全 文 ：海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多糖的提取①
李滢冰　冯梦醒　徐继祖
(杭州商学院食品科学与工程系 , 杭州 , 310035)
摘　要　探索了灰树花深层发酵与多糖提取的工艺 ,并对海藻糖与多糖产生的规律进行了研
究。结果表明 ,以土豆 6%、麸皮浸汁 2%、葡萄糖 1%为培养基 , 在 25℃下培养为灰树花适宜
的培养条件;灰树花多糖提取的最佳工艺参数是:加水倍数 25 ,醇沉浓度 90%;海藻糖累积于
快速生长期之后的稳定期 , 用 37.5℃处理灰树花菌丝体可获较高的产量;灰树花胞内多糖含
量与海藻糖含量同时在稳定期达到最大值。
关键词　灰树花　深层发酵　海藻糖　多糖
　　海藻糖(trehalose)是由 2个葡萄糖分子
通过半缩醛羟基以α-1 , 1键结合的一种非还
原性双糖 ,它结构稳定 ,化学惰性 ,无毒性。
海藻糖的结构见图 1。
图 1　海藻糖的对称结构
据研究报道[ 1] :某些物种对外界恶劣环
境所表现出来的抗逆耐受能力与它们体内的
海藻糖有直接关系;外源性的海藻糖同样对
生物大分子具有保护作用 ,使生物在许多不
利情况下(如干燥 、冷冻)维持细胞的稳定。
海藻糖这些奇妙的特性 ,使其在医药 、食品 、
化妆品 、农业等方面具有广泛的应用前景。
海藻糖的开发已成为国际范围的研究热点。
国外获取海藻糖的主要途径是从酵母与细菌
中提取 ,复杂的生产工艺与昂贵的价格是广
泛应用的最大障碍。目前日本等国用嗜热菌
的酶转化糊精产生海藻糖 ,需要 3步酶促反
应 ,酶要精制 ,培养嗜热菌生产大量的酶目前
有很大的困难。国内对海藻糖的研究刚刚起
步 ,还没有工业化的产品出现 。多途径开发
海藻糖生产源 ,寻找较为经济的生产方法是
一个重要的研究课题。灰树花具有鲜美的口
味和营养价值 ,是一种含有海藻糖 、多糖 、多
种维生素 、微量元素及其它有效活性成分的
食用菌 ,其中海藻糖含量比其它食用菌都要
高[ 2] 。其所含多糖具有抑制肿瘤生长 ,阻止
HIV对 T淋巴细胞的破坏及降血糖保肝等作
用 ,是所有食用菌中最具潜力的免疫调节物 。
但以往获取多糖的主要途径是从子实体中 ,
培养周期长 ,费工费时 ,不利于大规模生产 。
本课题探索了灰树花的液态培养方法 ,并研
究了海藻糖和多糖在灰树花中积累的规律 ,
为今后在生物反应器内综合开发利用食用菌
的海藻糖与多糖资源作了初步的探索 ,取得
了有价值的结果。
1　材料与方法
1.1　菌　种
灰树花(Grifola frondosa)庆元县食用菌
研究所提供。
1.2　仪器设备
WDP 型微生物多用培养箱:山东大学光
机电技术工程公司;LRH-250-G 光照培养
箱:广东省医疗器械厂;电光分析天平 TG-
11　　　　　第 26 卷　第 2期　　李滢冰等:海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多糖的提取
① 第一作者:学士 ,副教授。浙江省科委资助科技计划项目 ,计划编号:981101034收稿时间:1999-07-09 ,改回时间:1999-11-08
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2000.02.004
23813:上海天平仪器厂;721分光光度计:上
海第三分析仪器厂;800型电动离心沉淀器:
龙冈医疗器械厂;热风干燥箱:上海市实验
仪器厂。
1.3　培养基
斜面培养基:PDA 培养基 ,内含 2%琼
脂;液体种子培养基:液体 PDA培养基;基
础培养基(W/V):葡萄糖 5%, 蛋白胨 1%,
KH2PO4 0.2%, MgSO4 0.05%, VB
1
5 mg/
1 000mL , VB
2
2mg/1000mL;碳源:可溶性淀
粉 ,糊精 ,葡萄糖 ,麦芽糖和蔗糖;氮源:酵母
粉 ,蛋白胨 ,氯化铵 ,磷酸铵和尿素;发酵培
养基:土豆 6%,麸皮浸汁 2%,葡萄糖 1%。
1.4　培养法
摇瓶培养:用 250mL 三角瓶装 75mL 培
养基 ,接种量 10%(v/v),培养温度 25℃,用
150 r/min恒温振荡培养 8 d。
1.5　菌丝体干重测定方法
以双层纱布过滤收集菌体 ,蒸馏水冲洗
表面 ,烘干至恒重 ,分析天平称量。
1.6　海藻糖提取方法
用双层纱布过滤 ,收集 75mL 发酵液中
的菌体 ,蒸馏水将表面冲洗干净 , 用 35 mL
0.5mol/L 三氯乙酸(TCA)与其混合后在冰水
中冷浸 20 min , 收集浸提液 , 再加入 35 mL
TCA与菌丝体混合冷浸 20 min ,合并 2次浸
提液 ,待测 。
1.7　海藻糖定量分析方法
