全 文 ：　第 48卷　第 8期
　Vol.48　 No.8 　　　　　
山　东　大　学　学　报　(医　学　版)
JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)　　　　　
2010年 8月　
Aug.2010　
收稿日期:2010-03-17
基金项目:山东省中医药科技发展计划资助项目(2007-128)。
作者简介:王玉卓(1978-),男 ,硕士研究生 ,主要从事细胞生物学的研究。 E-mail:wyz-ok@hotmail.com
通讯作者:辛华(1950-),女 ,教授,主要从事细胞损伤与保护研究。 E-mail:xinhua@sdu.edu.cn
　文章编号:1671-7554(2010)08-0032-06
灰树花多糖对四氯化碳肝 L-02细胞损伤的保护作用
王玉卓 1 ,谢珊珊 1 ,孙涛 1 ,张道来 1 ,孙庆济2 ,孙云帆3 ,冯玉新 1 ,辛华 1
(1.山东大学医学院细胞生物学研究所 , 济南 250012;2.济南澳利生物工程有限公司 , 济南 250306;
3.山东大学医学院 , 济南 250012)
摘要:目的　探讨灰树花多糖(PGF)对四氯化碳诱导的肝 L-02细胞损伤的保护作用。方法　培养人肝 L-02细
胞 ,建立 CCl4肝细胞损伤模型 ,分组实验:正常对照组 、CCl4损伤组和不同浓度的 PGF(50 、100、200和 400 μg/
mL)保护组。采用形态学观察 , MTT检测 , 生化分析培养液中 ALT、AST活性及细胞内 SOD活性 、MDA含量 , 流
式细胞仪检测线粒体膜电位 、荧光探针观测胞内 Ca2+浓度;Westernblot检测细胞 bcl-2、bax蛋白表达。结果　与
CCl4损伤组相比 ,各 PGF保护组细胞活力明显增强 , 上清液中 ALT、AST活性明显降低;细胞内 SOD明显升高 、
Ca2+浓度 MDA含量降低 ,细胞 bcl-2的表达上调 、 bax的表达下调。以 100μg/mL浓度保护效果最佳。结论　
PGF对 CCl
4
诱导的肝 L-02细胞损伤有明显的保护作用 ,其机制可能与清除自由基 、抑制肝细胞内 Ca2+浓度的升
高 、改变凋亡相关蛋白 bcl-2、bax的表达水平 ,有效地防止线粒体膜电位的下降 、减少细胞凋亡有关。
关键词:灰树花多糖;肝损伤;凋亡
中图分类号:Q952;R975　　　文献标志码:A
InhibitoryefectofthepolysaccharideofGrifolafrondosaoncarbon
tetrachloride-inducedinjurytothelivercellineL-02
WANGYu-zhuo1 , XIEShan-shan1 , SUNTao1 , ZHANGDao-lai1 , SUNQing-ji2 ,
SUNYun-fan3 , FENGYu-xin1 , XINHua1
(1.InstituteofCelBiology, SchoolofMedicine, ShandongUniversity, Jinan250012, China;
2.AoliBio-EngineeringCompanyLimited, Jinan250306, China;
3.SchoolofMedicine, ShandongUniversity, Jinan250012, China)
Abstract:Objective　Toinvestigatetheinhibitoryeffectofthepolysaccharideofgrifolafrondosa(PGF)oncarbon
tetrachloride(CCl4)-inducedinjurytothelivercelllineL-02.Methods　ThehumanlivercelllineL-02 wascultured
andtheCCl4-inducedlivercelinjurymodelwassetup.Thecelsweredividedintothenormalcontrolgroup, the
CCl4-damagedgroupandthePGFinhibitorygroups(50, 100, 200 and400μg/mL).MTTassaywasusedandmor-
