全 文 ：木芙蓉叶有效组分对大鼠肾缺血再灌注损伤中 T NF . 。 的影响
罗仕华 , 符诗聪 , 张凤华 , 李孝鹤 , 周玲珠 , 杜 宁
摘要 目的 木芙蓉叶有效组分 ( e fe e ti v e e o n s t i tu e n st o f iH 6 is e 。 对以。 6汉15 L . , ECHM )为从中药木芙蓉
叶中提取的总黄酮 , 本研究 旨在观察其对大鼠肾缺血再灌注损伤 中种瘤坏死因子 ( hi m or en c 、 15 fa ct or 一 ,
T N F
一
a) 的影响 。 方法 75 只雄性 W is atr 大鼠随机分为对照组 、 木芙蓉叶有效组分 ( E CHM ) 治疗组及假手
术组 ,每组 25 只 。 通过夹闭肾动脉 60 m in 后恢复肾脏血流灌注方法造成大鼠肾缺血再灌注损伤 ( er n 日 is -
hc
e m ia o ep fur iso
n
inj
u yr
,
IR IR )模型 , EC HM 治疗组大鼠灌胃给药 , 其余两组大鼠则给予等 1 的生理盆水 。
在大鼠肾脏恢复血流灌注 24 h 时 ,观察血清尿素氮 ( BU N ) 、肌奸 ( S rC )水平 ;并于大鼠肾脏恢复血流灌注的
0
、
l
、
3
、
6 h 时检测血清中NT F一 a 含1 以及肾组织中NT F一 a 的 m RN A 表达 。 结果 再灌注 24 h后 , ECHM 治
疗组和对照组大鼠血 B U N 及 S rC 水平均较假手术组大鼠明显升高 ,但 ECHM 治疗组大鼠血 BU N 及 S rC 水
平明显低于对照组 ( P < 0 . 05 ) ;在肾脏恢复血流灌注的 1、 3 h , ECHM 治疗组和对照组 大鼠血清中 ,Nr F一 a 含
黄均较假手术组明显 升高 , 且 E CHM 治疗组大鼠血清中 NT F一。 含童与对照组 比较 差异有显 著性 ( P <
0
.
05 ) ;在相应的时间点 , E C HM 治疗组大鼠肾组织 中 T N F一。 的 mNR A表达也明显较对照组为低 。 结论 木
芙蓉叶有效组分对大鼠肾缺血再灌注损伤有一定的保护作用 , 可能与抑制 NT F一 a 等炎性细胞因子的生成及
活性有关 。
关键词 木芙蓉叶 ;肿瘤坏死 因子 ; 肾缺血再灌注
E肠ec t of 扮b七祀 us M u加 b妞15 L . o n ht e eL v el or T N F唯 in P巨tS 就山 eR n aI L理h e而 a R e碑才此五。 n 坷u口 UL O
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一
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一
a m R NA i n 论n al t i s su e w e er m e as u er d at o , l , 3 , 6 h aft e r er n al b l以沼
l o w er 钾 fur s i o n er 叩e e it v el y . R es ul 妞 hT e le v e l o f B U N an d S C r i n ht e E CHM G an d CG w e er 5 1, 访 e an il y h ihg e r
ht an ht
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,
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e y w e o 5 1, 访 e an街 Iow e d ht an ht os e i n CG aft e r er p e而 s i o n at 24 h ( P < 0 . 0 5 ) . hT e
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一
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.
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.
