全 文 ：第 44 卷第 11 期
2014 年 11 月
日 用 化 学 工 业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 44 No． 11
Nov． 2014
收稿日期:2014 － 06 － 13;修回日期:2014 － 11 － 04
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(JUSＲP111A03)
作者简介:刘 学(1983 －)，男，江苏人，讲师，博士，电话:13382888538，E － mail:liuxue100200@ hotmail． com。
浊点萃取法提取黑种草子粕抗氧化剂的工艺研究
刘 学，曹莹粲，韩王康，杨 成，曹光群
(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)
摘要:采用浊点萃取法提取黑种草子粕(NGSM)中抗氧化活性成分，以对 DPPH 自由基清除率为考察指标，采用单因素
试验和正交试验考察在浊点萃取过程中各关键因素对清除率的影响，确定较佳提取条件为:表面活性剂质量浓度 40 g·
L －1，液固比 35∶ 1，离子强度 0. 513 mol·L －1，平衡时间 50 min。提取物质量浓度为 40 g·L －1时，对 DPPH自由基的平均
清除率为 86. 87%，且呈剂量效应关系。
关键词:抗氧化剂;浊点萃取;黑种草子
中图分类号:TQ658 文献标识码:A 文章编号:1001 － 1803(2014)11 － 0624 － 04
DOI:10． 13218 / j． cnki． csdc． 2014． 11． 139
Cloud point extraction technology of antioxidizing components from
Nigella glandulifera seed meal
LIU Xue，CAO Ying － can，HAN Wang － kang，YANG Cheng，CAO Guang － qun
(School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122，China)
Abstract:Cloud point extraction (CPE)was applied for the extraction of antioxidizing components from
Nigella glandulifera seed meal (NGSM)． The extraction technology was optimized by single factor experiment
and orthogonally designed experiment with scavenging ratio of free radical of 1，1 － diphenyl － 2 － trinitro －
phenyl hydrazine (DPPH) as indicator for antioxidizing activity of the extract． The optimum extraction
conditions were obtained as follows:surfactant mass concentration，40 g·L －1;liquid － solid ratio，35 ∶ 1;ion
strength，0. 513 mol·L －1;and equilibration time，50 min． Under such conditions，the average DPPH free
radical scavenging ratio achieves 86. 87%，and the efficacy is related to its dosage．
Key words:antioxidizing components;cloud point extraction;Nigella glandulifera
黑种草子为毛茛科植物腺毛黑种草(Nigella
glandulifera Freyn)的干燥成熟种子，主要分布于我国
新疆和云南，作为维吾尔族和傣族习用药材沿用数千
年，并于 1977 年始被收入《中华人民共和国药典》各
版一部中，具有补肾健脑，通经，利尿等功效［1］。目前
对于黑种草子的利用主要是提取其油脂用于食品和保
健品等相关领域，残余的籽粕基本被当作垃圾处理，国
内外对黑种草属种子化学成分和药理研究表明，除了
含有不饱和脂肪酸外，种子中含有较多的抗氧化、平
喘、抗炎、抗癌等活性成分［2 － 3］。因此，研究一种简单、
高效、经济、环保的方法从黑种草子粕(NGSM)中提取
活性物质，将有利于扩大黑种草子的资源利用及开发
新药源。
浊点萃取法(CPE)是一种以表面活性剂水溶液代
替有机溶剂作为萃取剂的液 －液萃取新技术，它利用
表面活性剂的增溶和浊点现象而实现高效提取［4］。
CPE由于操作步骤简单、不使用有机溶剂、表面活性剂
可回收、活性成分在提取过程中不易变性且具有易于
放大，对环境友好的特点［5 － 6］广泛应用于金属离子、多
环芳烃、大分子类物质的富集和分析领域［7 － 8］，但其在
天然植物活性成分提取方面的研究比较少。在提取过
程中，如果选择水为主要提取溶剂，同时利用 CPE 的