phologywasobservedtomeasurecelactivity.Thecontentsofalanineaminotransferase(ALT), aspartateamin-
otranferase(AST), superoxidedismutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)weredetected.Thechangesofmito-
chondrialmembranepotentialofL-02 wereanalyzedbyflowcytometry.Theconcentrationoftheintracelularcalcium
ionwasdeterminedbyFluo3-AM.Expressionsofbcl-2 andbaxproteinsweremeasuredbyWesternblotanalysis.Re-
sults　ComparedwiththeCCl4-damagedgroup, PGFimprovedtherelativesurvivalofL-02, loweredactivitiesofthe
ASTandALTinmedium, preventedtheelevationofMDA, keptthehighdegreeofSOD, preventedthedecreaseofthe
mitochondrialmembranepotentialandincreaseoftheconcentrationofCa2+, up-regulatedexpressionofbcl-2, and
down-regulatedexpressionofbax.PGFataconcentrationof100μg/mLhadthebestinhibitoryeffect.Conclusion　PGF
cansignificantlypreventL-02 cellsfromdamageinducedbyCCl4 , andthemechanismmayberelatedtoscavengingfree
王玉卓 ,等.灰树花多糖对四氯化碳肝 L-02细胞损伤的保护作用 33　 　
radicals, inhibitingintracelularcalciumoverload, stabilizingmitochondrialmembranepotential, andregulatingexpres-
sionsofbcl-2 andbaxproteins.
Keywords:PolysaccharideofGrifolafrondosa;Hepaocyteinjury;Apoptosis
　　酒精性肝病 、药物性肝炎等肝损伤性疾病已成
为常见病 、多发病 ,发病率越来越高。但迄今为止尚
未发现特别令人满意的药物 ,所以 ,寻找对肝损伤有
预防 、治疗作用的药物对临床应用具有重要价值 。
灰树花多糖 (polysaccharideofgrifolafrondosa,
PGF)是从一种大型真菌灰树花子实体或菌丝内提
取的真菌多糖 ,其活性基础结构为具有高度分支的
β -1 , 3-葡聚糖和 β -1, 6-葡聚糖 。研究表明 , PGF具
有抗肿瘤 、改善免疫系统 、抗 HIV病毒 、调节血糖 、
血脂及胆固醇水平等作用 [ 1-5] 。但有关灰树花多糖
对肝细胞损伤的保护作用研究 ,目前尚未见报道 。
本实验通过建立 CCl4体外肝损伤模型 ,研究 PGF
对 CCl4肝细胞损伤的保护作用 ,并初步探究其作
用机制 ,为灰树花多糖在预防和治疗肝损伤性疾病
提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料和药品 、试剂　L-02细胞系 ,由山
大医学院细胞生物学研究所提供。 PGF(灰树花多
糖 ,含量 >60%, 济南澳利生物工程有限公司惠
赠);ALT、AST、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物
工程研究所);兔抗鼠 bcl-2、bax多克隆抗体 (美国
