全 文 ：灰树花中一种抗烟草花叶病毒的
蛋白质的纯化及其性质＊
陈 　宁1)　吴祖建＊＊　林奇英 　谢联辉
(福建农林大学植物病毒研究所 , 农药生物化学教育部重点实验室 , 福州 350002)
摘要　通过硫酸铵分级沉淀 、 阴离子交换柱层析及凝胶过滤柱层析 , 从灰树花子实体中分离到了一种具有抑制
烟草花叶病毒 (TMV)侵染活性的热稳定蛋白———GFAP.经常规凝胶电泳和等电聚焦电泳显示为单一条带 , 而
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明该蛋白质含有两个亚基 , 其分子质量分别为34 ku、 40 ku.等电聚焦测定蛋白
质 pI 为 3.76 , 含糖量约为 2%.GFAP的 40 ku 条带 N 端氨基酸序列为 ACCVPSVTEFENAINSDPVM , 将其与
GenBank中的氨基酸序列检索比较后没有发现同源序列 , 预示可能为一新的氨基酸序列.GFAP 与 TMV 混合接
种心叶烟 , 当 GFAP 浓度为 32 mg/ L 时即可完全抑制浓度为 10 mg/ L的 TMV的侵染 , 而 4 mg/ L的 GFAP 对浓
度为 40 mg/ L的 TMV 的抑制率仍可达 60%以上.
关键词　灰树花 , 抗病毒蛋白 , 纯化 , 理化性质
学科分类号　Q94
　　植物病毒病是农业生产上的一类重要病害 , 由
于病毒对寄主的绝对寄生性 , 植物病毒病的防治一
直是病毒学研究中的难点和重点.20世纪 60年代
就有报道说食用菌的浸提物或深层发酵液有抗植物
病毒活性[ 1 , 2] , 孙慧等[ 3]曾报道过几种食用菌蛋白
对烟草花叶病毒的抑制效果 , 认为食用菌中的蛋白
质具有抑制烟草花叶病毒侵染的作用.但迄今只有
少数食用菌的几种抗病毒蛋白被纯化[ 4 , 5] .我们从
食用菌灰树花中提纯到一种抗 TMV 侵染的蛋白
质 , 并对其部分性质进行了研究.
1　材料与方法
1.1　材料
　　灰树花 (Gri fola frondosa)购于福州市绿健
食用菌商行.DEAE-Sepharose、 Sepharose-6B 为
Pharmacia公司产品;蛋白质电泳分子质量标准为
上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品;丙烯酰
胺 、 甲叉双丙烯酰胺 、 SDS为上海生工生物工程有
限公司产品 , 其他试剂为分析纯.烟草花叶病毒
(Tobacco mosaic virus , TMV)由本所纯化 , 并保
存在-70℃超低温冰箱中.
1.2　方法
1.2.1　灰树花子实体粗提液的制备:灰树花干子
实体粉碎 , 蒸馏水浸提 10 h , 四层纱布过滤 ,
10 000 g 离心 10 min , 上清液中加入固体硫酸铵
至 45%的饱和度 , 放置过夜.10 000 g 离心 10
min , 往上清液中加入硫酸铵使饱和度增至 90%,
同上处理 , 弃上清 , 沉淀物用最小体积的蒸馏水溶
解 , 对蒸馏水透析脱盐 , 浓缩 , 以上各步骤均在
4℃下进行.
1.2.2　蛋白质的提纯:将粗提液经离子交换柱层
析 、凝胶过滤柱层析后得到纯化的灰树花抗病毒蛋
白 (Gri fola frondosa antiviral pro tein , GFAP).
1.2.3　蛋白质含量测定:按 Bradford 方法测定 ,
以牛血清白蛋白作标准对照绘制标准曲线.
1.2.4　含糖量计算:参照酚-硫酸法[ 6]进行 , 以葡
萄糖为计算标准.
1.2.5　电泳分析:纯度的鉴定采用聚丙烯酰胺凝
胶常规电泳 , 分子质量及等电点的测定参考文献
[ 7 , 8] .
1.2.6　GFAP 抗 TMV 侵染活性测定:采用半叶
法 , 用蒸馏水及等体积的系列浓度 GFAP 蛋白溶
液分别与浓度为 10 mg/L 病毒液等量混合接种在
枯斑寄主的左 、右半叶上 , 每个样品接种 5 ～ 6片
　＊高等学校骨干教师资助计划 (2000-65).
　＊＊通讯联系人.
　1)厦门出入境检验检疫局 , 厦门
　Tel:0591-3722825 , Fax:0591-3769704
　E-mail:wuzujian@126.com
　收稿日期:2003-08-06 , 接受日期:2003-10-13
·283·2004;31 (3)　　 　　 　　　生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
叶 , 待出现明显枯斑后 , 及时记录枯斑数 , 取平均
值.抑制率/ %= [ 1- (处理的枯斑数/对照的枯
斑数)] ×100[ 9] .
1.2.7　40 ku亚基 N 端氨基酸序列分析:SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)后去除浓缩胶.
