全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.4
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核桃仁种皮多糖的提取及抑菌作用的研究

刘安军，王玥玮，朱振元，王妍，陈影
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
摘要：本文以 0.25 mol/L 的 NaOH-乙醇溶液作提取剂，从核桃仁种皮中提取多糖，提取液经去脂、去蛋白、醇析后得粗多糖
WKPP-70。利用 DEAE-Sephadex A-25 凝胶柱和 Sephadex G-75 凝胶柱对粗多糖进行分离纯化，得纯多糖WKPP-70-1-1。通过紫
外光谱分析证明其纯度，红外光谱分析显示其具有多糖类的特征吸收峰。抑菌试验表明，WKPP-70-1-1 对大肠杆菌、沙门氏菌、枯
草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌均有一定的抑制作用。
关键词：核桃仁种皮；多糖；提取；纯化；抑菌作用
文章篇号：1673-9078(2010)4-362-365
Extraction and Antimicrobial Activities of Polysaccharide from Walnut
Kernel Pellicle
LIU An-jun, WANG Yue-wei, ZHU Zen-yuan, WANG Yan, CHEN Ying
(College of food science and biotechnology, TianJin University of Science and Technology, TianJin 300457, China)
Abstract: Crude polysaccharide, WKPP-70, was extracted from walnut kernel pellicle, using 0.25 mol/L NaOH-ethanol. After removal of lipids
and proteins, WKPP-70 was further purified by chromatography on DEAE-Sephadex A-25 and Sephadex G-75 columns. The purity of the obtained
polysaccharide, named as WKPP-70-1-1 was determined using UV spectrophotometric method and its structure was analyzed by infrared spectrum (IR).
The antimicrobial activities of WKPP-70-1-1 against E.scherichia coli, Bacillussubtilis, Staphy lococcus aureus and SalmonellaTyphimurium were also
evaluated. The results showed that WKPP-70-1-1 had antimicrobial activities against these examined microorganisms.
Key words: Walnut kernel pellicle; polysaccharide; extraction; purification; antimicrobial activity

核桃( Juglans regia. L) 又名胡桃、羌桃，属胡桃科
胡桃属植物[1]。目前，国内外对于核桃的研究和加工利
用主要是在核桃仁方面，核桃仁含多种维生素，富含
蛋白质、脂肪和生理活性物质，一般是直接食用，也
可加工成核桃乳、核桃油、核桃粉等。但是对于核桃
仁种皮却鲜有报道，一般在加工核桃产品的时候这部
分会被去除。近些年, 多糖的生物活性已逐渐被人们认
知，是生命物质的重要组成成分，具有多种生物活性
包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、
抗菌抗病毒、保护肝脏等[2]。相关文献报道，核桃仁种
皮中含有糖类物质。因此，我们选取核桃仁种皮为原
料进行开发与研究。
基于上述原因，本文对核桃仁种皮中的多糖类物
质进行提取、纯化，并对其抑菌效果作了初步研究，
为核桃仁种皮的综合利用提供了理论依据。

