全 文 ：工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 07 , 2012
2012年第7期
核桃，原产于近东地区，又称胡桃、羌桃，与扁
桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃
既可以生食、炒食，也可以榨油、配制糕点、糖果等，
不仅味美，而且营养价值很高，被誉为“万岁子”、“长
寿果”。核桃叶含VB、VC、VD、VE、胡萝卜素等丰富的营
养物质与核桃醌、核桃甙、鞣质及黄酮类等生物活性
物质，能防治维生素缺乏症、淋巴结、甲状腺肿大、黄
疸病、结核病等。作为中药还有清热解毒、杀虫止痒
的功效。目前对核桃叶中多酚物质的研究报道较少。
近年来，超声波提取方法由于操作简便快捷、提取温
度低、提取率高、提取物的结构未被破坏等特点，尤
其在热敏性成分的提取中更显出明显的优势，已广
泛用于天然植物的有效成分提取，如苹果渣多酚[1]、
葡萄籽多酚[2]等。为了更好地开发利用核桃叶，本实
验采用超声提取方法，通过单因素实验和响应面实
验对超声作用时间、料液比和乙醇体积分数等因素
进行了研究，并对其含量进行了测定 [3]，以期为综合
利用核桃叶提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
核桃叶 采自甘肃省陇南市，阴干，粉碎，过100
目筛，低温保存；无水乙醇（分析纯） 南京中旭化工
有限公司；没食子酸标准品（色谱纯） 中国药品生
物制品检定所；福林酚试剂 北京索莱宝科技有限公
司（10%的福林酚的配制：准确移取福林酚试剂5mL，
用水定容至50mL的容量瓶中，现配现用）；无水碳酸
钠（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂。
BS210S分析天平 北京赛多利斯天平有限公
王茂生1，梁俊玉2，*，高 莹2，史建军2
（1.中共甘肃省委党校，甘肃兰州 730070； 2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070）
摘 要：首次以陇南核桃叶为原料，运用超声波辅助提取技术对核桃叶中的多酚类物质进行提取，在温度为40℃，超
声功率为110W的条件下，考察了料液比、超声时间、乙醇浓度对多酚提取率的影响，并利用响应面法优化了提取工
艺，得出最佳工艺参数为：料液比为1∶10，超声提取时间为10min，乙醇浓度为70%，在最佳提取工艺的条件下，核桃多
酚的含量可达到4.04mg/g，为核桃叶多酚的进一步开发提供了依据。
关键词：核桃叶，超声波辅助，提取，多酚，响应面法
Study on optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic
compounds from walnut leaf by response surface methodology
WANG Mao-sheng1，LIANG Jun-yu2，*，GAO Ying2，SHI Jian-jun2
（1.The CPC Gansu Provincial Committee Party School，Lanzhou 730070，China；
2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）
Abstract：The optimization of the extraction process of phenolic compounds from walnut leaf under ultrasound
assistance from walnut leaf was achieved by response surface methodology to maximize the content of
phenolic. Methods：On the basis of single-factor experiments，Box-Behnken central composite design involving
three variables at three levels was utilized to set up a quadratic polynomial regression equation for the content
of phenolic as function of ethanol concentration，length of ultrasound treatment time and material/liquid ratio，
and the pairwise interactive effects of the above three variables on their function were investigated by response
surface analysis. The optimum conditions for extracting phenolic compounds from walnut leaf were found to
be：1∶10 material/liquid ratio，10min ultrasound treatment at 110W power for extracting the raw material with 70%
aqueous ethanol solution at 40℃. Under these optimum conditions，the content of polyphenols was 4.04mg/g.