Abcam公司);羊抗兔 IgG-HRP抗体 (北京中杉金
桥生物技术有限公司);Fluo-3/AM试剂 、PVDF膜
(美国 Invitrogen公司);Rh123(上海碧云天生物技
术有限公司)、ECL反应试剂盒 (美国 Milipore公
司);胰蛋白酶 、MTT(美国 Sigma公司);RPMI1640
(美国 GibcoBRL);DMSO(美国 Biomol公司);
CCl4(天津兴隆有限公司);新生牛血清(杭州四季
青生物工程材料有限公司)。
1.1.2　主要仪器　二氧化碳恒温培养箱 (上海立
申公司);低温离心机(德国 Eppendorf公司);酶标
仪(美国 Thermo公司);倒置相差显微镜(日本 Ni-
kon公司);DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂);
流式细胞仪(美国 BD公司);激光共聚焦显微镜
(德国 ZEISS公司)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养及分组实验　取对数生长期 L-02
细胞 ,用含 10%小牛血清的 RPMI1640培养液培
养 , 37℃、5% CO2饱和湿度条件下静置培养 ,以 3×
10
4 /mL密度接种于 25mL培养瓶或 24、96孔培养
板 ,培养 36h细胞后 ,更换培养液进行分组实验 ,设
正常对照组 、CCl4损伤组和不同质量浓度(50、100、
200、 400μg/mL)的 PGF保护组 。同时 ,在保护组
加入相应质量浓度的 PGF, 12 h后 CCl4损伤组和
PGF保护组更换为 60%饱和浓度的 CCl4损伤液 ,
正常组也同时更换为 RPMI1640培养液 , 4h后观
察或收集细胞 ,做形态学或其他指标检测。
1.2.2　CCl4饱和损伤液配制方法　CCl4损伤细胞
方法:对数生长期的 L-02细胞 , 用不含血清的
RPMI1640漂洗 2次 ,然后更换含有 60%饱和浓度
的 CCl4的 RPMI1640培养液进行损伤 。 60%饱和
浓度的 CCl4损伤液的配制方法:向 RPMI1640完
全培养液中添加过量的 CCl4 ,在 37 ℃下孵育 15 ～
18h,得到含有饱和浓度的 CCl4的 RPMI1640;然后
向4mLRPMI1640完全培养液中添加含有饱和
CCl4的 RPMI1640 6 mL配制成 60%饱和浓度的
CCl4的 RPMI1640[ 6] 。
1.2.3　细胞形态学观察　CCl4损伤结束后 ,于倒置
相差显微镜下观察各组细胞的形态学变化 ,并拍照 。
1.2.4　MTT法检测细胞活力　L-02细胞接种于
96孔板中 ,每组设 8个复孔 , CCl4损伤结束后 ,加
MTT20μL(5g/L),放入培养箱继续培养 4h后取
出培养板 ,吸净培养液后加入 100μL二甲基亚砜
(Dimethylsulfoxide, DMSO),培养箱孵育 20 min,
用全自动酶联仪测定每孔的光密度(OD值 , 570
nm)。以下式计算试验组细胞的相对存活率 ,细胞
相对存活率 =(OD实验 -OD空白 /OD对照 -OD
空白)×100%。
1.2.5　细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ala-
ninetransaminase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶
(aspartateaminotransferase, AST)检测 　L-02细胞
接种于 96孔板中 ,每组设 8个复孔 , CCl4损伤结束
后 ,取各组细胞培养液的上清液 ,按试剂盒操作步骤
处理 ,使用酶标仪测定细胞培养上清液中 ALT、
AST吸光度值(OD值)。测得 OD值查找标准曲线
求得相应酶活力值 。
1.2.6　细胞内超氧化物歧化酶 (superoxidedis-
mutase, SOD)、丙二醛(malondiadehyde, MDA)生化
检测 　 L-02细胞接种于 25 mL培养瓶中 ,每组 3
　 34　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 48卷 8期　
