全 文 ：广玉兰花总黄酮提取及其抗氧化活性研究
郝玉民，李立祥* ，易昶寺，任鹏程，马 力
(安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部农业部重点实验室，安徽合肥 230036)
摘要 ［目的］筛选广玉兰花中总黄酮的提取方法，并研究其抗氧化活性。［方法］采用乙醇回流提取法对广玉兰花中总黄酮进行提取，
采用单因素试验和正交试验考察乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间对总黄酮提取效果的影响，通过超氧阴离子自由基( O2
－·) 和
羟自由基(·OH) 的清除试验，对广玉兰花总黄酮的抗氧化活性进行研究，并与维生素 C和抗氧化剂特丁基对苯二酚( TBHQ) 进行比
较。［结果］利用单因素试验和正交试验确定最佳提取工艺条件为:乙醇浓度 70%，料液比 1∶40( g /ml)，提取时间 90 min，提取温度 70
℃ ;在该提取条件下，总黄酮平均含量为 4． 896%，总黄酮平均纯度为 32． 925%。广玉兰花总黄酮对自由基的清除率随总黄酮浓度的增
大而上升，总黄酮清除 O2
－·及·OH的 IC50值分别为 0． 381 0和 0． 640 6 mg /ml。广玉兰花总黄酮清除自由基的能力高于 VC，低于抗氧
化剂 TBHQ;但当总黄酮浓度达到 0． 709 2 mg /ml时，其抗氧化效果接近于 TBHQ。［结论］广玉兰花总黄酮具有明显体外抗氧化作用，是
一种极具开发价值的天然抗氧化物质。
关键词 广玉兰花( Magnolia grandiflora Linn) ; 总黄酮;提取; 抗氧化
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2014) 05 －01365 －03
Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavones from Magnolia grandiflora Linn
HAO Yu-min，LI LI-xiang et al ( Key Lab of Tea Biochemistry ＆ Biotechnology，Ministry of Education and Agriculture，Anhui Agricul-
tural University，Hefei，Anhui 230036)
Abstract ［Objective］To select extraction method for total flavones from Magnolia grandiflora Linn and study its antioxidant activity． ［Meth-
od］Total flavones were extracted from Magnolia grandiflora by using ethanol reflux extraction method，and the effects of ethanol concentra-
tion，extraction temperature，solid － liquid ratio and extraction time on the extraction efficiency of total flavones were separately investigated by
using single － factor test and orthogonal experiment． Antioxidant activities of total flavones from Magnolia grandiflora Linn were studied by su-
peroxide anion radical and hydroxyl radicals scavenging tests，and compared with vitamin C and antioxidants TBHQ． ［Ｒesult］The optimum
extraction conditions were as follows: ethanol: 70%，solid － liquid ratio: 1∶40，extraction time: 90 min，extraction temperature: 70 ℃ ． The
