全 文 ：收稿日期:2004-11-11原稿;2004-11-29修改稿
基金项目:上海市科委科技攻关项目“灰树花的抗癌活性蛋白聚糖生化制品的研制”(编号 013912048)的部分内容
作者简介:周昌艳(1969-),女, 1991年毕业于西南农业大学食品学院, 硕士 ,副研究员 , 主要从事药用菌研究与开发 ,
发表主笔论文 6篇 ,获市科技进步三等奖一项。
＊本文通讯作者
　食用菌学报　2004.11(4):13 ～ 17
　Acta Edulis Fungi
文章编号:1005-9873(2004)04-0013-05
不同来源灰树花多糖免疫活性初探
周昌艳1 , 2 , 唐庆九1 , 2 , 贾　薇1 , 杨　焱1 , 张劲松1 , 2 , 樊　华2＊
(1 上海农业科学院食用菌研究所 ,上海 201106;
2 Institut fǜ r Molekularbiolo gie und Biochemie, Freie Universitä t , Berlin , Germany)
摘　要:采用体外免疫细胞培养法 , 比较了用不同方法制备的灰树花子实体和菌丝体多糖的
免疫活性。结果显示 ,稀碱提取的灰树花子实体多糖(GFAP)能够显著提高小鼠淋巴细胞的转化
增殖率 ,同时能够显著激活小鼠巨噬细胞 , 并刺激巨嗜细胞产生大量一氧化氮(NO)。稀碱提取的
灰树花菌丝体多糖(GMAP)对小鼠淋巴细胞与巨嗜细胞的作用与 GFAP 相似。热水提取的灰树花
子实体多糖(GFP)与菌丝体多糖(GMP)对小鼠巨噬细胞有一定的激活作用 , 并能促使巨嗜细胞生
成 NO ,但提高小鼠淋巴细胞转化增殖率的作用均不明显。
关键词:灰树花多糖;免疫活性;淋巴细胞;巨噬细胞;一氧化氮
中图分类号:S646.201　　　　文献标识码:A
灰树花(Gri fola frondosa)隶属担子菌亚门 ,层菌纲 ,无隔担子菌亚纲 ,非褶菌目 ,多孔菌
科 ,树花菌属 ,又名贝叶多孔菌 、栗子蘑 、莲花菌 、云蕈 、佛菌和重菇 ,日本俗称舞茸。它是亚热
带至温带森林中的食药两用大型真菌 ,具有独特的芳香味 ,营养丰富 ,口味鲜美 ,并含有丰富的
生物活性物质。自日本学者 Ohno N 等于 1984年报道灰树花多糖的抗肿瘤活性以来[ 1] ,对灰
树花及其生物活性的研究日渐增多;随着我国灰树花种植业的发展 ,对灰树花医疗保健作用的
研究也十分活跃 。
本研究通过体外细胞水平的免疫活性检测 ,对采用不同提取方法 、提自不同来源的灰树花
多糖的免疫活性进行了初步考察 ,为开发应用灰树花的药用价值提供选材依据 。
1　材料与方法
1.1　灰树花多糖来源
灰树花子实体购于浙江庆元食用菌研究所;浙江庆元食用菌研究所提供的灰树花菌株灰
西 ,由上海市农业科学院食用菌研究所药用菌研究室经深层发酵获得菌丝体。
灰树花子实体或菌丝体用热水提取三次 ,过滤 ,合并滤过溶液 ,浓缩 、醇沉 、冷冻干燥 ,分别
得到热水提取的灰树花子实体多糖(GFP)和灰树花菌丝体多糖(GMP)。经水提后的灰树花
子实体或菌丝体采用稀碱再提取两次 ,过滤 ,合并溶液 ,用酸中和至中性 ,经浓缩 、醇沉 、冷冻干
燥 ,分别获得碱提取的灰树花子实体多糖(GFAP)和灰树花菌丝体多糖(GMAP)。
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2004.04.003
1.2　实验动物
Balb/c小鼠购自汉诺威动物研究中心(Zentralinstitut fǜr Versuchstierzucht ,Hannover),由
柏林自由大学医学系动物房饲养。
1.3　试剂
植物血凝素(PHA)、脂多糖(Lipopolysaccharide , LPS)为德国 Calbiochem 公司产品 , RP-