; ut m o r n e e or s is fac
t o r ; er n al i sc h e m i a er ep 而 s io n
基金项目 :上海市教委资助重点课题 ( N。 : ol lB l)
作者单位 : 1 . 上海第二医科大学瑞金医院伤科 (上海 2X( X) 2 5 ) ; 2 . 上海第二医科大学瑞金医院生化室
通讯作者 :符诗聪 ,粗 : 02 1 一 64 37 (K” 5转 6 3 5 38 , E叨` 1: Fhs c @ is an · ~ · cn
木芙蓉叶始载于 《本草纲 目》 ,为锦葵科植物木芙
蓉拭6 isc us untI ab il is L
. 的叶 。 具有很好的凉血 、解毒 、消
肿 、止痛等功效 (’ 了。 经过长期研究 , 我们发现并确定了
该药的有效组分总黄酮 〔’ ] ,并证实其具有很好的抗非特
异性炎症的作用 [ ’ 〕 。 肾缺血再灌注损伤 ( er n al isc h俪 a
er eP而 is on inj 卿 , IR IR )是临床上一种常见的病理现
象 ,局部炎症机制在 IR IR 中起着重要作用〔` ] 。 在炎症
过程中 ,会释放大量的炎性细胞因子 ,如肿瘤坏死因子 (
NT F
一司就是其中最主要的一种 〔’ 〕 , 目前认为 NT F一 a 在
肾缺血再灌注损伤中起着重要作用 。
材料与方法
1 实验动物 健康雄性 W isatr 大鼠
, 由中科院
上海动物实验 中心提供 , 体重 2加 一 25 0 9 , 室温下饲
养 ,正常饮食 。
2 药物及试剂 木芙蓉叶有效组分 ( e fe c it ve
e o n s ti t u e n t s of H汤is e 。 材以 “ bils L
. ,
ECH M ) 是采用乙
醇回流法从木芙蓉叶中提取 的 , 其主要成分为总黄
酮【2〕 , 委托上海第二医科大学化学教研室进行提取 。
T N F
一
a EH sA 试剂盒购于上海晶美生物有限公司 。
3 动物模型制备 参照文献 .6[ 7 〕 , 各组大鼠用
2
.
5% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 ( l m岁 k g ) , 腹部正中
切口 ,暴露肾脏 。 假手术组仅作麻醉 、 开腹 ,但不阻断
肾脏血流 。 对照组和 EC HM 治疗组在暴露肾脏后先
切除右侧肾脏 , 同时分离左侧肾脏动脉 ,并用无损伤
微动脉夹夹闭左肾动脉 60 m in , 然后关闭腹腔 。 o
m in 后再次打开腹腔取出微动脉夹 ,恢复左侧肾脏血
流灌注 。
4 实验分 组 W is atr 大鼠随机分 为对 照组 、
ECH M治疗组及假手术组 ,每组 25 只大鼠。 E CHM 治
疗组大鼠在造模前 l h 及再灌注前 15 而 n 分别灌胃给
药 1 次 ,剂量为人体的 10 倍量 (人的剂量为每公斤体
重服用生药 0 . 21 4 9 ) 。 对照组及假手术组大鼠则予
以等量的生理盐水 。 各组大鼠在整个实验过程中均
予以正常饮食 。
5 标本采集 按不同的再灌注时间点 ( O 、 1 、 3 、
6
、
24 h) 打开大鼠腹腔 , 从腹主动脉取血 , 每个时间点
取大鼠 5 只 。 血液常规离心后取血清 , 置 一 70 ℃低温
中保存 。 同时取肾组织 ,置液氮中保存 。
6 肾功能检测 参照文献 s[] ,取再灌注 24 h 时
所得血清进行尿素氮 ( B UN )和肌醉 ( Scr )检测 。
7 血清中 NT F 一 a 含量测定 采用 E l SA 对大鼠
再灌注 0 、 1 、 3 、 6 h 后所得的血清进行肿瘤坏死因子
(NT F
一
a )水平测定 。
8 肾组织中 NT F一。 m RN A 表达测定 参照文
献 9[] , 以 p 一ac it n 为内参照 , 其上游引物 : 5 ’ 一 G AC