average content of total flavones was 4． 896%，and the purity of total flavones averaged 32． 925% ． The results show that，the clearance rate of
total flavones from Magnolia grandiflora Linn on free radical raised with the increasing of the concentration of total flavones． The IC50 values of
scavenging superoxide anion radicals and hydroxyl radicals of total flavones were 0． 381 0 and 0． 640 6 mg /ml． The capacity of scavenging free
radical of total flavones from Magnolia grandiflora Linn is higher than Vc，but lower than TBHQ． When the concentration of total flavones was
0． 709 2 mg / ml，the antioxidant effect close to TBHQ． ［Conclusion］The total flavones from Magnolia grandiflora Linn as a natural antioxi-
dant substance of great exploitation value have significant in vitro antioxidant effect．
Key words Magnolia grandiflora Linn; Total flavones; Extraction; Antioxidant activity
作者简介 郝玉民( 1987 － ) ，男，河南睢县人，硕士研究生，研究方向:
茶学与天然产物。* 通讯作者，教授，硕士生导师，从事茶
叶化学与制茶工程、农产品加工与贮藏研究。
收稿日期 2014-01-20
广玉兰(Magnolia grandiflora Linn)系木兰科木兰属
(Magnolia)乔木树种。其花蕾的醇提物具有明显扩张血管
和降压作用，并对血小板聚集及血栓形成起抑制作用，可能
与其所含黄酮成分有关［1］。与广玉兰同科属的白玉兰、望
春玉兰和武当玉兰的花蕾是中药辛夷，为名贵中药，已被人
们熟知。其性辛温，无毒，有驱风散寒通窍理肺的功效，主
要用于治疗风寒头痛、鼻塞、鼻渊、鼻流和浊涕等［2］。辛夷
主要有效成分有黄酮、生物碱、木脂素和挥发油等［3］。辛夷
的乙醇提取物具明显的抑菌、扩张血管、降血压及对血小板
聚集和血栓形成起抑制作用等药理活性［4］。何开跃等用广
玉兰叶片制备乙酸乙酯提取物，利用显色反应初步鉴定其
成分，再以人工抗氧化剂 PG(没食子酸丙酯)和天然抗氧化
剂 PA(植酸)为对照，测定了其体外抗氧化活性，并用 2 种
体系 DPPH·(1，1 －二苯基苦基苯肼自由基)和卵磷脂进
行评价，结果表明，广玉兰叶片乙酸乙酯提取物有较好的抗
氧化作用［5］。樊正球等应用微波辅助顶空固相微萃取法
(MAE － HS － SPME)法从广玉兰叶片中提取出 48 种挥发
性化合物［6 － 7］。
黄酮类化合物在植物界分布很广泛，目前发现的已达
5 000余种，可划分为 10大类。其中，黄酮醇类、黄酮类、花青
素类、儿茶素类、黄烷醇类和异黄烷醇类等 6 大类黄酮在饮
食中存在更为广泛［8］。黄酮类化合物的药理作用和机制被
广泛研究，发现除了明显抗氧化作用外，还有明显改善血脂
紊乱、抗炎、抗血小板聚集、抗血栓和保护心脑血管疾病等作
用［9］。近年来，大量研究表明黄酮类化合物具有较强的抗氧
化活性，同时具有抑菌、抗心肌梗塞等药理保健功能且毒副
作用很小，是一类极具开发价值的天然有机抗氧化剂［10］。
Sandra Ｒ等用化学荧光法对 5 种不同黄酮类化合物对抗自
由基损伤的能力进行了分析测定，确定具有强抗氧化性［11］。
Ｒebai Ben Ammar等研究证明，从 Ｒhamnus alaternus L．叶子
中分离得到的 3种黄酮类化合物对 DPPH自由基、超氧阴离
子自由基有较强的清除作用［12］。
目前，对于广玉兰花总黄酮的研究仅限于总黄酮的提
取，而广玉兰花总黄酮的体外抗氧化活性的研究在国内鲜有
报道。广玉兰资源丰富，广玉兰花中含有较丰富的黄酮类化
合物，却未能被开发利用，造成很大的资源浪费。为了进一