M I1640培养基和 DMEM 培养基为德国 Biochrom KG 公司产品 ,热灭活小牛血清为德国
Kraeber公司产品 ,青霉素(Penicillin)和链霉素(S treptomycin)为德国 Boehringer Mannheim 公
司产品 ,谷氨酰胺(Glutamine)为德国 Merck 公司产品 ,Alamar 蓝试剂(Alamar Blue Assay)为
比利时 Biosource 公司产品 ,其它常用化学试剂均为美国 Sigma 公司产品 。细胞培养前 ,在
RPM I1640培养基中加 10%热灭活小牛血清 、100IU/mL 青霉素 、100μg/mL 链霉素和 0.44g/
L 谷氨酰胺 ,此培养基称为 RPMI1640完全培养基;在 DMEM 培养基中加入 0.44g/ L 谷氨酰
胺 、10%热灭活小牛血清 、100μg/mL 链霉素 、100IU/mL 青霉素和 0.1mM 丙酮酸钠 ,此培养
基称为 DMEM 完全培养基。
1.4　淋巴细胞与巨嗜细胞的制备培养
选择生长 8 ～ 10周 ,重28±1g 左右的小鼠 ,脱臼处死后在无菌条件下取脾 ,分离出脾细胞 ,
调制成浓度为每毫升 2×106个细胞的细胞悬液 ,在 96孔细胞培养板上每孔加入 180μL细胞悬
液 ,再加 20μL各种稀释浓度的待测样品 ,各组均设三复管 ,以等量磷酸缓冲液生理盐液(PBS)
代替样品为空白对照 ,以 6μg/mL 的 PHA 为阳性对照 ,然后在含 5%CO2 的培养箱中 37℃培
养 72h后 ,每孔加入 20μL Alamar 蓝试剂 ,培养 8 ～ 10h后用 ELISA自动读板仪测定570nm和
600nm 处的吸光度 ,然后根据Alamar 蓝试剂公式[ 2]计算各样品对小鼠淋巴细胞的增殖率(指
添加样品后淋巴细胞在培养过程中与空白对照相比细胞数目增加的百分率)。
根据 Stanley ER(1997)[ 3]的方法 ,准备小鼠骨髓诱导的巨噬细胞。
将180μL 每毫升1×105 个细胞的细胞悬浮液加至96孔板中 ,同时加入20μL不同的灰树
花多糖 。各组均设三复管 ,以等量 PBS 代替样品为空白对照 ,以 50μg/mL 的 LPS 为阳性对
照 ,于 37℃和含 5%CO2 条件下培养 3d 后 ,加入 20μL Alamar 蓝试剂 ,再培养 6 ～ 8h 后用
ELISA自动读板仪测定 570 nm 和 600 nm 处的吸光度 ,然后也根据 Alamar 蓝试剂公式计算
各样品对小鼠巨噬细胞的激活率(指与空白对照相比添加样品后巨噬细胞在培养过程中被激
活细胞数目的增长率)。计算公式为:
增殖率或激活率=80856×Aλ570(样品)-117216×Aλ600(样品)80856×Aλ570(空白)-117216×Aλ600(空白)×100%
1.5　巨嗜细胞 NO产生量的测定
将每毫升 1×105 个细胞的巨嗜细胞悬浮液 180μL 和 20μL 的不同样品与对照分别加至
96孔板中 ,培养 48h后 ,吸取培养上清离心 ,于 100μL 的培养上清中加入 50μL 的G riess试剂 ,
显色 10min后 ,于波长 543nm处测定吸光度 值 ,根据标准曲线计算相应的 NO浓度[ 4] 。
2　结果
2.1　各种灰树花多糖对促进小鼠淋巴细胞转化增殖的影响
各种灰树花多糖与小鼠淋巴细胞在体外共同培养 3d 后 ,显微镜观察发现 ,与 GFAP 或
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GMAP 共培养的淋巴细胞数量明显增加 ,与 GFP 或 GMP 共培养的淋巴细胞数量变化不明显。
经Alamar蓝试剂检测 ,稀碱提取的灰树花子实体多糖对体外培养的小鼠淋巴细胞的转化增殖作
用高于其它灰树花多糖;其次是稀碱提取的灰树花菌丝体多糖 ,均在 500μg/mL 时达最高值 ,分