高效液相色谱法(HPLC):日本岛津 LC
-4A高效液相色谱仪;SPB-2AS 处理机处
理数据 ,检测器:示差析光;柱子:氨基柱 ,
洗脱液:75%乙腈。
1.8　多糖的提取方法
工艺流程:菌丝体 ※加水煮沸浸提※过
滤※浓缩※醇沉※复溶※测定
将提取海藻糖后的菌丝体加 25倍水 ,用
沸水浴提 4 h ,过滤后滤液蒸发浓缩至 4 ～ 5
mL ,加 4倍 90%的乙醇 ,冰箱内(4℃)静置过
夜醇沉。离心去上清液后用 90%乙醇洗涤 2
次 ,再去上清液 ,将粗多糖沉淀物用热水溶解
后定容至 100mL ,再取 10mL定容至 100mL。
1.9　多糖总量的测定
采用酚-硫酸法以葡萄糖为标准品 。
2　结果与讨论
2.1　灰树花液态培养的研究
2.1.1　碳源的筛选
在基础培养基中 ,分别以 5%(w/v)的蔗
糖 、麦芽糖 、糊精及可溶性淀粉代替葡萄糖 ,
摇瓶培养后测定菌体的干重。结果见表 1。
表 1　碳源对菌丝体生长的影响
碳源 5%(w/v) 菌体干重/mg·mL -1
葡萄糖 11.7
蔗糖 8.3
麦芽糖 9.1
糊精 10.8
淀粉 -
淀粉 4%　葡萄糖 1% 11.1
注:-表示生长不良 ,下同。
结果显示 ,灰树花对葡萄糖 、蔗糖 、麦芽
糖 、糊精均能很好利用 。在以淀粉为唯一的
碳源的培养基中 ,灰树花生长缓慢 。在淀粉
的培养基中加入少量葡萄糖作为菌体生长的
碳源 ,灰树花可以有效的利用淀粉 。
2.1.2　氮源的筛选
在基础培养基中分别添加各种可溶性氮
源代替蛋白胨 ,浓度为 1%,摇床培养测定菌
丝体干重 ,结果见表 2。
表 2　氮源对菌体生长的影响
氮源 1%(w/ v) 菌体干重/mg·mL -1
蛋白胨 10.9
酵母粉 11.5
氯化铵 -
磷酸铵 -
尿素　 -
结果显示 ,灰树花能很好的利用有机氮
源 ,对无机氮源利用不佳 。
2.1.3　发酵培养基的选择
在大规模工业化生产中 ,为了降低成本 ,
提高得率 ,可选用天然来源 ,价格低廉 ,营养
12 食品与发酵工业　　Food and Fermentation Industries　　Vol.26　No.2　　　　　
更为丰富的农副产品作为培养基原料。从以
上实验中可以看出 ,少量添加葡萄糖有利于
灰树花对淀粉的利用 ,据此结论及参阅有关
资料 ,设计以下 6种培养基进行实验。摇瓶
培养测定菌体干重。结果见表 3。
表 3　发酵培养基对菌体干重的影响
实验号 培养基 菌体干重
mg·mL -1
1 土豆 3%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 9.8
2 土豆 6%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 12.9
3 玉米粉 2%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 10.1
4 玉米粉 4%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 11.3
5 淀粉 2%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 8.8
6 淀粉 4%+麸皮浸汁 2%+葡萄糖 1% 11.2
选用 2号培养基为发酵培养基 ,进行以
下实验。
2.1.4　温度的影响
分别以 20 、25 、30 ℃恒温振荡培养灰树
花8 d以后称干重。结果见图 2。
图 2　温度对菌体生长的影响
从图 2中可以看出 ,灰树花菌丝体在 25
℃是最适的生长温度 ,温度过高或过低均不
利于菌体生长。
以下实验均采用 25 ℃培养。
2.2　海藻糖的生成
2.2.1　海藻糖产生规律
采用发酵培养基摇瓶培养 ,按培养时间
顺序测定菌丝体干重与海藻糖的含量。结果
见图 3及表 4。
　　从图 3中可以看出 ,在菌丝体的快速生
长期海藻糖呈下降趋势 ,第 6 d 降至最低值。
海藻糖积累于快速生长期之后的稳定期 ,第
10 d达到最大值 。菌体生长进入衰亡期后 ,
海藻糖含量迅速下降 。
图 3　菌体生长与海藻糖含量关系
表 4　培养时间与菌体干重及海藻糖含量关系
培养天数/d 2 4 6 8 10 12
菌体干重
mg·mL -1 4.87 7.03 10.31 12.91 12.95 12.30
海藻糖含量
mg·mL -1 0.28 0.23 0.16 1.04 1.29 0.30
百分含量
% 5.75 3.27 1.55 8.05 9.96 2.49
在真菌细胞中既有合成海藻糖的酶 ,也
有分解海藻糖的酶[ 3] 。海藻糖在菌体内的积