步开发和利用广玉兰，笔者对广玉兰花中总黄酮的提取工艺
进行优化，并用 O2
－·和·OH 自由基清除法研究其抗氧化
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(5) :1365 － 1367，1485 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.05.077
活性，旨在开发广玉兰花中天然活性物质资源，并为广玉兰
花资源综合开发与利用，特别是为具备药用价值产品开发奠
定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。鲜广玉兰花，采于安徽农业大学校园内，
置于微波炉中杀青处理 120 s后，于烘箱中 70 ℃烘干，粉碎。
1． 1． 2 主要仪器。ml204 电子分析天平，购自梅特勒 －托
利多仪器(上海)有限公司;Vis 7200 紫外可见分光光度计，
购自尤尼柯(上海)仪器有限公司;DHG － 9140A 型电热恒
温鼓风干燥箱，购自上海 －恒科技有限公司;TG16 － W 微量
高速离心机，购自湖南湘仪离心机仪器有限公司;SHZ － DIII
循环水真空泵，购自郑州英峪予华仪器有限公司;HH － 6 型
数显恒温水浴锅，购自国华电器有限公司;SENCOＲ 旋转蒸
发仪，购自上海申生科技有限公司;AJF － 2001 － P 超纯水
机，购自重庆颐洋企业发展有限公司;NN － S672SF 微波炉，
购自上海松下电器有限公司;JFSD － 100 粉碎机，购自上海
嘉定粮油仪器有限公司。
1． 1． 3 主要试剂。芦丁对照品，购自成都曼斯特生物科技
有限公司;NaNO2、NaOH、Al(NO3)3、VC、无水乙醇、硫酸亚
铁、邻二氮菲、盐酸、过氧化氢和邻苯三酚等，均为分析纯;
TBHQ(特丁基对苯二酚)为食品添加剂;三羟甲基氨基甲烷
(tris)为国产生化试剂，市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 广玉兰花总黄酮的测定方法。
1． 2． 1． 1 线性关系的考察［13］。精密称取 120 ℃干燥至恒
重的芦丁对照品 20 mg，加浓度 80%乙醇溶解，定容至 100 ml
容量瓶中，摇匀，制成 0． 2 mg /ml 对照品溶液。分别取该溶
液 0、1． 0、2． 0、3． 0、4． 0 和 5． 0 ml 于 10 ml 容量瓶中，加 0． 4
ml浓度 5%NaNO2 溶液，摇匀放置 6 min;然后加入 0． 4 ml浓
度 10%Al(NO3)3 溶液，摇匀放置 6 min;再加 4 ml 浓度 4%
NaOH溶液，加水至刻度，摇匀，放置 15 min，于 510 nm波长
测定各吸光度，计算线性回归方程。
1． 2． 1． 2 提取液中总黄酮含量的测定。取 1． 0 ml 广玉兰
花总黄酮提取液于 10 ml 容量瓶中，其余步骤按与标准曲线
制作的方法操作，参照空白，测定提取液的吸光度，并利用线
性回归方程计算总黄酮的含量。
1． 2． 2 总黄酮的提取工艺设计。
1． 2． 2． 1 单因素试验。(1)乙醇浓度对广玉兰花中总黄酮
含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，按料液比 1 ∶ 40
(g /ml，W/V，下同)分别加入浓度分别为 40%、50%、60%、
70%和 80%的乙醇溶液，提取温度 70 ℃，提取时间 120 min，
测定广玉兰花中总黄酮的含量。(2)料液比对广玉兰花中总
黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，分别按料液比
1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和 1∶50加入浓度为 70%的乙醇溶液，提
取温度 70 ℃，提取时间 120 min，测定广玉兰花中总黄酮的
含量。(3)提取时间对广玉兰花中总黄酮含量的影响。取广
玉兰花干燥粉末适量，按料液比 1∶40 加入浓度 70%的乙醇
溶液，提取温度 70 ℃，分别提取 30、60、90、120和 150 min，测
定广玉兰花中总黄酮的含量。(4)提取温度对广玉兰花中总
黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，按料液比 1∶40
加入浓度 70%的乙醇溶液，提取温度分别为 40、50、60、70 和