CGT A C A G A C TA C CT C AT一
’
; 下游引物 : 5 ’ -
A G A C A G CA C T G T GT T GG C AT一 ’ 。 P CR 扩增后大
小为 3 5 0 b p 。 NT F一 a 上游引物 : 5 ’ 一AT G A G G AC T
G A A A G C AGT ACT CG G G AC GT G G
一
3
’
; 下游引物 :
5
’ 一
C A A T GA T CC CA A A GT A GA CC T G CC C A G
A CCT 一
’ 。
P C R扩增后大小为 70 bp 。 由上海生物工
程公司合成 。 采用 T IR oz l 一步法抽提 肾组织中总
R N A
。 然后进行逆转录反应 ( RT ) : 提取的总 R N A
在引物引导下 , M 一 MVL 逆转录酶 37 ℃作用 60 m in ,
95 ℃作用 5 m in 。 多聚酶链反应 ( CP R ) : 逆转录产物
由上下游引物引导 , NT F 一 a CP R 反应条件 : 9 4℃ ,
30 , ; 印℃ , 30 5 ; 7 2℃ , 90 5 。 共 35 个循环 , 最后
7 2 ℃延伸 7 m in 。 取 5 闪 P CR 产物在 1 . 0% 琼脂糖胶
上进行电泳鉴定 。
9 统计学方法 采用 S SP S 统计软件包进行数
据处理 。 各组数据均以均数 土标准差 ( 无士 , )表示 , 组
间比较采用 : 检验 。
结 果
1 B U N及 S C r 的变化 见表 l 及表 2 。 缺血 l h
并再灌注 24 h 后 , 与假手术组大鼠比较 , E CHM 组及
对照组大 鼠血 BU N 及血 S rC 水平均 明显升高 ; 但
EC HM 组大鼠血 B UN 水平明显低于对照组 ( 尸 < 0 . 0
5 )
。
衰 1 各组大鼠血 B U N 水平比较 (无土 : )
B UN ( un QI/ L )
1 h 3 h 6 h
对照 5
假手术 5
12
.
48 土 1
.
8 1
.
23
.
16 土 3 . 16 . 27
.
88 土 2 . 98 .
l 4
.
3() 上 1
.
16
.
2 1
.
76 土 1
. 弘 . 叨 , 12 出 2 . 63 .
6
.
74 土 1
.
n 6
.
50 土 1
.
50 6
. 肠 土 1. 07
50
. 卯 土 10 . 74 . △
科. 52 土 5 . 伪 .
6
.
72 土 l . 3()
注 :与假手术组比较 , . p < 0 . 05 ;与对照组比较 , △ P < 0 . 05
衰 2 各组大鼠血 Scr 水平比较 (云土 : )
` 。 . : _ CS r (卜翻。 l/ L )
对照
假手术
7 9
. 印 士 4 . 3 9 .
79
.
20 土 5
.
2 1
.
39
. 即 土 3 . 19
l曰 . 印 土 n . 61 . 1笼加 上 17 .卯 . 〕洲知助 士 81 . 刃 . △
1服印 土 2 刃 . 1旅钓 土 .27 37 . 喇钻 .劝 土 35 . 4 .
旅 即 土 .4 76 盯. 田 土 6 肠 笼司 土丘刀
注 :与假手术组比较 , . p < 。 05 ;与对照组比较 , △ p < 0 . 01
2 E CHM 对 NT F一 a 含量的影响 见表 3 。 大鼠
肾缺血 l h 后再灌注 l h 和 3 h , E C H M 组和对照组大
鼠血清中 T N F一 a 水平与假手术组比较明显升高 , 且
E CH M 组明显低于对照组 ( P < 0 . 05 ) 。
衰 3 各组大鼠血清中 TN F , 比较 (无士 : )
TN F唯 (。砂 d )组别 n — 下丁丁一一一一一一一一二 , 厂一一一一一 - 一一刃丁一一— 一丁下一一一~ ~ ` 0 h 1 h 3 h 6 h
E C H M 5 1 1
.