瓶 , CCl4损伤结束后 ,收集各组细胞 ,以反复冻融法
获得细胞裂解液 。按照试剂盒操作步骤 ,使用酶标
仪测定 SOD及 MDA吸光度值 。所得 OD值经试
剂盒提供的换算公式计算得相应的含量。
1.2.7　Fluo3-AM测定细胞内钙离子的浓度　L-02
细胞接种于放有盖玻片的 6孔培养板中 ,每孔接种
3mL。实验分成 3组:正常对照组 , CCl4损伤组 ,
PGF保护组(100μg/mL)。 CCl4损伤结束后 ,吸弃
培养液 , 用 PBS洗 3次后 , 每孔加入 Fluo-3/AM
(5μmol/L)染液 1mL, 37℃孵育 30min后 , PBS洗
3次 ,再加入 PBS孵育 30min,激光共聚焦显微镜于
506nm观察。每张片子随机选取 5个视野拍照 ,用
IPP5.1软件对整张图片进行累计光密度测量。
1.2.8　Rh123测量线粒体膜电位(ΔΧm)　L-02细
胞接种于 25 mL培养瓶中 , 细胞培养及分组同
1.2.7, CCl4损伤结束后 ,分别收集损伤组 、PGF保
护组与正常对照组细胞 。以培养基重悬细胞加入
Rh123染液(终质量浓度为 10μg/mL), 37℃, 5%
CO2细胞培养箱孵育 10 min, 1 000 r/min, 离心 8
min(离心半径 9cm),以培养基洗细胞两次 ,培养基
重悬细胞后 ,经 200目滤网过滤后 ,用流式细胞仪测
定荧光强度 。Rhl23的激发波长为 488nm、发射波
长为 525nm, CelQuest软件分析 。
1.2.9　WesternBlot检测 bcl-2、bax　L-02细胞接
种于 25mL培养瓶中 ,细胞培养及分组同 1.2.7,于
冰上收取细胞全蛋白 , BCA(二喹啉甲酸)法测定各
组总蛋白量。经 SDS-PAGE凝胶电泳 、转膜 、封闭 、
一抗(1∶3 000的兔抗鼠 bcl-2、baxmAb)、二抗(1∶
3 000羊抗兔 IgG-HRP)、化学发光 、曝光 、显影定影等
过程 ,胶片扫描。使用 ImageJ1.41(NIHSoftware)
软件对结果进行灰度分析 。以 β-actin作为内参 ,计
算目的蛋白相对表达量 。
1.3　统计学处理　采用 SPSS10.0统计软件进行
统计学分析 ,并用 Excel2003作图。数据以 x±s表
示 ,多组间均数比较采用 ANOVA分析 , 组间两两
比较采用 t检验分析 , P<0.05表示差异具有统计
学意义。
2　结　果
2.1　细胞形态学观察　在倒置相差显微镜下 ,正常
对照组细胞形态饱满 ,多边形 ,立体感强 , (图 1A);
CCl4损伤组有较多细胞发生凋亡 ,呈圆球形 ,周边
可见许多向外突起的凋亡小体(图 1B);PGF保护
组细胞形态多数正常 ,可见少数凋亡细胞 , 以 100
μg/mL保护组效果最佳(图 1C)。
图 1　L-02细胞形态(×200)
A:正常对照组;B:CCl4损伤组;C:100μg/mLPGF保护组;Fig.1　MorphologyofL-02 (×200)
A:Controlgroup;B:CCl4-damagedgroup;C:PGF+CCl4 group
2.2　MTT法测细胞活力　用 MTT法检测正常对照
组 、CCl4损伤组以及各 PGF保护组的细胞活性 ,分别
为(100 ±2.80)%、(32.31 ±5.11)%、(55.02 ±
6.68)%、(74.92 ±6.17)%、(64.93 ±5.36)% 和
(59.27±3.95)%(图 2)。说明不同质量浓度的 PGF
对 CCl4损伤均有保护作用 ,各保护组与 CCl4损伤组
有统计学差异 ,以 100μg/mLPGF作用最为明显。
2.3　培养液上清中 AST、ALT活性　结果如表 1
和图 3所示 , 与正常对照组相比 CCl4 损伤组的
AST、ALT值显著增高(P<0.05);各 PGF保护组
的 AST、ALT值除 100μg/mL组的 AST与正常对
照组无显著差异外(P>0.05),其他各质量浓度组
图 2　MTT法测细胞活性
(n=8, ＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05 vsCCl4损伤组)