80 ℃，提取时间为 120 min，测定广玉兰花中总黄酮的含量。
1． 2． 2． 2 正交优化试验。在单因素试验的基础上，采用
L9(3
4)对影响总黄酮提取效果的因素进行正交试验，进一步
研究各因素对提取效果的影响，筛选出提取最佳工艺参数。
因素水平设计见表 1。
表 1 正交试验设计
水平
因素
A 乙醇浓度
%
B 料液比
g /ml
C 提取时间
min
D 提取温度
℃
1 60 1∶ 30 90 60
2 70 1∶ 40 120 70
3 80 1∶ 50 150 80
1． 2． 3 总黄酮纯度的测定。按正交试验确定的最佳提取工
艺提取总黄酮，然后将该提取液经旋转蒸发浓缩，烘箱干燥，
得粗提物。将一定量粗提物溶于乙醇，配成浓度为 1 mg /ml
溶液，测定吸光度值，计算粗提物中总黄酮纯度，并进行 3 组
平行试验。粗提物中总黄酮纯度则由下式计算:
总黄酮纯度(%)=粗提物中总黄酮质量(mg)
粗提物质量(mg)
×100
1． 2． 4 广玉兰花总黄酮的抗氧化活性研究。
1． 2． 4． 1 清除 O2
－ ·自由基的测定方法［14 －15］。取 3 ml
Tris-HCl缓冲溶液(pH 8． 2) ，加入 0． 1 ml 浓度分别为 0． 202
1、0． 316 1、0． 401 7、0． 516 4、0． 604 2和0． 709 2 mg /ml的总黄
酮提取液，在相同条件下分别以等质量浓度的 VC 和 TBHQ
作为对照组，于 25 ℃水浴 20 min 后，加入 3 ml 浓度为 7
mmol /L的邻苯三酚，反应 4 min 后再加入浓度 10 mol /L 的
HCl终止反应，于 420 nm波长处测吸光值，根据清除率判断
样品对 O2
－·的影响。其中:
清除率(%)=(A空白 － A样品)/A空白 ×100;
式中:A空白、A样品分别为空白的吸光值及样品的吸光值。
1． 2． 4． 2 清除·OH 自由基的测定方法［16 －17］。取 8 支 10
ml比色管，分别加入 1． 0 ml 浓度 7． 5 mmol /L硫酸亚铁溶液
和浓度为 7． 5 mmol /L邻二氮菲溶液、以及 pH = 7． 4 的磷酸
盐缓冲溶液(PBS )2． 0 ml，在 2 ～ 8 号比色管中各加入浓度
为 0． 1% H2O2 溶液 1． 0 ml，然后在 3 ～ 8 号比色管中分别加
入 1． 0 ml不同浓度的总黄酮提取液，并且在相同条件下分别
以等质量浓度的 VC 和抗氧化剂 TBHQ 作为对照组，用蒸馏
水定容至 10 ml，于37 ℃水浴1 h，在波长510 nm处测吸光值
(A) ，计算羟基自由基清除率。清除率计算公式为:
清除率(%)=(A样品 － A损伤)/(A空白 － A损伤)×100
式中:A损伤为以蒸馏水代替样液的吸光度，A空白为以蒸馏水代
替样液及 H2O2 的吸光度。
2 结果与分析
2． 1 线性关系的考察 计算得线性回归方程为:Y =
6631 安徽农业科学 2014 年
1． 333 0X －0． 086 4，Ｒ2 = 0． 993 8。试验结果表明，在 0． 2 ～
1． 0 mg /ml范围内，芦丁浓度与吸光度呈良好的线性关系。
2． 2 单因素试验
2． 2． 1 乙醇浓度对提取效果的影响。图 1 表明，随着乙醇
浓度的升高，总黄酮含量呈先上升后降低的变化趋势。当乙
醇浓度为 70%时含量达到最高;超过 70%后，可能由于一些
杂质溶解量也增多，从而导致总黄酮的含量下降。此外，高
浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固，黄酮类化合物不易溶出［18］。
故乙醇浓度以 70%为宜。
图 1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响
2． 2． 2 料液比对提取效果的影响。图 2 表明，料液比从
1∶10 ～1∶40时总黄酮含量随之增大;大于 1∶40 后，含量基本
趋于平稳，可能是由于一定比例的乙醇已基本将总黄酮溶
出，而过大的乙醇量会造成浪费，并且会增加后期减压浓缩
的困难。故料液比以 1∶40为宜。
图 2 料液比对总黄酮含量的影响
2． 2． 3 提取时间对提取效果的影响。图 3 表明，在前 120
min，广玉兰花总黄酮含量随提取时间的延长而增加，120 min
以后，其含量变化不大，基本趋于稳定。故提取时间以 120
min为佳。
2． 2． 4 提取温度对提取效果的影响。图 4 表明，在 70 ℃
前，总黄酮含量随温度的升高而上升，大于 70 ℃含量开始下