别为242.27%和 205.47%;热水提取的灰树花子实体多糖与菌丝体多糖对体外培养的小鼠淋巴
细胞的转化增殖作用轻微 。碱溶性灰树花多糖对体外培养的小鼠淋巴细胞的促进增殖作用具有
一定的量效关系 ,但当多糖浓度达 1000μg/mL 时 ,促进增殖的作用转弱。结果如图 1所示。
1)　显示值为三次测试结果的平均值±标准偏差 ,阳性对照 PHA在 6μg/mL 浓度下淋巴细胞增殖率达 213.59%
1)　Data presented are means of testing result s±standard deviation(n=3), and the proliferation rate of the positi ve cont rol is
213.59% at the concent rat ion of 6μg/mL PHA
图 1　各种灰树花多糖对小鼠淋巴细胞的增殖作用1)
Fig.1　The proliferation effect of G.frondosa polysaccharides on mouse lymphocytes1)
2.2　各种灰树花多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用
从图 2可以看出 ,各种灰树花多糖均对体外培养的小鼠巨噬细胞具有激活作用 ,随着浓度
的上升 ,对小鼠巨噬细胞的激活率亦升高 ,但除 GMP 随浓度上升激活作用继续增强外 ,其它
灰树花多糖浓度达 1000μg/mL时对小鼠巨嗜细胞的激活率有所下降。其中 ,GFAP 对小鼠巨
噬细胞的激活作用最强 ,200μg/mL 的GFAP对小鼠巨噬细胞的激活率就达 260%,相应浓度
的GMAP 、GMP 和 GFP 对小鼠巨噬细胞的激活率分别为 206.42%、197.99%和 162.31%。
500μg/mL 的GFAP 对小鼠巨嗜细胞的最大激活率达 270.88%,其余GMAP 、GMP 和 GFP的
最大激活率和相应浓度分别为 246.14%(500μg/mL)、230.41%(1000μg/mL)和 179.01%
(500μg/mL)。本实验结果显示 ,碱溶性灰树花多糖对体外培养的巨嗜细胞的激活作用较水溶
性灰树花多糖强;碱溶性灰树花子实体多糖对体外培养的巨嗜细胞的激活作用大于碱溶性灰
树花菌丝体多糖 。
2.3　各种灰树花多糖对小鼠巨嗜细胞产生 NO水平的影响
分别以相同浓度的各种灰树花多糖进行实验 ,结果如图 3所示。体外培养的小鼠巨
嗜细胞经灰树花多糖刺激激活后 , NO 的生成量较空白对照 PBS 有明显增长 ,其中以 GFAP
组的增长最为显著 , 其后依次是 GMAP 、GMP 和 GFP 。同时显示 , GFP 、GFAP 、GMAP 在
10 ～ 500μg/mL剂量范围内呈剂量依赖关系 ,达 1000μg/mL 时 , NO生成量反而减少;GMP 在
154 期　　　　　　　　　　　周昌艳等:不同来源灰树花多糖免疫活性初探
10 ～ 1000μg/mL 剂量范围内均呈剂量依赖关系。此外 ,碱溶性灰树花多糖生成 NO 的水平较
水溶性灰树花多糖高 ,各个浓度的 GFAP 激活巨嗜细胞生成的 NO量均较 GMAP 高 ,其中以
500μg/mLGFAP 最高 ,达 1×106 个细胞 150μmoL。
1)　显示值为三次测试结果的平均值±标准偏差 ,阳性对照 LPS在 50μg/mL 浓度下对巨嗜细胞的激活率达 318.81%
1)　Data p resented are means of testing resuls±standard deviat ion(n=3), and the act ivation rate of posi tive cont rol is 318.