Fig.2　CellactivitymeasuredbyMTTassay
(n=8, ＊P<0.05vscontrolgroup;△P<0.05 vsCCl4-damagedgroup)
王玉卓 ,等.灰树花多糖对四氯化碳肝 L-02细胞损伤的保护作用 35　 　
均与正常对照组存在显著差异(P<0.05)。与 CCl4
损伤组相比各 PGF保护组的 AST、ALT水平均低
于 CCl4损伤组并呈剂量依赖性 ,而且都有显著性差
异(P<0.05)。
表 1　培养液中 AST、ALT活性( x±s, n=8)
正常对照组 CCl4损伤组 PGF保护组
50μg/mL 100μg/mL 200μg/mL 400μg/mL
AST(IU/L) 70.11±6.25△ 152.16±10.48＊ 100.84±15.36＊△ 78.47±12.35△ 108.31±11.88＊△ 116.84±13.27＊△
ALT(IU/L) 35.26±4.61△ 96.47±7.31＊ 61.16±10.04＊△ 43.69±9.84＊△ 51.07±9.42＊△ 82.09±7.58＊△
　　＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05 vsCCl4损伤组
图 3　培养液中 AST、ALT活性
(n=8, ＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05vsCCl4损伤组)
Fig.3　ActivitiesofASTandALTinmedium
(n=8, ＊P<0.05 vscontrolgroup;△P<0.05vsCCl4-damagedgroup)
2.4　细胞内 SOD、MDA含量检测　结果如表 2、图
4、图 5所示 ,与正常对照组相比 CCl4损伤组细胞的
SOD含量显著降低(P<0.05), MDA含量显著增
高(P<0.05);各 PGF保护组的 SOD、MDA含量除
100μg/mL组的 MDA与正常对照组无显著差异外
(P>0.05),其他各质量浓度组均与正常对照组存
在统计学差异(P<0.05)。与 CCl4损伤组相比各
PGF保护组的 SOD水平均高于 CCl4损伤组并呈剂
量依赖性 ,而各 PGF保护组的 MDA水平均低于
CCl4损伤组并呈剂量依赖性 , PGF保护组与 CCl4
损伤组相比都有统计学差异(P<0.05)。
表 2　细胞内 SOD活力和 MDA含量 ( x±s, n=3)
正常对照组 CCl4损伤组 PGF保护组
50μg/mL 100μg/mL 200μg/mL 400μg/mL
SOD
(U/mgprot) 121.94±11.45△ 56.55±8.67＊ 85.49±13.26＊△ 112.67±11.75＊△ 82.94±8.51＊△ 71.59±10.24＊△
MDA
(nmol/mgprot) 2.14±0.48△ 5.19±0.62＊ 3.76±0.87＊△ 2.55±0.93△ 3.26±0.76＊△ 3.87±0.81＊△
　　＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05vsCCl
4
损伤组
图 4　细胞中 SOD含量活力
(n=3, ＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05vsCCl4损
伤组)
Fig.4　ActivityofSODinL-02cels
(n=3, ＊P<0.05 vscontrolgroup;△P<0.05vsCCl4-damagedgroup)
2.5　细胞内钙离子的浓度检测　结果如图 6、图 7所
示 ,激光共聚焦显微镜拍照 ,用 IPP软件计算图片的
累积光密度 ,结果显示:正常对照组 、CCl4损伤组和
PGF保护组的累积光密度分别为 302.6 ±100.8、
2 393.4±948.2、529.4±175.8,说明 CCl4损伤能使
细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),而 PGF能明
显地抑制 CCl4损伤引起的细胞内钙离子浓度的升
高。