降。可能由于随着温度的升高，杂质溶解加快，总黄酮的溶
解受到干扰。另外，总黄酮分子结构可能因温度过高而氧化
破坏，也使含量降低。故提取温度以 70 ℃为宜。
2． 3 正交试验结果分析 由表 2 表明，在正交试验的 4 个
因子中，温度对总黄酮含量的影响最大，时间对总黄酮含量
的影响最小。由极差分析可知，各因素对广玉兰花总黄酮含
量影响的主次顺序为:温度 ＞乙醇浓度 ＞料液比 ＞时间。
图 3 提取时间对总黄酮含量的影响
图 4 提取温度对总黄酮含量的影响
方差分析表明，4个因素中，乙醇浓度和温度达极显著水
平(P ＜0． 01)，提取时间对总黄酮含量的影响极不显著(P ＞
0． 05)。从节约时间、提高效率的角度考虑，应选择较小的水
平。综合上述考虑，确定最佳提取条件为 A2B2C1D2，即乙醇浓
度 70%，料液比 1∶40，提取时间 90 min，提取温度 70 ℃。
2． 4 验证试验 按正交试验确定的最佳提取工艺，进行 3
组平行试验，测得广玉兰花总黄酮含量分别为 4． 926 0%、
4． 867 5%和 4． 894 5%，并计算得总黄酮平均含量为
4． 896 0%，比正交试验结果中所有组的含量都高，而且重现
性好，表明该提取工艺稳定、可行。
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D
总黄酮
含量∥%
1 1 1 1 1 4． 461 4
2 1 2 2 2 4． 701 0
3 1 3 3 3 4． 607 5
4 2 1 2 3 4． 772 7
5 2 2 3 1 4． 647 0
6 2 3 1 2 4． 828 1
7 3 1 3 2 4． 634 0
8 3 2 1 3 4． 597 4
9 3 3 2 1 4． 460 5
K1 13． 769 9 13． 868 1 13． 886 9 13． 568 9
K2 14． 247 8 13． 945 4 13． 934 2 14． 163 1
K3 13． 691 9 13． 896 1 13． 888 5 13． 977 6
Ｒ 0． 555 9 0． 077 3 0． 047 3 0． 594 2
2． 5 总黄酮纯度的测定结果 在正交试验确定的最佳提
取条件下，进行 3 组平行试验，并计算得粗提物中总黄酮纯
度平均为 32． 925%。因提取液中杂质较多，致使总黄酮纯度
(下转第 1485页)
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316 －321．
( 上接第 1367页)
相对较低。如果在实际生产中对产品的纯度要求较高时，可
进一步进行分离纯化操作。
2． 6 广玉兰花总黄酮的抗氧化活性研究 图 5 ～6表明，广
玉兰花总黄酮、VC 和抗氧化剂 TBHQ 对 2 种自由基的清除
率都随浓度的增大而升高，呈明显的量效关系。广玉兰花总
黄酮清除自由基的能力均高于 VC，低于 TBHQ;而当总黄酮
浓度达到0． 709 2 mg /ml时，其抗氧化效果接近于 TBHQ。但
考虑到 TBHQ已经是商品化的抗氧化剂，而广玉兰花总黄酮
只是粗提物，相对来说可以算是具有较强的抗氧化能力。计
算得总黄酮 IC50分别为 0． 381 0和 0． 640 6 mg /ml。
图 5 广玉兰花总黄酮对 O2
－·的清除作用
图 6 广玉兰花总黄酮对·OH的清除作用
3 结论与讨论
广玉兰花总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度为
70%，料液比为 1∶40，提取时间 90 min，提取温度 70 ℃;在该
提取条件下，总黄酮平均含量为 4． 896 0%，总黄酮纯度平均
为 32． 925%。由于提取液中醇溶性杂质种类较多，导致总黄
酮纯度相对较低。如果在规模化生产中对产品的纯度要求
较高时，可进一步进行分离纯化处理。
广玉兰花总黄酮清除 O2
－·和·OH自由基的 IC50值分
别为 0． 381 0和 0． 640 6 mg /ml，其清除能力均高于 VC，低于
抗氧化剂 TBHQ;但当总黄酮浓度达到 0． 709 2 mg /ml 时，其
抗氧化效果均接近于 TBHQ，表明广玉兰花总黄酮对 O2
－·
及·OH有良好的清除作用，用广玉兰花总黄酮替代 TBHQ
作为抗氧化剂使用，能够避免 TBHQ 自身的毒性，因此可作
为一种天然抗氧化剂进行开发利用。
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