81% at the concen trat ion of 50μg/mL LPS
图 2　各种灰树花多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用1)
Fig.2　The activation effect of G.frondosa polysaccharides on mouse macrophages1)
1)　显示值为三次测试结果的平均值±标准偏差 ,阳性对照 LPS在每毫升 50μg 浓度下刺激巨噬细胞产生 NO的浓度为
每 106 个细胞 192μmoL ,空白对照PBS生成 NO 的浓度为每 106 个细胞 7μmoL
1)　Data presented are means of testing result s±standard deviat ion(n=3), and the NO of positive cont rol is 192μmoL/ 106
cells at the concent ration of 50μg/mL LPS , the NO of negative cont rol i s 7μmoL/ 106 cells
图 3　灰树花多糖激活小鼠巨嗜细胞产生NO1)
Fig.3　NO produced by mouse macrophages activated with G.f rondosa polysaccharides1)
3　讨论
由于淋巴细胞经刺激激活后释放抗体 ,通过补体途径 、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用
溶解杀伤肿瘤细胞;激活的巨嗜细胞只杀伤肿瘤源性细胞 ,对正常组织细胞无作用 ,对抵抗放
16 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　 　11 卷
化疗的肿瘤细胞仍然有效[ 4] 。巨嗜细胞产生的 NO是近年来新发现的一种有重要生物学意义
的无机小分子 ,除参与免疫调节 、抗细胞内寄生虫 、抗病毒与微生物感染外 ,还是巨嗜细胞释放
的一种杀伤肿瘤细胞的效应分子 ,它在肿瘤血管形成 、肿瘤浸润和转移过程中起重要作用[ 5] 。
本研究运用体外细胞水平的检测体系 ,探索采取不同提取方式获得的灰树花子实体多糖与
菌丝体多糖的免疫活性。结果表明 ,以稀碱提取的GFAP 与 GMAP对小鼠淋巴细胞的转化增殖
具有促进作用 ,对巨嗜细胞有显著的激活作用 ,并促进其生成大量 NO。以热水提取的GFP 和
GMP 对巨嗜细胞有一定的激活作用 ,也能促使巨嗜细胞产生一定的 NO。研究结果表明 ,GFAP
在被考察的几种多糖中免疫活性最强 ,它通过促进免疫体系的淋巴细胞转化增殖 、激活巨嗜细
胞并促使其分泌细胞因子 NO ,而实现其免疫作用与抗肿瘤作用 。经进一步的深入研究 ,可以
将GFAP开发为肿瘤的放化疗辅助治疗药物 ,为人类防治肿瘤提供新的选择。
参　考　文　献
[ 1] Ohno N , Suzuke I , Oikawa S , et al .Antitumor activity and structural characterization of Glucans extracted
from cultured fruit bodies of Grifola frondosa [ J] .Chemical and Pharmaceutical Bulletin , 1984 , 32(3):
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[ 2] Zhang J , Tang Q , Zimmerman-Kordmann M , et al.Activation o f B lymphocytes by GLIS , a bioactive pro teo-
g lycan from Ganoderma lucidum [ J] .Life Sci , 2002 , 71:623～ 638.
[ 3] Stanley ER.Murine bone marrow-derived macrophages[ J] .Methods Mol Biol , 1997 , 75:301 ～ 304.
[ 4] Ding AH , Nathan CF , Stuehr DJ.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates
from mouse peritoneal macrophages:comparison of activating cytokines and evidence for independent production
[ J] .J Immunol.1988 , 141(7):2407～ 2412.
[ 5] 陈伟珠 ,侯　敢 , 张海涛.猪苓多糖对小鼠腹腔巨嗜细胞一氧化氮生成 、iNOS 活性和细胞内还原型谷胱甘
肽含量的影响[ J] .广东医学院学报.2003 , 21(4):319 ～ 323.
[ 6] 杨　镇.肿瘤免疫学[ M] .武汉:湖北科技出版社 , 1998.10～ 13.