特性，将有利于开发更具生物活性的产品。笔者采用
CPE对黑种草子粕中抗氧化活性成分进行提取，考察
不同提取条件对 DPPH 自由基清除率的影响，以期为
CPE在中药活性成分提取分离中的应用提供参考。
·426·
第 11 期 刘 学，等:浊点萃取法提取黑种草子粕抗氧化剂的工艺研究 开发与应用
1 实验部分
1. 1 主要试剂与仪器
黑种草子粕(NGSM)，新疆乌鲁木齐友谊香料厂;
氯化钠和无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公
司;Triton X － 114 和 1，1 －二苯基 － 2 － 三硝基苯肼
(DPPH)，阿拉丁试剂(上海)有限公司;实验用水为去
离子水。TG1650 － WS 离心机，上海卢湘仪离心机仪
器有限公司;KH －100B超声波清洗仪，昆山禾创超声
仪器有限公司;YLJYE － 100 数显式电热恒温水浴锅，
上海跃进医疗器械厂;TU －1901 双光束紫外可见分光
光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;DFY － 300
摇摆式高速万能粉粹机，温岭市林大机械有限公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 NGSM提取物的制取
精密称取 NGSM 1. 0 g于 50 mL锥形瓶中，按比例
加入一定质量浓度的 Triton X － 114 水溶液，混合均
匀，超声提取 30 min后以 8 000 r·min －1离心 30 min，
将上清液小心转移至 50 mL锥形瓶中，加入适量 NaCl
后混合均匀，置于 45 ℃水浴中恒温平衡一定时间，当
溶液清晰分为水相和表面活性剂富集相后，去除水相
后往富集相中加入 15 mL无水乙醇，充分振荡摇匀，以
6 000 r·min －1离心 5 min，将上清液转移至容量瓶中，
以无水乙醇定容后备用。
1. 2. 2 反应动力学曲线测定
将 1. 2. 1 所得的 NGSM提取物用无水乙醇配制成
质量浓度分别为 50，40，30，20 和 10 g·L －1(相当于
NGSM的质量)的样品溶液。分别精密吸取 1 mL各质
量浓度的样品溶液与 4 mL DPPH溶液(0. 125 mmol·
L －1)混匀，在 517 nm处每隔 10 s测定一次吸光度，反
应时间 100 min，绘制吸光度 －反应时间关系曲线，确
定最佳样品质量浓度和反应时间。
1. 2. 3 DPPH自由基清除率测定［9］
以无水乙醇为溶剂配制 0. 125 mmol· L －1 的
DPPH溶液备用，将 1. 2. 1 所得 NGSM提取物以无水乙
醇稀释成质量浓度 40 g·L －1的测定溶液备用。精密
吸取 1 mL NGSM提取物测定溶液与 4 mL DPPH溶液
混匀，在室温黑暗处静置 60 min 后，在 517 nm处测定
吸光度(A1);实验步骤同上，分别测定以 4 mL 无水乙
醇代替 4 mL DPPH溶液的吸光度(A2)和以 1 mL无水
乙醇代替 1 mL NGSM 提取物溶液的吸光度(A0)。自
由基清除率(Y)计算公式为:
Y =［1 －(A1 － A2)/A0］× 100%
2 结果与讨论
2. 1 清除自由基的反应动力学
图 1 为不同质量浓度的提取物溶液与 DPPH自由
基反应，反应体系吸光度随时间变化的动力学曲线。
由图 1 可知，提取物溶液质量浓度较高时反应速率较
快。质量浓度为 50 g·L －1时，反应体系的吸光度在最
初的 5 min内下降较快，30 min后反应达到平衡，平衡
后溶液呈无色，DPPH 自由基基本被清除干净。提取
物质量浓度在 40 g·L －1时，与 DPPH自由基的反应在
60 min基本达到平衡。质量浓度较低(10 ～ 30 g·L －1)
时，反应速率缓慢，反应达平衡所需时间较长。
图 1 不同质量浓度提取物溶液清除 DPPH自由基的
动力学曲线
Fig. 1 Kinetic graph of DPPH free radical scavenging by NGSM
extract of separate mass concentrations
2. 2 提取工艺条件单因素筛选
2. 2. 1 平衡时间
按照 1. 2. 1 方法，NGSM 1. 0 g，Triton X － 114 质量
浓度为 40 g·L －1，液固比为 20∶ 1(表面活性剂水溶液
体积与 NGSM 质量比，mL ∶ g)，NaCl 离子强度为
0. 513 mol·L －1，分别测定不同平衡时间所得提取物
对 DPPH自由基的清除率，实验结果见图 2。由图 2
可知，平衡时间小于 30 min 时，提取物溶液对 DPPH
自由基的清除率较低，当平衡时间在 30 ～ 50 min 时，
清除率显著提高，在 50 ～ 60 min 时，清除率的增加略
变缓。在浊点萃取过程中，平衡温度一般会高于表面
活性剂的浊点 10 ～ 20 ℃，并保持一定时间促使以水合
形态的表面活性剂氢键断裂，以提高萃取率［10］。因
此，延长平衡时间对清除率的提高具有一定的影响。
由于实验选用的 Triton X － 114 的密度为 1. 058 g·
cm －3，在提取过程中表面活性剂富集相与水相密度相
近，使浊点分相至达到平衡的过程所需要时间较长。