Key words：walnut leaf；ultrasound-assisted；extract；phenolic compounds；response surface methodology（RSM）
中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）07-0311-04
收稿日期：2011－06－07 * 通讯联系人
作者简介：王茂生（1965-），男，硕士，副教授，主要从事体育教学及研
究工作。
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响应面法优化超声辅助提取
核桃叶多酚的工艺研究
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Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第7期
司；JRA-6水浴恒温磁力搅拌水浴锅 金坛市杰瑞
尔电器有限公司；UV-100紫外可见分光光度计 北
京莱伯科技有限公司；药典筛 浙江上虞市水仙纱筛
厂；循环水式真空泵 上海申生科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 提取方法 准确称取10g核桃叶粉末，放入
100mL烧杯中，加入一定浓度和比例的乙醇，搅拌均
匀，然后置于超声仪中，在功率110W，温度40℃的条
件下超声一定时间，抽滤，减压浓缩回收乙醇。将浓
缩液倒入100mL容量瓶，用水定容，待测。
1.2.1.1 时间对提取效果的影响 提取时间对核桃
叶多酚具有重要的影响，为了确定在超声波辅助条
件下的最佳提取时间，本实验在确定提取料液比为
1∶10，乙醇浓度为70%的条件下，以5、10、15、20min四
个不同时间对原料进行提取，得出较优的提取时间。
1.2.1.2 料液比对提取效果的影响 为了确定在超
声波辅助条件下料液比对核桃叶中多酚提取率的影
响，本实验在确定超声时间为10min，乙醇浓度为
70%的条件下，考察1∶8、1∶10、1∶12、1∶14四个不同浓
度对核桃多酚含量的影响，得出较优的料液比。
1.2.1.3 乙醇浓度对提取效果的影响 为了确定在
超声波辅助条件下乙醇浓度对核桃叶多酚提取的影
响，本实验在确定提取料液比为1∶10，超声时间为10min，
乙醇浓度为50%、70%、90%、100%四个不同浓度对
多酚进行提取，得出较优的乙醇浓度。
1.2.2 Box-Behnken实验设计 采用Design-Expert
7.0软件，应用Box-Behnken设计，以核桃叶的多酚含
量为响应值对主要影响因素进行优化，从中筛选提
取核桃叶多酚的最优提取条件。
根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选
定提取时间、料液比、乙醇浓度3个对超声提取有影
响的因素进行单因素实验。在单因素的基础上，确定
响应面实验的因素和水平（见表1）。
1.2.3 多酚含量的测定 多酚含量根据GB/T 8313-
2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测
定[4]。
1.2.3.1 标准曲线的建立 称取没食子酸标准品
0.100g于100mL容量瓶中溶解并定容至刻度，摇匀，
作为储备液。分别移取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL
于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，浓度分别
为20、40、60、80、100μg/mL，作为没食子酸工作液。用
移液管分别吸取没食子酸工作液、水（作空白对照用）
各1mL于10mL容量瓶中，在每个容量瓶中分别加入
5.0mL的10%福林酚试剂（按国标），摇匀。反应5min
内，加入4.0mL Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀，
室温下放置60min。用10mm比色皿，在765nm波长条
件下用分光光度计测定吸光度A。以浓度（μg/mL）为
横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线（如图1），
其线性回归方程为：Y=0.0105X+0.0189，R2=0.9989，
结果表明，吸光度和浓度在其线性范围内呈良好线
性关系，可按标准曲线进行定量分析。
1.2.3.2 样品中多酚含量的测定 将待测溶液稀释
100倍后，取出1mL溶液加入10mL容量瓶中，加入
5.0mL的10%福林酚试剂，摇匀。反应3~8min内，加入
4.0mL Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下放
置60min。用10mm比色皿，在765nm波长条件下用分
光光度计测定吸光度A，将吸光值代入到回归方程，
可得核桃叶中的多酚含量。
2 结果与讨论
2.1 乙醇浓度对提取效果的影响
由图2可知，乙醇体积分数对提取效果影响较
大，随着乙醇体积分数的增加，核桃多酚提取率逐步
提高，但当达到70%之后，核桃叶多酚提取率开始下
降，所以选用乙醇体积分数为70%。
2.2 料液比对浸提效果的影响