将凝胶和硝酸纤维素 (NC)滤膜分别在转移缓冲
液中浸泡 20 min , 采用 Bio-Rad公司的M ini Trans-
Blo t Cell装置 , 以 200 mA 稳流 1 h 将蛋白质从凝
胶电转移到 NC 膜上.将滤膜置于 100%甲醇中润
湿几秒后在染色液中浸泡 1min , 50%甲醇脱色至
蛋白质条带清楚显现并在超纯水中漂洗后自然晾
干.40 ku亚基 N 端氨基酸序列测定由湖南师范大
学蛋白质化学研究室完成.
1.2.8　TMV 的提纯和定量:按 Gooding 方法[ 10]
提纯 , 略加修改.经 200 ～ 300 nm 紫外扫描确定
其纯度及浓度.
1.2.9　温度对 GFAP 抗 TMV 侵染活性的影响:
将 7份纯化的 GFAP 用蒸馏水稀释至 4 mg/ L , 分
别 在 40℃、 50℃、 60℃、 70℃、 80℃、 90℃、
98℃水浴处理 10 min , 取出后立即放在冷水中冷
却 , 与等量的 10 mg/ L提纯 TMV 混合后立即半叶
法接种心叶烟 , 计算抑制率.
2　结　　果
2.1　GFAP的分离和纯化
2.1.1　离子交换柱层析:蛋白质浓缩后 , 装入透
析袋 , 4℃下在 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)缓
冲液 中充分透析.透析后的 样品上样于 经
0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)缓冲液充分平衡的
DEAE-Sepharose (1.6 cm ×15 cm)层析柱 , 用
200 ml含 0 ～ 1 mol/L NaCl作线性梯度洗脱 , 经
280 nm紫外检测(图1),收集各蛋白质吸收峰 ,
Fig.1　Ion exchange chromatography of protein
crude extract on DEAE-Sepharose column
并用半叶法测定其抗 TMV 侵染的活性.结果发
现 , 图 1中的峰 2 (40 ～ 47管)含抗 TMV活性的
蛋白质 , 合并 40 ～ 47号管进行下一步的纯化.
2.1.2　凝胶过滤柱层析:经离子交换柱层析分离
后的活性级分经脱盐 、 浓缩 , 4℃下在 0.01 mol/L
T ris-HCl (pH 7.2)的缓冲液中充分透析 , 上样于
经同种缓冲液充分平衡的 Sepharose 6B (1.6 cm×
70 cm)层析柱 , 然后用缓冲液淋洗 , 经280 nm 紫
外检测 , 结果见图 2.收集各蛋白质吸收峰 , 并测
定其抑制 TMV 侵染的活性.结果发现图 2中的峰
3 (28 ～ 32管)具有抗 TMV 侵染的活性.合并 28
～ 32管 , 4℃下在蒸馏水中透析 48 h , 其间换水 2
～ 3次 , 再用聚乙二醇 20000浓缩 , 得到灰树花抗
病毒 蛋 白 (Grifola frondosa antiviral pro tein ,
GFAP).
Fig.2　Gel filtration chromatography on Sepharose 6B
2.2　纯度 、 分子质量 、等电点 、含糖量测定
　　从聚丙烯酰胺凝胶常规电泳图 (图 3)和等电
聚焦凝胶电泳图 (图 4)中可以看出 , 染色后 , 纯
Fig.3　The native polyacrylamide gel electrophoresis
1:Purified by DEAE-Sepharose;2 ～ 4:Purif ied by Sepharose 6B.
·284· 生物化学与生物物理进展　 　 Prog.Biochem.Biophys.　　　　　　　　 2004;31 (3)
Fig.4　Isoelectric focusing of GFAP
Fig.5　Molecular mass of GFAP by SDS-PAGE
1:Protein molecular mass marker;2:GFAP.
化样品显示一条均一的蛋白质条带 , 说明 GFAP
已达到电泳纯.经等电聚焦电泳测定 (图 4), pI
为 3.76 , 说明 GFAP 是一种酸性蛋白.从 SDS-
PAGE (图 5)中可以看出 , GFAP 具有两个亚基 ,
其分子质量分别为 34 ku 、 40 ku.由酚-硫酸法测
得含糖量约为 2%.
2.3　温度对 GFAP抗 TMV侵染活性的影响
　　将温度对抑制率作图 (图 6), 从图 6中可以看
出 , 在 80℃水浴10 min后GFAP仍可保持约80%的
活性 , 这和未经热处理的蛋白抗 TMV 活性接近 ,
而经 90℃和 98℃水浴 10 min后 , 抗 TMV的活性才
迅速下降 , 这说明 GFAP为一个热稳定性蛋白.
Fig.6　Thermal stability of GFAP
2.4　GFAP抗 TMV侵染活性测定
将浓度为 1 g/L 的GFAP纯蛋白按倍比稀释成
2
-2 ～ 2-9 g/L , 分别与浓度为 10 mg/L 的 TMV等量
混合 , 半叶法接种心叶烟 , 计算抑制率.结果见表1.