·526·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 44 卷
考虑到在加入适当 NaCl调节离子强度后，可使浊点萃
取达相平衡的时间缩短，故选择平衡时间为 50 min。
图 2 平衡时间对 DPPH自由基清除率的影响
Fig. 2 Effect of equilibrium time on DPPH free radical
scavenging ratio
2. 2. 2 液固比
按 1. 2. 1 方法制取 NGSM 提取物溶液，平衡时间
为 50 min，其他条件同上，分别测定不同液固比所得提
取物对 DPPH自由基的清除率，实验结果见图 3。由
图 3 可知，液固比在 10 ∶ 1 ～ 25 ∶ 1时提取物溶液对
DPPH自由基清除率提高较快，这是由于随着液固比的
增大，提取溶剂量增多，抗氧化活性成分提取率增高所
致。当液固比大于 25∶ 1后，清除率不再提高且略有下
降，故选择液固比为 25∶ 1。
图 3 液固比对 DPPH自由基清除率的影响
Fig. 3 Effect of liquid － solid ratio on DPPH free radical
scavenging ratio
2. 2. 3 离子强度
按 1. 2. 1 方法制取 NGSM 提取物溶液，平衡时间
为 50 min，液固比为 25∶ 1，其他条件同上，分别测定不
同离子强度下所得提取物对 DPPH 自由基的清除率，
结果见图 4。由图 4 可知，随着 NaCl 离子强度的逐步
升高，清除率在离子强度为 0. 770 mol·L －1时达到最
高，继续增大离子强度，清除率降低，故选择 NaCl离子
强度为 0. 770 mol·L －1。
图 4 离子强度对 DPPH自由基清除率的影响
Fig. 4 Effect of ion strength on DPPH free radical scavenging ratio
2. 2. 4 Triton X －114 质量浓度
按 1. 2. 1 方法制取 NGSM 提取物溶液，平衡时间
为 50 min，液 固 比 为 25 ∶ 1，NaCl 离 子 强 度 为
0. 770 mol·L －1，其他条件同上，分别测定不同质量浓
度的 Triton X － 114溶液所得提取物对 DPPH自由基的
清除率，结果如图 5 所示。由图 5 可以看出，当 Triton
X － 114 质量浓度在 25 ～ 35 g·L －1内，对 DPPH 自由
基清除率随 Triton X － 114质量浓度的增加而逐渐升
高，35 g·L －1时达到最高，因此选择 Triton X － 114 质
量浓度为 35 g·L －1。
图 5 Triton X － 114 质量浓度对 DPPH自由基
清除率的影响
Fig. 5 Effect of Triton X － 114 mass concentration on DPPH
free radical scavenging ratio
2. 3 正交试验优选提取条件
在单因素分析的基础上，选取平衡时间(A，
t /min)、液固比(B，mL ∶ g)、离子强度(C，I /(mol·
L －1))和 Triton X － 114 质量浓度(D，ρ /(g·L －1))为
考察因素，每个因素选 3 个水平，以 DPPH自由基的清
除率为考察指标，采用 L9(3
4)正交表进行试验，各因
素水平、试验数据及分析结果见表 1 和表 2。
·626·
第 11 期 刘 学，等:浊点萃取法提取黑种草子粕抗氧化剂的工艺研究 开发与应用
表 1 正交试验因素水平表
Tab. 1 Factors and levels of orthogonally designed experiment
水平
A
t /min
B
液固比
C
I /(mol·L －1)
D
ρ /(g·L －1)
1 30 25∶ 1 0. 513 35
2 40 30∶ 1 0. 770 40
3 50 35∶ 1 1. 027 45
表 2 正交试验结果与分析
Tab. 2 Ｒesults of orthogonally designed experiment
序号 A B C D Y /%
1 1 1 1 1 72. 62
2 1 2 2 2 62. 55
3 1 3 3 3 68. 65
4 2 1 2 3 52. 11
5 2 2 3 1 75. 16
6 2 3 1 2 87. 19
7 3 1 3 2 84. 10
8 3 2 1 3 81. 55
9 3 3 2 1 81. 35
k1 67. 94 69. 61 80. 45 76. 38
k2 71. 48 73. 08 65. 34 77. 95
k3 82. 33 79. 06 75. 97 67. 44
Ｒ 14. 39 9. 45 15. 12 10. 51
由表 2 中 Ｒ 值可知，讨论的 4 个因素对清除率的
影响大小顺序为:C ＞ A ＞ D ＞ B。由 k 值可知，最优组
合为 A3B3C1D2，即平衡时间为 50 min，液固比为 35∶ 1，
离子强度为 0. 513 mol·L －1，Triton X － 114 质量浓度
为 40 g·L －1。
按上述确定的优化反应条件进行 3 次平行实验，
所得提取物质量浓度为 40 g·L －1，对 DPPH自由基清
除率分别为 84. 63%，88. 67%和 87. 30%，平均值为