A Preliminary Study on the Immunocompetence of
Different Kinds of Grifola frondosa Polysaccharide
ZHOU Chang-yan1 ,2 , TANG Qing-jiu1 ,2 , JIA Wei1 ,
YANG Yan1 , ZHANG Jing-song1 , 2 , FAN Hua2
(1Edible Fungi Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 201106 , China;
2 Institut fǜr Molekularbiologie und Biochemie , F reie universitä t , Berlin Germany)
Abstract:The immunocompetence of different kinds of polysaccharide derived from Gri fola f rondosa was in-
vestigated using immunocy te cultivation technique in vitro.The experimental results showed tha t the proliferation
rate of mouse lymphocy tes w as increased significantly by GFAP (diluted alkali-ex tracted poly saccharide from the
f ruitbody of G.frondosa), while the activation of the mouse macrophages was stimulated remarkably , and a great
mass o f NO w as produced by stimulated macrophages;that GMAP(diluted alkali-ex tracted polysaccharide from the
mycelia of G.frondosa )showed the similar effect as that of GFAP on mouse lymphocytes and macrophages;and
that the definite activation effect of GFP(hot water-ex tracted po lysaccharide from the fruitbody of G.frondosa)
and GMP(hot w ater-ex tracted polysaccharide from the mycelia of G.f rondosa)on mouse microphages was ob-
served and NO was produced by stimulated macrophages , but the proliferation rate of mouse lymphocy tes w as not
stimula ted significantly.So it was expected that auxiliary medicine of auti-tumour could be prepared from diluted al-
kali-ex tracted G.frondosa poly saccharide through further research
Key words:Grifola f rondosa po lysaccharide;Immunocompetence;Lymphocy te;Macrophage;NO
174 期　　　　　　　　　　　周昌艳等:不同来源灰树花多糖免疫活性初探
3　讨论
优良食用菌菌株的选育是育种工作者
的工作重心之一 ,所选菌株的好坏直接影
响产量和质量。传统的菌株选育方法多通
过直观方法判定菌株的好坏 ,这不能完全
真实地反映菌株的品质 。因此 ,在优良菌
株选育过程中 ,人们除了对菌株的外观表
现进行观察记录外 ,还测定其生理生化指
标。随着分子生物学技术的发展 ,人们对
所选育优良菌株的遗传组成进行分析 ,以
期获得遗传成分稳定 、品质优良的菌株 。
图 15　细胞内部结构不均一
Fig.15　Non-homogeneous inner structure of the cel l
但根据菌丝亚细胞成分分析评判菌株品质还未见报道 。本文通过电镜观察外观生长状态不同
的菌株菌丝细胞的超微结构 ,发现外观长势存在差异的菌株 ,其菌丝亚细胞结构也存在差异 ,
但这种结构上的差异与长势并不完全一致。如华 1与华 2二者长势相差较大 ,但二者菌丝亚
显微结构的差异却不能解释这种长势的差异 。有的菌株虽然外观长势较好 ,但其菌丝亚细胞
成分并不丰富 ,甚至存在缺陷 ,由此可推测其将来的长势会趋弱;而有的菌株虽然目前的长势
并不理想 ,但从其所含的亚细胞成分分析 ,可以预见其将来的长势趋强 ,因此 ,不同菌株的菌丝
亚细胞结构的观察或许可成为优良菌株选育的一个辅助手段。
参　考　文　献
[ 1] 黄大滨 , 李开本 ,陈体强.姬松茸生物学特征研究初报[ J] .中国食用菌 , 1994 , 13(2):121 ～ 125.
[ 2] Guterrez ZR , Mantovani MS , Eira AF , et al.Variation of the antimutagenicity effects of w ater ex tracts of
Agaricus blazei Murrill in vitro [ J] .Toxicol In Vitro , 2004 , 18(3):301～ 309.
The Mycelial Supermicrostructure of Six Agaricus blazei
Strains under Electron Microscope
XIAO Bo , YANG Li-hong , WANG Yan-hua
(The Life Science Colleg e, Yantai Normal University , Yantai , Shandong 264025 , China)
Abstract:Agaricus blazei Murill.is a kind of edible and medicinal fungus.The mycelial supermicrostructures
of six Agaricus blazei strains w ere observed under the electron micro scope to determine the characteristics of subcel-
lular structure and give an advice fo r further studying the function of mycelia in the g row th of Agaricus blazei fruit-
body.
Key words:Agaricus blazei Murill.;Mycelium;Supermicrostructure
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