Table 1　The minimum effective concentration of GFAP at 10 mg/ L
ρ(GFAP)/ (g·L -1) 0.25 0.125 0.063 0.032 0.016 0.008 0.004 0.002
Inhibit ing rat io/% 100 100 100 100 98.8 96.3 82.8 42.6
　　从表 1可以看出 , 当 GFAP 浓度为 32 mg/L
时即可完全抑制浓度为 10 mg/L TMV 的侵染 , 而
GFAP浓度为 4 mg/L 时 , 对 10 mg/L TMV 的侵
染抑制率仍可达 80%以上.
将浓 度为 4 mg/L 的 GFAP 蛋白 分别 与
20 mg/L 、
Table 2　The maximal repressed concentration of TMV at
4 mg/ L GFAP
ρ(rep ressed TM V)
/ (mg·L-1) 20 30 40 50
Inhibiting ratio/ % 88.9 77.8 63.9 14.0
30 mg/L 、 40 mg/L 、 50 mg/L 的 TMV 等量混合 ,
半叶法接种心叶烟 , 计算抑制率.结果见表2.
　　从表 2可以看出 , 4 mg/L 的 GFAP 对浓度为
40 mg /L TMV的抑制率仍可达 60%以上.
　　以上结果说明 GFAP是一种有效的抗 TMV 侵
染的蛋白.
2.5　GFAP的 40 ku亚基 N端氨基酸序列分析
GFAP 的 40 ku 亚基 N 端氨基酸序列为:
ACCVPSV TEFENAINSDPVM.经 GenBank 蛋白
质序列检索 , 没有找到同源序列.
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3　讨　　论
已有多种抗植物病毒蛋白从植物中提纯出来 ,
并已用于抗病毒植物基因工程的研究.从食用菌中
提纯的抗植物病毒的蛋白质还很少.Kobayashi等[ 4]
从香菇中提纯出一种抗 TMV 侵染的蛋白质———
FBP , 是一种碱性单亚基蛋白质 , 分子质量为
22 ku , 含糖量低于 0.1%.孙慧等[ 5] 从杨树菇中提
纯到一种抗 TMV 侵染酸性蛋白-AAVP , 分子质量
为15.8 ku , 也是单亚基蛋白质.FBP 和AAVP 中都
没有Cys.我们从灰树花的子实体中提纯出这种抑制
TMV 侵染的蛋白质 ———GFAP , 含糖量为 2%, 含
有两个亚基 , 为酸性蛋白 , 其等电点与AAVP 相近.
从GFAP的 40 ku亚基 N端氨基酸序列分析结果中
可以看出 , GFAP 中含有 Cys.GFAP 是一种热稳定
性蛋白质 , 它可以耐受 80℃高温.从灰树花中提纯
出抗病毒蛋白尚属首次报道.GFAP的 40 ku亚基 N
端氨基酸序列在GenBank中没找到同源序列.
参　考　文　献
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Sun H , Wu Z J , Lin Q Y , et a l.Microorganism Pest icide and
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Purification and Partial Characterization of a Protein Inhibitor of
Tobacco mosaic virus Infection From The Maitake(Grifola frondosa)＊
CHEN Ning1), WU Zu-Jian＊＊ , LIN Qi-Ying , XIE Lian-Hui
(Key Laboratory of Pest icide and Biochem istry , Ministr y o f Educa tion ,
Inst itute of Plant Virology , Fujian Agriculture and Forest ry U niversity , F uzhou 350002 , China)
Abstract　A heat stable pro tein , named GFAP , was isolated and purified from the fruiting bodies of edible
fungus Grifola frondosa by a procedure of (NH4)2SO4 precipi tation , and ion-exchange chromatography on
DEAE-Sepharose column and gel filtration on Sepharose-6B column.Acco rding to PAGE and IEF , GFAP had a
single band with p I 3.67.And it consisted of tw o subunits of 34 ku and 40 ku when encounted by SDS-PAGE.
GFAP is identified as a glycoprotein containing 2% sugar.The N-terminal amino acid sequence of the 40 ku
subuni t is ACCVPSV TEFENAINSDPVM , which has no homology w ith other sequences in GenBank.GFAP
possesses the inhibi tory activi ty ag ainst the infection of Tobacco mosaic v irus.When mixed w ith TMV (10 mg/
L)and inoculated in local lesion host , Nicotiana glutinosa , GFAP was able to completely inhibit the infect ion
of TMV , and with TMV (40 mg/ L), it st ill had an infection effect of higher than 60% at the concentrat ion
of 4 mg/L.
Key words　Maitake , antiviral pro tein , purificat ion , characterization
　＊This work was supported by Foundat ion for Universi ty Key Teacher by The Ministry of Education(2000-65).
　＊＊Corresponding author.1)Xiamen Ent ry &Exit Inspect ion and Quarant ine Bureau , China.
　Tel:86-591-3722825 , Fax:86-591-3769704 , E-mai l:w uzujian@126.com
　Received:August 6 , 2003　　Accepted:October 13 , 2003
·286· 生物化学与生物物理进展　 　 Prog.Biochem.Biophys.　　　　　　　　 2004;31 (3)