图 5　细胞中 MDA含量
(n=3, ＊P<0.05 vs正常对照组;△P<0.05 vsCCl4损伤组)
Fig.5　ContentofMDAinL-02cels
(n=3, ＊P<0.05 vscontrolgroup;△P<0.05vsCCl4-damagedgroup)
2.6　Rh123测量线粒体膜电位(ΔΧm)　检测结果
显示 ,正常对照组 、CCl4损伤组和 PGF保护组的
Rh123荧光强度分别为 455.17 ±37.26、 96.62 ±
20.84、248.75±36.11, CCl4损伤组较正常对照组细
　 36　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 48卷 8期　
胞 ,荧光强度明显减弱;预先加入 100μg/mLPGF的 保护组细胞 ,荧光强度明显高于 CCl4损伤组 ,见图 8。
图 6　L-02细胞内钙离子荧光图像(×100)
A:正常对照组;B:CCl4损伤组;C:100μg/mL保护组Fig.6　CalciumfluorescentimagesofL-02(×100)
A:Controlgroup;B:CCl4-damagedgroup;C:PGF+CCl4 group
图 7　钙离子荧光图像的累计光密度分析
(n=5, ＊＊P<0.01, ＊P<0.05 vs正常对照组)
Fig.7　IODofcalciumfluorescentimages
(n=5, ＊＊P<0.01, ＊P<0.05 vsthecontrolgroup)
图 8　Rh123荧光强度分析
(n=3, ＊＊P<0.01, ＊P<0.05 vs正常对照组)
Fig.8　AnalysisofRh123fluorescentdensity
(n=3, ＊＊P<0.01, ＊P<0.05 vsthecontrolgroup)
2.7　bcl-2、bax蛋白表达检测　Western-blot结果显
示 ,各组均可在在相对分子质量 2.1×104 (bax)、
2.6×104(bcl-2)处显示电泳条带(图 9)。各组 bcl-2/
β -actin电泳条带的密度比值分别为 1.53±0.09、
1.20±0.15、0.16 ±0.03, bax/β-actin电泳条带的密
度比值分别为 0.45±0.04、0.71±0.11、1.01±0.10,
CCl4损伤组 bcl-2表达量较正常对照组明显减少
(P<0.01),而 bax表达量明显增多(P<0.05);而
PGF保护组 bcl-2表达量明显高于 CCl4损伤组(P<
0.05), 而 bax表达量 明显低于 CCl4 损伤 组
(P<0.05)。
图 9　Westernblot检测 L-02中 bcl-2、bax表达量
Fig.9　Expressionsofbcl-2 andbaxdetectedbyWestern-blot
inL-02cels
3　讨　论
本实验采用了人正常肝 L-02细胞株为研究对
象。用 CCl4诱导的肝细胞损伤模型 ,探讨灰树花多
糖在肝细胞损伤中的保护作用和机制。肝 L-02细胞
是一种正常人肝细胞株 ,比起其他肝细胞株更接近体
内正常肝细胞生活状态 ,是理想的体外肝细胞损伤实
验的材料 ,为体外研究灰树花多糖对 CCl4肝细胞保
护作用研究提供了获得可靠实验结果保证。
CCl4肝细胞损伤模型被广泛用作研究药物保肝
的经典模型 [ 5] , CCl4进入肝细胞后经过代谢 ,生成活
泼的三氯甲基自由基和过氧化三氯甲基。自由基引
起一系列的脂质过氧化反应 ,损伤膜的结构和功能 ,
造成膜的通透性增加 ,胞浆内的可溶性酶渗出;线粒
体膜通透性增加 、膜电位降低。此外 ,自由基可抑制
细胞膜和内质网上钙泵的活性 ,使胞浆内 Ca2+水平
增加 ,堆积于细胞内导致肝细胞损伤[ 6-7] 。目前国内
CCl4体外肝细胞损伤实验中 ,制备的损伤液 CCl4呈
大小不均的颗粒状态分布 ,加入到培养液中颗粒大小
不等 ,分布不均匀 ,影响实验结果。本实验采用国外
制备饱和 CCl4损伤液的方法[ 4] , CCl4在实验体系中
分布均匀 ,取得了理想的稳定实验结果 。
本实验细胞形态学观察显示 , 100μg/mL灰树花
多糖对 CCl4损伤造成的细胞凋亡有明显的保护作