86. 87%，ＲSD为 2. 3%，表明此提取工艺较为适宜。
2. 4 清除 DPPH自由基能力
将所得提取物分别以去离子水依次配制成一系列
不同质量浓度的溶液，检测对 DPPH 自由基的清除能
力，计算提取物的半抑制浓度(IC50，相当于 NGSM 的
质量)，实验结果见图 6。由图 6 可知，提取物对 DPPH
自由基的清除率随着溶液质量浓度的增加而提高，其
IC50为 11. 95 g·L
－1。但经采用硫氰酸钴法［11］对所得
NGSM提取物中表面活性剂 Triton X － 114 含量分析
表明，其中 Triton X － 114 的质量分数为 88. 7%，即提
取物中含有大量 Triton X － 114，经按抗氧化活性
100%折算，可得到 IC50为 1. 22 g·L
－1。由此说明采
用 CPE法得到的 NGSM 提取物中含有抗氧化活性成
分，对 DPPH自由基的清除能力较强。对其化学成分
初步分析结果显示其活性成分主要为皂苷、黄酮、乙醇
可溶性蛋白质、多糖等。
图 6 NGSM提取物对 DPPH自由基的清除能力
Fig. 6 DPPH free radical scavenging activity of NGSM extract
3 结论
1)通过单因素试验和正交试验法，确定了抗氧化
活性物质的优化提取工艺条件:平衡时间为 50 min，液
固比为 35∶ 1，离子强度为 0. 513 mol·L －1，表面活性
剂溶液质量浓度为 40 g·L －1。
2)提取物质量浓度与对 DPPH自由基的清除能力
呈剂量效应关系，质量浓度为 40 g·L －1时，对 DPPH
自由基的平均清除率为 86. 87%。
参考文献:
［1］中华人民共和国卫生部药典委员会． 中华人民共和国药典:一部
［M］．北京:化学工业出版社，2010:324 － 325．
［2］BUTT M S，SULTAN M T． Nigella sativa:Ｒeduces the risk of various
maladies［J］． Critical Ｒeviews in Food Science and Nutrition，2010，
50(7):654 － 665．
［3］ＲASTOGI L，FEＲOZ S，PANDEY B N，et al． Protection against radia-
tion － induced oxidative damage by an ethanolic extract of Nigella
sativa L［J］． International Journal of Ｒadiation Biology，2010，86(9) :
719 － 731．
［4］FANG Q，WEUNG H W，LEUNG H W，et al． Micelle － mediated
extraction and preconcentration of ginsenosides from Chinese herbal
medicine［J］． Journal of Chromatography A，2000，904(1) :47 － 55．
［5］张慧，许晓菁，杨一青，等．浊点萃取技术及其应用研究进展［J］．
化工进展，2012(S1):441 － 447．
［6］陈健，郭瑞雪．超声 －浊点萃取丹参有效成分的初步研究［J］． 食
品工业科技，2009，30(11):200 － 203．
［7］SEＲENJEH F N，HASHEMI P，SAFDAＲIAN M，et al． Semi － automa-
ted cloud point extraction with cold column trapping of surfactant － rich
phase for phenazopyridine determination in human serum［J］． Journal
of the Iranian Chemical Society，2014，11(3) :733 － 739．
［8］XIA Q H，JIAO Y，XIONG W，et al． Development of a precolumn deri-
vatization procedure prior to ultrasound － assisted cloud point extrac-
tion for sensitive determination of fluoroquinolones in eggs by high －
performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］．
Food Analytical Methods，2014，7(5) :1130 － 1138．
［9］江珊，孙培东．黄香楝树皮提取物的多酚含量及抗氧化研究［J］．
化学研究与应用，2014，26(4):537 － 540．
［10］刘超，罗晶，马辉，等． 浊点萃取法提取贯叶连翘总黄酮的研究
［J］．西北药学杂志，2012，27(4):296 － 298．
［11］QIN W，HUANG Y，DING Y W，et al． Surfactant distribution in the
clouding of TX114 ［J］． Chinese Journal of Chemical Engineering，
2008，16(5) :722 － 725．
·726·