2 8 上 2 . 7 9 85
.
0 1士 .4哭 . △ 吸 6 1上 5 . 53 . △ 15 . 19士 1 5
对照 5 1 1. 5 7 士 3. 18 弧 4 1土 .9 肠 . 52 37 土 .7 斜 . 1.9 17土 .3 15
假手术 5 1 1. 7 2 土 2. 96 9 . 7 1 士 2 . 肠 9 . 90 土 3· 9 3 10 . 5 8 土 2· 28
注 :与假手术组比较 , . p < 。 . 05 ;与对照组比较 , △ p < 0 . 05 ;
3 E CH M 对肾组织中NT F一 a m R N A 表达的影响
W isatr 大鼠肾脏血流再灌注 1
、
3
、
6 h 后 , 两组大鼠肾
组织中均可见到 T N F一 a 的表达 ,且在 l h 和 3 h 时表
达较明显 。 在对应的时间点 , E CHM 组 NT F 一 a 表达的
电泳灰度明显低于对照组 。 而 NT F一 a 在假手术组大
鼠的肾组织中没有明显的表达 。
讨 论
T N F
一 口一叫卜
脸 l h 3h 6h
圈 1 EC HM 组大鼠各时间点肾组织中 NT F一。 田RN A 表达
T N F
一 a 一一- 一 -今
器官缺血再灌注损伤后的炎症反应在其发病过
程起着重要作用 , 心 、 肝及肠在缺血后均可见到中性
粒细胞的浸润 , 而予以抗中性粒细胞血清治疗后 , 其
损伤程度均明显减轻 。 炎症机制在肾脏缺血再灌注
损伤中同样起着重要作用 〔’ “ 〕 , 中性粒细胞在肾皿 中
起重要的调节作用 。 研究发现 , 在缺血性肾功能衰竭
的肾脏内髓和外髓 , 可见大量中性粒细胞浸润 。 一旦
中性粒细胞浸润到缺血组织后 , 它就能释放活性氧自
由基 、 蛋 白水解 酶 、 弹性 蛋 白酶 、 傲 过 氧化物酶
( MOP )
、 细胞因子及其他各种调节因子 , 而这些均是
租 R 损伤过程中引起组织损伤的重要因素 [川 。 其中
细胞因子在这过程中起重要的调节作用 。
NT F
一
a 是一种调节炎症的主要细胞因子 , 在炎症
过程中起重要作用 , 主要由单核 一 巨噬细胞分泌 。 研
究认为 NT F一 a 在肾 I IR 的发病过程中同样起着重要作
用 。 动物 IR R 损伤后 , 可发现血清中 NT F一 a 水平上
升 ,而且组织中 m R NA 表达也增加 , 给予抗 TN F一 a 治
疗不仅能减轻肾组织的损伤 ,并能改善肾功能 [” 】。 另
外 , 目前认为 NT F一 a 有直接的细胞毒性作用 , 将肾组
织直接暴露在 NT F一 a 中能引起显著的细胞破坏和功
能障碍 。 它能降低肾小球的有效血流 t ,增加肾小球
蛋白滤过率 , 引起肾小球纤维沉积 , 诱导其他炎症细
胞因子的产生 ,促进炎性细胞浸润 。 另外 , NT F一 a 能促
进中性粒细胞和单核细胞向肾组织的聚集 ,提高它们
的猫附水平 。 这是因为 NT F一 a 能引起基底膜细胞中
细胞间猫附分子 l ( i n n a c e l u lar a hd e s i o n m ol ec ul e l ,
IC A M
一
l) 和肾小球细胞表面相应的配体 L选择素的表
达 ,它们的联合作用能大大加快中性粒细胞向细胞的
猫附速度〔” 】。 而且 , NT F一 a 还能促进血管细胞猫附分
子 ( v asc ul ar e e l a hd e s i o n m ol ec ule l , V C AM 一 l ) 的表
达 。 NT F一 a 还能促进氧自由基的产生 , 而氧自由基不
但能直接破坏细胞的结构 ,而且还能促进其它炎症因
子的表达 s1[ 。
本研究结果显示 ,木芙蓉叶有效组分对大鼠 IR IR
具有一定的保护作用 ,可能与其抑制 NT F一 a 等炎性细
胞因子的表达及活性有关 。
今 考 文 做
ho l h 3h h6
圈 2 对照组大鼠各时间点肾组织中 NT F o mNR A 表达
1 江苏新医学院. 中药大词典 . 上册 . 上海 : 人民卫生出版社 ,
19 7
: 37 1一 37 2 .