累取决与海藻糖合成酶的活力 ,同时也受海
藻糖分解酶分解作用的影响。所以海藻糖含
量是由合成与分解代谢的平衡调节的 ,这种
平衡随着生长周期 、营养和环境条件而发生
变化 。海藻糖水解酶包括中性海藻糖酶和酸
性海藻糖酶[ 4] 。中性海藻糖酶存在于细胞质
中 ,分解细胞合成的海藻糖 ,在细胞生长的不
同周期有不同活力 ,并受到 cAMP 的调节 。
酸性海藻糖酶存在与周质空间中 ,它是非调
节酶 。中性海藻糖酶的活性在对数期高而在
稳定期低 。据实验结果可推测灰树花菌体内
含有中性海藻糖酶 ,因此使海藻糖在稳定期
得以积累 。
2.2.2　各种处理方法对海藻糖积累的影响
有资料显示[ 5] ,当营养细胞遭受各种压
力时 ,如饥饿 、高温 、冷冻 、干燥时 ,将显著影
响胞内海藻糖的积累。故设计 3种方法对灰
树花菌丝体进行处理 。每种方法处理 75mL
已培养8 d灰树花菌丝体 3瓶 ,结果取其平均
值。见表 5。
结果表明 ,经饥饿法处理的灰树花菌丝
体内海藻糖含量明显下降;干燥法处理菌丝
体内海藻糖含量基本不变;高温法处理的菌
13　　　　　第 26 卷　第 2期　　李滢冰等:海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多糖的提取
丝体内海藻糖含量上升。
表 5　各种处理方法对海藻糖累积的影响
名称 处理方法 海藻糖含量占菌体干重百分比/ %
对照 未处理 9.9
干燥法 纱布过滤除去培养基 , 40℃烘干 6h 9.8
饥饿法
纱布过滤 , 蒸馏水冲洗 ,
每瓶加入生理盐水至 75
mL继续培养 6h
3.1
高温法 直接放入 37.5℃,培养箱静置培养 6h 15.2
分析原因:在饥饿法中海藻糖可作为碳
水化合物的储存物糖原 ,供给菌体能量而被
消耗掉。由于干燥法处理对象是处于稳定期
已积累了海藻糖的菌丝体 ,处理结果对菌丝
体生长不发生影响 ,干燥脱水使酶促反应无
法进行 ,故菌丝体的海藻糖含量无变化。高
温法结果说明 ,灰树花的最适生长温度与积
累高产量海藻糖所需的温度有差异 ,较低的
温度(25 ℃)对菌丝体的生长发育有利 ,当菌
体量积累到一定程度 ,提高温度有利于海藻
糖的生成与积累 。随着温度的上升 ,海藻糖
合成酶的活力上升 ,结果导致海藻糖含量增
高。据报道灰树花海藻糖合成酶的最适温度
为37.5 ℃[ 6] ,故选择此温度进行高温处理 。
2.3　多糖的提取
2.3.1　菌丝体多糖最佳提取条件的选择
采取 75mL 发酵培养基在最适条件下生
长了8 d 的灰树花菌丝体。选择加水倍数 ,
提取时间和醇沉浓度 3项为考虑因素 ,各取
3个水平 ,进行正交实验以确立多糖提取条
件。见表 6 ,表 7。
表 6　菌丝体多糖提取的实验因素水平
A B C
加水倍数/倍 浸提时间/ h 醇沉浓度/ %
1 15 2 70
2 20 4 80
3 25 6 90
　　结果表明 ,加水倍数(A)对多糖得率有
显著的影响;醇沉浓度(C)对多糖得率有影
响;而提取时间(B)在所选的3个水平上对多
糖得率影响微弱 。所以确定灰树花菌丝体
表 7　菌丝体多糖提取的正交实验结果
A/倍 B/h C/ % 多糖得率/mg
1 　 15 　　2 　 70 19.5
2 15 4 80 23.5
3 15 6 90 26.0
4 20 2 90 28.5
5 20 4 70 25.0
6 20 6 80 30.0
7 25 2 80 31.5
8 25 4 90 34.0
9 25 6 70 28.5
K1 69.0 79.5 73.0
K2 83.5 82.5 85.0
K3 94.0 84.5 88.5
k1 23.0 26.5 24.3
k2 27.8 27.5 28.3
k3 31.3 28.2 29.5
R 8.3 1.7 5.2
多糖提取工艺最佳参数为:加水倍数 25倍;
醇沉浓度 90 %;浸提时间可根据生产情况选
取适合的参数 。
2.3.2　灰树花产生海藻糖与多糖之间的动
态关系
对提取了海藻糖后的灰树花菌丝体 ,按
照以上最佳提取工艺参数进行多糖的提取 ,
按培养时间顺序测定菌丝体中多糖含量 。结
果见表 8 ,图 4。
表 8　培养天数与多糖 、海藻糖含量的关系
培养天数/d 2 4 6 8 10 12
多糖含量
mg·mL -1 0.24 0.31 0.39 0.55 0.61 0.49
海藻糖含量
mg·mL -1 0.28 0.23 0.16 1.04 1.29 0.30
图 4　海藻糖与多糖高峰期的相关性
14 食品与发酵工业　　Food and Fermentation Industries　　Vol.26　No.2　　　　　
　　结果表明 ,灰树花菌丝体多糖的含量在