表1 Box-Behnken实验设计因素水平
Table 1 Levels and factors of Box-Behnken design
水平 A超声时间（min） B料液比（g:mL） C乙醇浓度（%）
1 15 1∶12 90
0 10 1∶10 70
-1 5 1∶8 50
图1 标准工作曲线
Fig.1 The standard curve of the yield of polyphenols
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
吸
光
度
A
0 20 40 60 80 100 120
没食子酸浓度（μg/mL）
图2 乙醇浓度对核桃叶多酚提取的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content
of polyphenols
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
多
酚
含
量
（
%）
50 60 70 80 90 100
乙醇浓度（%）
图3 料液比对核桃叶多酚提取的影响
Fig.3 Effect of material/liquid ratio on the content of
polyphenols
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
多
酚
含
量
（
%）
1∶8 1∶9 1∶10 1∶11 1∶12 1∶13 1∶14
料液比
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工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 07 , 2012
2012年第7期
从图3可以看出，随着料液比的提高，核桃叶多
酚的提取效果有小幅提高，但当料液比达到1∶10（g∶mL）
之后，核桃叶多酚提取效果有所下降，故选取料液比
为1∶10。
2.3 超声提取时间对浸提效果的影响
从图4可以看出，随着提取时间的延长，提取率
逐渐提高，但当提取时间超过10min后，提取率反而
降低，因此提取时间10min最好。
2.4 提取条件优化
通过单因素实验，选择合理的因素水平进行响
应面实验，以确定最佳的提取条件。核桃叶多酚提取
的Box-Behnken实验结果见表2。
2.5 响应面分析
以A、B、C为自变量，核桃叶多酚的含量Y为响应
值，所得曲线回归方程为：
Y=4.03-0.093A+0.16B-0.38C-0.089AB+0.28AC-
0.11BC-0.58A2-0.61B2-0.63C2
运用Design-Expert软件对17组实验的响应值进
行回归分析，方差分析结果如表3所示，用 F检验判
定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，概率
越小，则相应变量的显著程度越高。
由表4可以看出，模型的决定系数R2=0.9815，修
订系数R2adj=0.9577，变异系数CV=4.32%，这些值表
明，多项式模型的精确性、有效性是合理的。
2.6 各因素交互作用分析
为了进一步考察3个因素的交互作用以及确定
最优点，对回归模型采用降维法分析，即可得到两因
子的回归模型[7-8]，并通过Design-Expert 7.0软件绘制
响应面曲面图来进行直观分析，见图5~图7。图5~图7
分别显示了3组以得率为响应值的趋势图，从响应面
图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度。
极值条件出现在等高线的圆心处，由图可以直观地
看到各因素之间的交互情况，A 与B的等高线图最
圆，说明它们之间相互作用对多酚提取物的提取得
率的影响最小；而等高线图越扁平，表示因素之间的
相互影响越大，A、C 两因素之间的影响最大。
从图5可以看出，随着超声时间的增长，多酚得
率逐渐增大，在10min时出现极值，之后随着时间的
进一步延长，多酚得率逐渐下降；料液比对多酚得率
的影响也呈先增后减的趋势。结果表明，超声时间、
料液比二者的交互影响对多酚得率的影响较小。
从图6可以看出，随着超声时间的增长，多酚得
图4 超声作用时间对核桃叶提取的影响
Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on the content of
polyphenols
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
多
酚
含
量
（
%）
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
时间（min）
表2 Box-Behnken实验设计结果
Table 2 Results of data analysis by Box-Behnken design
实验号 A B C 多酚含量（%）
1 -1 0 1 2.25
2 0 0 0 4.04
3 1 1 0 2.77
4 0 0 0 4.03
5 0 0 0 4.04
6 -1 1 0 3.04
7 1 -1 0 2.82
8 0 0 0 4.03
9 0 0 0 4.04
10 -1 0 -1 3.68
