rude PM 12.24 77.07 9.39 9.78
纯化质膜Purified PM 0.73 20.51 28.10 29.27
1171期　　　　　　　　　　　　　　　　　　乙　引等:高粱根质膜的纯化和膜蛋白的提取
图 1　两相法对高粱根质膜的纯化
Fig.1　Purification of plasma membrane from sorghum roots with
two-phase method
图 2　CHAPS 对高粱根质膜微囊泡的溶解
Fig.2　The solubilization of sorghum root microsomes by CHAPS
2.2　高粱根质膜膜蛋白的溶解
CHAPS 、DOC 和 Tri ton X-100依次为两性离
子 、阴离子和非离子型去垢剂 ,它们对高粱质膜 K+
运输蛋白的增溶效果见表 1。结果表明 , DOC 增溶
下来的质膜蛋白较其它两种去垢剂多 ,为 81%,但
其ATP 酶活力很低;Triton X-100能溶解 68%的
质膜蛋白 ,同时也得到 39%的ATP 酶活力;CHAPS
能增溶 50%的质膜蛋白 ,但可得到 53%钒酸钠敏感
的ATP 酶活力。由此看出 ,虽然 CHAPS 增溶下来
的总蛋白含量最少 ,但是钒酸钠敏感 ATP 酶活力最
高 ,也就是说它较其它两种去垢剂更能保持膜蛋白
的活性 ,或更有效地增溶对钒酸钠敏感的ATP 酶。
CHAPS 对质膜ATPase 的增溶效果见图 2。结
果表明 , CHAPS 最大增溶效果发生在 6.5 mmol/L
左右 , 这是 CHAPS 的 cmc 值 , 超过此值 , 多余的
CHAPS 将相互聚集形成微团 ,对蛋白增溶无影响 。
此外 ,图 2还表明用去垢剂 CHAPS 很难从高粱根
质膜中增溶下 70%以上钒酸钠敏感的 ATP 酶活
力。
表 3　3 种去垢剂对高粱根质膜蛋白的增溶效果和 ATP 酶
活力的影响
Table 3　Effects of three detergents on the solubil ization of plas-
ma membrane and on ATPase activi ty from sorghum roots
AT Pase
增溶蛋白(%)
Protein solubi lized
AT P酶活性(%)
ATPase activity
对照 Cont rol 0 100
脱氧胆酸钠 Deoxycholate 81 25
曲拉通 X-100Triton X-100 68 39
3-[(3-厚膜丙基)二甲基氨]
-1-磺酸丙烷 CHAPS 50 53
3　讨　论
高粱根匀浆液经差速离心后只能得到粗提质
膜 ,这里面还污染了各种生物膜 ,它们可能对质膜囊
泡 ATPase和运输属性的研究造成影响 ,因此 ,必须
进一步纯化 。
高度纯化的质膜是进行质膜蛋白研究的基础。
制备纯化质膜的方法很多 ,在植物材料中以蔗糖密
度梯度 、水溶性两相法和自由流电泳等方法为主。
本研究选用蔗糖密度梯度和两相法进行高粱根质膜
的纯化。与差速离心结果相比 ,不连续蔗糖梯度将
对高粱根质膜的纯度比提高了 1.99 倍。两相法分
离质膜所依据的原理是膜表面性质的不同 ,它可以
制备无 ER 、高尔基体膜和线粒体膜污染的富含质
膜的成分 ,其有效性在原位质膜囊泡的制备中已得
到证实[ 4] 。经蔗糖密度梯度和两相法相继纯化后 ,
可以得到很高纯度的质膜 ,因为此时制备液中除仍
保留质膜 ATP 酶活力外 ,几乎检测不到其它细胞膜
标志酶的活力(结果未列入)。因此 ,是制备质膜的
理想方法。
运输蛋白具有疏水性 ,只有将保持其原有构象
和功能的蛋白从膜上洗脱下来 ,才能进一步进行纯
化 。跨膜运输蛋白只能由破坏疏水作用或破坏双层
的试剂才能溶解下来 ,其中最有用的就是去垢剂。
过去 ,大多数实验均采用非离子型去垢剂(如 T riton
X-100)和胆酸盐增溶蛋白[ 5] 。T riton 类型的非离
子型去垢剂虽能保持电中性和酶活性 ,但不能防止
蛋白之间的聚合;胆酸盐能维持酶活和分散蛋白 ,但
不能保持蛋白电中性。然而 ,CHAPS在增加膜蛋白
溶解和防止其聚合的同时 ,并不会使酶的活力丧失。
作为膜溶解的去垢剂 ,CHAPS 最重要的优点在于它
不影响根据电荷性质分离蛋白的技术的应用 ,因为
它不干扰 pH梯度的形成和稳定 ,在 pH 2 ～ 12时不
带电荷 ,无电导性和电泳动性 ,不与离子交换树脂连
118 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15卷
接[ 6] 。虽然目前还不能认为在大多数植物质膜蛋
白增溶过程中 CHAPS 均为最佳的选择 ,但本实验
结果表明至少在增溶高粱根钒酸钠敏感的 ATP 酶
方面它是很好的去垢剂。本实验用两性去垢剂
CHAPS 溶解质膜上的运输蛋白 ,它具有胆酸盐的疏
水基团和磺酰胆碱的极性基团 ,所以它综合了这两
种类型去垢剂的优点 ,并在水溶液中呈两性离子状
态。它在蛋白吸收波长 280 nm 处吸收值很小(结果
未列入),因此可用 280 nm 紫外线直接检测纯化过
程中洗脱下来的蛋白质 ,使 CHAPS 在膜蛋白纯化
过程中更为理想 。
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(责任编辑　高红卫)
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