2 姚莉韵 ,王国艳 ,王丽平 . 木芙蓉叶提取工艺研究 . 中成药
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(本文编辑 陶 波 )
桑精胶囊改善 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及其分子机制的研究
张远超 陆付耳
摘要 目的 观察桑精胶囊对 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵杭的治疗效应及其分子机制 。 方法 应用小
剂全健膝位菌素加高热黄饲料饲养的方法建立实验性 2 型糖尿病大鼠模型 , 观察桑精胶囊灌胃 6 周对菊萄
粉耐童 、血清胰岛素、 甘油三醋 、 总胆固醉 、 高密度脂蛋白 一 胆固醉 、 游 离脂肪酸和胰岛素敏感性指数的影
响 , 以逆转录聚合酶链式反应 ( RT 一CP R ) 浏定肝脏胰岛素样生长 因子 1 ( IG F 一1) m RN A 表达及蛋白印迹
( W
e st e m
一
hi ot )检测骨骼肌荀萄糖转运子 4 ( GUL 4T ) 水 平 。 结果 桑精胶囊能减轻 2 型糖尿病 大筑体
重 , 改善糖耐童和调 节脂代谢 , 降低血清游 离脂肪 酸 , 减轻高胰岛素血症 ,提 高胰岛素敏感性 , 且表现为
剂 1 一 效应 关系 。 与正常组相比 , 模型组肝脏 IG F一 1 m RN A 表达水平及骨骼肌 G L U4T 含 1 及胰岛紊歌
感指数明显下降 ( P < 0 . 01 ) ; 与模型组相比 , 桑精胶囊组肝脏 IG F一 1 m R N A 及骨骼肌 G L U4T 含 1 表达明
显上升 ( P < 0 . 01 或 P < 0 . 0 5 ) 。 结论 桑精胶囊能改善 2 型糖尿病 大鼠之胰岛素抵杭 , 并可能 与其改
善脂代谢 , 降低游 离脂肪酸有关 , 其分子机制可 能与增加骨骼肌 G L U4T 蛋 白含童 , 上调肝脏 IG F一 1 m R -
N A 表达水平有关 。
关健词 2 型糖尿病 ;桑精胶囊 ;胰岛素抵杭 ;脂代谢紊乱 ; 游离脂肪酸 ;葡萄糖转运蛋白 4 ; 肤岛素样
生长 因子 一 1
E布eC st or S a n gj in g C a声耐 e A g a isn t h 曰山n R es is at n e e in T yP e Z 砚 a be 廿e aR st a dn stI M o lec ul ar M ec b a .
川 s m ZH AN G Y u an 一hc ao , UL uF 一er 加泳晓 of 加egr at 俪 乃叹d i而an l a dn 环飞Set m 龙er d ic ien , oT 护叨1 oH sP 如 l ,
oT吻 i 林 ed ic a l co l细卯 , 刀i姗h o gn nU i拢” 勿 of sc 记cen a dn 不兜 hon lo群 , 叭左人an (43 0仍0)
作者单位 :华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所 (武汉 43 0 30)
通讯作者 :陆付耳 , T七F Fax : 02 7 一 83 6 2 20 , E叨` 】: fel u @ hjt . jt lu . de u . 。 n