用。MTT检测法是用于检测细胞存活和生长情况常
王玉卓 ,等.灰树花多糖对四氯化碳肝 L-02细胞损伤的保护作用 37　 　
用方法 ,活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将外源性
MTT还原成蓝色不溶于水的甲臜(Formazan),其生
成量与活细胞数成正比 ,用酶标仪检测可间接反映活
细胞数量。本实验检测结果显示 , PGF灰树花多糖对
CCl4造成的细胞损伤有明显的保护作用 ,而且呈剂
量依赖性 ,以 100μg/mL保护效果最好。
ALT、AST是检测肝细胞损伤的常用检测指标 ,
胞外转氨酶的升高程度反映了肝细胞膜的损伤程
度 [ 7-9] 。本实验检测上清液中 AST、ALT活性 ,结果
显示各 PGF保护组 ALT、AST水平显著低于 CCl4损
伤组 ,表明 PGF具有保护肝细胞膜 、对抗肝损伤的作
用。 SOD能特异地清除体内的氧自由基 ,其活性高
低反映了机体清除氧自由基的能力[ 10] 。在本实验
中 , CCl4损伤组 SOD活性显著降低 ,说明细胞清除
自由基的能力降低 ,而各 PGF保护组的细胞中 SOD
活性明显提高 ,提示 PGF具有较好提高细胞清除自
由基的能力 ,减轻了细胞膜在自由基等攻击下的损伤
程度 。
钙离子(Ca2 +)是细胞内重要的信号分子 , 细胞
内钙离子浓度变化在细胞损伤中起重要作用 [ 11-13]
Fluo-3/Am为高度特异性的 Ca2+荧光指示剂 ,可以
灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化[ 14] 。实验
结果显示 CCl4损伤组细胞内游离钙离子浓度升高到
正常细胞的 8倍 ,而各 PGF保护组钙离子浓度升高
不到正常细胞的两倍 ,提示 PGF对于 CCl4损伤导致
的细胞内钙离子浓度的升高具有明显的抑制作用。
线粒体膜电位(mitochondialmembranepotential,
MMP)是评价线粒体功能的敏感指标 [ 15] 。 MMP的
变化可作为细胞凋亡的早期特征 ,是细胞凋亡不可逆
转的标志[ 16-17] 。实验结果表明各 PGF保护组荧光强
度显著高于 CCl4损伤组 ,提示 PGF可以很好地稳定
线粒体膜电位 ,防止其大幅度下降 ,从而有效地保护
了肝细胞的线粒体功能 ,防止细胞凋亡的发生。
bcl-2蛋白是一种膜整合蛋白 ,主要分布在线粒
体内膜及细胞膜内表面 、内质网 、核膜等处 ,具有抑制
凋亡的作用。 bax为 bcl-2家族中的一员 ,其生物学
作用是拮抗 bcl-2,促进细胞凋亡 [ 18-19] 。本实验结果
显示 , PGF保护组细胞内 bcl-2表达量和 bax表达量
较 CCl4损伤组分别显著升高和降低。提示 PGF可
以通过上调细胞内 bcl-2表达 ,下调 bax表达来抑制
线粒体释放促凋亡蛋白 ,从而起到保护肝细胞地作
用。
综上所述 , PGF对 CCl4导致的肝细胞凋亡有明
显的保护作用 ,最佳保护质量浓度为 100μg/mL。
其机制可能与清除自由基 、降低肝细胞内 Ca2+浓度
的升高 、改变凋亡相关蛋白 bcl-2、bax的表达水平 ,
有效地防止线粒体膜电位的下降 、减少细胞凋亡有
关。本研究为灰树花多糖在预防和治疗肝疾病方面
提供了实验依据。
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关键性作用 [ 9] 。本研究在 HE组大鼠脑组织中观察
到明显的蛋白质硝基化 ,而空白对照组脑组织蛋白
质硝基化甚少 ,提示 HE大鼠脑组织蛋白质硝基化
损伤对 HE的病理生理过程有重要影响 。
综上所述 ,蛋白质硝基化可造成肝脏和颅脑细
胞功能的实验性损伤。 HE大鼠的肝脏和脑组织存
在蛋白质硝基化 ,且细胞凋亡显著增加 ,提示 HE与
其肝脏和脑组织内蛋白质硝基化 、细胞凋亡之间可
能存在密切关系 。深入研究蛋白质硝基化在 HE的
发生发展中的作用 ,有助于进一步阐明 HE的病因
和发病机制 ,并可为其治疗提供新的思路 。
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(编辑:张彩凤)