快速生长期随菌丝体生物量的增多而增加 ,
到达稳定期时出现多糖含量的高峰期。从图
4可看出 ,海藻糖与多糖的积累都在稳定期
达到最大 。据此可以对灰树花菌丝体进行综
合地利用 ,在稳定期同时提取海藻糖与多糖。
3　小　结
(1)灰树花液态培养的适宜培养基为
(w/v):土豆6%,麸皮浸汁 2 %,葡萄糖 1 %,
适宜培养温度为 25 ℃。
(2)海藻糖累积于快速生长期之后的稳
定期 ,其提取易在稳定期 。
(3)高温法处理可提高菌丝体内海藻糖
的含量 ,其含量可提高至灰树花菌丝体干重
的15.2%。
　　(4)灰树花胞内多糖的含量与海藻糖含
量同时在稳定期达到高峰 ,据此可综合利用
灰树花菌丝体 ,在提取海藻糖的同时提取多
糖。
参　考　文　献
1　程池.食品与发酵工业 , 1996 , 22(1):59 ～ 64
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3　Johan M T.Microbiol.Reviews , 1984 , 48(1):42
～ 59
4　Joao A J , Maria D L , Polizeli T M et al.FEMS
Microbiology Letter , 1997 , 154:165～ 171
5　Carmen L A P , Anita D P.Biotecnology Annual
Review , 1996 , 2:293 ～ 314
6　Koki S , Toshiy a K , Eiichi T et al.Applied and
Environmental Microbiology , 1998 , 64(11):4340 ～ 4345
Trehalose Accumulation by Submerged Fermentation
of Grifola frondosa and Extraction of Polysaccharide
Li Yingbin　Feng Mengxing　Xu Jizu
(Department of Food Science and Engineering , Hangzhou Institute of Commerce , Hangzhou , 310035)
ABSTRCT　Technologies of the submerged fermentation of Grifola frondosa and extracting polysaccha-
ride , and the regulation of producing trehalose and polysaccharide were studied.The results showed that
the adequate cultural conditions were :taking potato 6%, wheat bran 2%, glucose 1% as medium and
the cultural temperature being 25℃;the optimum conditions of extracting polysaccharide from Grifola
frondosa were:diluted 25 times , the concentration of alcohol as sedimenting medium being 90%.The
results also showed that the trehalose could be accumulated in the stability phase after growth phase and
the trehalose with higher productivity could be acquired by treating Grifola frondosa at 37.5 ℃.The
peaks of producing polysaccharide and trehalose concurrently appeared in the stability phase.
Key words　Grifola frondosa , submerged fermentation , trehalose , polysaccharide
启　示
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《食品与发酵工业》编辑部
2000年 3 月
15　　　　　第 26 卷　第 2期　　李滢冰等:海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多糖的提取