11 0 1 1 2.64
12 0 1 -1 3.49
13 1 0 -1 2.85
14 0 -1 -1 2.75
15 -1 -1 0 2.74
16 1 0 1 2.52
17 0 -1 1 2.32
表3 方差分析
Table 3 Variance analysis
项目 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F 显著性
模型 7.01 9 0.78 41.21 0.0001 ***
A 0.070 1 0.070 3.69 0.0963
B 0.22 1 0.2 11.51 0.0116 *
C 1.16 1 1.16 61.16 0.0001 ***
AB 0.032 1 0.032 1.67 0.2373
AC 0.31 1 0.31 16.20 0.0050 **
BC 0.044 1 0.044 2.34 0.1701
A2 1.43 1 1.43 75.82 0.0001 ***
B2 1.56 1 1.56 82.50 0.0001 ***
C2 1.65 1 1.65 87.16 0.0001 ***
残差 0.13 7 0.019
失拟项 0.13 3 0.044 3026.80 0.0001 ***
净误差 5.824E-005 4 1.456E-005
总离差 7.14 16
注：P<0.05*；P<0.01** ；P<0.001***。
表4 多酚提取率的二次项模型的适合度分度
Table 4 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial
model of extraction of polyphenols
决定系数R2 修订系数R2Adj 标准方差 平均值 变异系数（%）
0.9815 0.9577 0.14 3.18 4.32
图5 超声时间和料液比交互作用的响应面图
Fig.5 Response surface showing the effects of time and
material/liquid ratio on polyphenols yield
4.1
3.725
3.35
2.975
2.6
1.00
0.500.00-0.50
-1.00B：料液比
多
酚
含
量
（
%）
-1.00
-0.500.00
0.50
1.00
A：超声时间
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率由大变小；而随着乙醇浓度的增大，多酚得率也呈
下降趋势。结果表明，超声时间、料液比二者的交互
影响对多酚得率的影响较大。
从图7可以看出，随着料液比的增大，多酚得率
逐渐增大；而随着乙醇浓度的增大，多酚得率呈先增
后减的趋势。结果表明，料液比、乙醇浓度二者的交
互影响对多酚得率的影响较大。
2.7 最佳条件的确定及验证实验
从图5~图7及Design-Expert 7.0软件分析，建立
了以核桃叶多酚提取率为目标值，以超声时间、液料
比和乙醇浓度为因子的数学模型，方差分析表明其
拟合较好。通过对回归方程的优化计算，得到最佳提
取工艺条件：温度40℃、提取时间10min，乙醇浓度
70%、液料比1∶10，多酚的得率可达4.12mg/mL。
在最优条件下对所建立的数学模型做验证实
验，得到多酚化合物的得率为4.04mg/g，达到回归模
型预测的98.06%。
3 结论
首次对甘肃陇南核桃叶中的多酚进行了提取，
运用超声波辅助提取技术加快了提取时间。采用响
应面法建立了以多酚提取率为目标值，以超声时间、
料液比和乙醇浓度为因子的数学模型，方差分析表
明其拟合较好。通过对回归方程的优化计算，得到最
佳提取工艺条件：温度40℃、超声功率110W、超声时
间10min、液料比1∶10、乙醇浓度70%。回归模型可较
好地预测核桃多酚化合物超声辅助提取得率，为开
发利用核桃叶资源提供了依据[9-10]。
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图7 料液比和乙醇浓度交互作用的响应面图
Fig.7 Response surface showing the effects of material/liquid
ratio and ethanol concentration on polyphenols yield
4.2
3.725
3.25
2.775
2.3
1.00
0.500.00-0.50
-1.00C：乙醇浓度
多
酚
含
量
（
%）
-1.00
-0.500.00
0.50
1.00
B：料液比
图6 超声时间和乙醇浓度交互作用的响应面图
Fig.6 Response surface showing the effects of time and
ethanol concentration on polyphenols yield
4.2
3.7
3.2
2.7
2.2
1.00
0.500.00-0.50
-1.00C：乙醇浓度
多
酚
含
量
（
%）
-1.00
-0.500.00
0.50
1.00
A：超声时间
该胶原蛋白肽可以作为天然的保健食品和化妆品的
原料，具有重要的应用价值和较大的开发潜力。
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