收稿日期：2009-9-19
作者简介：刘安军（1963-）男，河北唐山人，教授，博士生导师，主要从
事畜产（副产）品高附加值的开发利用及功能性食品研究等
1 材料与方法
1.1 材料
核桃（购于天津王顶堤批发市场，产地天津）；
供试菌种：大肠杆菌(E.scherichia coli)、枯草杆菌
(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphy lococcus
aureus) 和沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)，天津科
技大学功能性食品实验室提供。
1.2 仪器和药品试剂
HW·SY 系列电热恒温水浴锅、RE-52AA 旋转蒸
发仪、DZF-6020 真空冷冻干燥机、SHB-III 型循环水
式多用真空泵、TH-300 梯度混合器、DBS-100 电脑
全自动部分收集器、TGL-16B 台式离心机、ESJ205-4
型电子天平、SP-2102UV 紫外可见分光光度计、
VECTOR22 傅立叶变换红外光谱仪、BCM-1000A 型
生物洁净工作台、电热恒温培养箱。
DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-75，均为鼎国
生物公司产品，氢氧化钠、盐酸、乙醇、乙酸乙酯、
氯仿、正丁醇、氯化钠、浓硫酸、苯酚，均为分析纯。
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2010.04.004
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1.3 核桃皮多糖的提取
1.3.1 提取
将核桃仁用水浸泡至可以用手剥下核桃仁种皮，
将核桃仁种皮自然晾干，备用。取核桃仁种皮 50 g，
浸泡在600 mL 0.25 mol/L的NaOH-乙醇溶液中，40 ℃
恒温水浴锅中浸泡 18 h，弃去上清，用无水乙醇清洗
2 次，用 200 mL 蒸馏水浸泡残渣 1 h，重复 2 次，抽
滤收集水溶液，用 1 mol/L 的 HCl 调 pH 至中性，55 ℃
旋蒸浓缩至体积 100 mL。
1.3.2 去脂
向粗多糖浓缩液中加入100 mL乙酸乙酯，搅拌均
匀，置于分液漏斗中静置分层，以分离脂溶相和水溶
相，留水溶相作进一步分析。
1.3.3 除蛋白
采用savage法去除蛋白质[3]。
1.3.4 醇析
在去蛋白后的液体中加无水乙醇使乙醇的体积分
数达70%，搅拌5 min，5000 r/min 离心15 min。将沉
淀冷冻干燥，得核桃仁种皮粗多糖(WKPP-70)。
1.4 核桃仁种皮多糖的纯化
1.4.1 DEAE Sephadex A-25 凝胶柱层析法分离纯化
将WKPP-70 配成30 mg/mL的溶液，溶液经
DEAE Sephadex A-25(2×40 cm)柱层析，苯酚-硫酸法
检测多糖分布，绘制洗脱曲线，收集多糖峰洗脱液，
透析、浓缩、冷冻干燥，得到纯化后的样品WKPP-70-1。
柱分离条件：上样2 mL，上样完毕后以蒸馏水和
0.5 mol/L NaCl梯度洗脱，洗脱液流速为10 mL/h，收
集洗脱液时收集器控制为30 min/管，收集60管。
1.4.2 Sephadex G-75凝胶柱分离纯化
将WKPP-70-1配成10 mg/mL的溶液，溶液经
Sephadex G-75 (1.6cm×60cm)柱层析，苯酚-硫酸法跟
踪检测糖含量，绘制洗脱曲线，收集多糖峰洗脱液，
透析、浓缩、冷冻干燥，得到纯化后的样品
WKPP-70-1-1。
柱分离条件：上样2 mL，上样完毕后以三蒸水
洗脱，洗脱液流速为18 mL/h，收集洗脱液时收集器控
制为30 min /管，收集40管。
1.5 紫外光谱分析
将WKPP-70-1-1配成100 μg/mL的水溶液，于
200~1000 nm进行全波长扫描。
1.6 红外光谱分析
分别将1.0~1.5 mg干燥的纯多糖WKPP-70-1-1于
KBr混合压片于4000~400 cm-1红外光谱仪扫描。
1.7 多糖含量的测定
1.7.1 葡萄糖标准曲线的制作
采用苯酚—硫酸法绘制标准曲线[4]。精密量取0.1
mg/mL的葡萄糖标准品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、
0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 于试管中，不足1 mL管用蒸
馏水补足至1 mL，各管再加入6%苯酚溶液1.0 mL，混
匀，迅速加入5 mL浓硫酸摇匀，静置10 min后在30 ℃
水浴中加热20 min，取出冷却至室温。在490 nm处测
定吸光度，以葡萄糖的量(C，μg/mL)为横坐标，以吸
光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理得线性
回归方程。
1.7.2 样品糖含量的测定
分别精密称取WKPP-70和WKPP-70-1-1 10 mg定
容至100 mL，即浓度为0.1 mg/mL。同样用苯酚硫酸
法测定样品在490 nm 处的吸光度值。
多糖含量＝X/W×100%
其中：X 为多糖质量(μg)，W 为供试品的质量(μg)。
1.8 核桃仁种皮多糖抑菌试验
1.8.1 细菌培养基的制备[5]
牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000 mL，
pH 7.0-7.2 (配制固体培养基需加入20 g琼脂)，分装，
在0.1 MPa下高压灭菌20 min，备用。
1.8.2 菌种的活化与菌悬液的制备[6,7]
取试管若干，装入溶化的培养基，灭菌后摆成斜
面。在无菌条件下用划线法将供试菌种接入到斜面培
养基上，然后在适宜的温度条件下于培养箱中培养活
化（温度37 ℃，时间24 h）。然后分别挑取一环已活
化好的菌种放入9 mL无菌水中，振荡摇匀，制成一系
列菌悬液，浓度约为107~108 cfu/mL，备用。
1.8.3 抑菌圈试验
准备若干直径为 6 mm、长 2 cm 的圆筒状物体于
121 ℃干热灭菌 20 min，备用。将已灭菌的固体培养
基熔化后倒入平皿中，培养基的体积为 10 mL，待冷
却凝固后，用无菌镊子夹取之前准备好的圆筒状物体
3 个间隔一定距离插入培养基中，平皿正中央也插入
1 个。
吸取 100 μL 菌悬液，加入到 15 mL 未凝固的培
养基中，吹吸均匀，倒入到插有圆柱状物体的平皿中，
待凝固后，拔出圆柱状物体，在周围的 3 个孔中加入
100 μL 400 μg/mL WKPP-70-1-1，中间的孔加入 100
μL 的无菌水做对照。然后将平皿倒置于恒温培养箱中
37 ℃培养，24 h 后取出，观察抑菌圈直径，比较抑菌
效果。
1.8.4 最小抑制浓度（MIC）的测定[8]
将WKPP-70-1-1加入到60 ℃左右的固体培养中,
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使其终浓度为 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300
μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL，再分别
移取各菌悬液 100 μL，充分混匀，倒入平皿中，待其
完全冷却凝固后，倒置于恒温培养箱中，37 ℃培养。
每个浓度作 3 个重复。观察，以不长菌或者菌落数最
少的最低浓度为最小抑制浓度。
2 结果与分析
2.1 多糖的纯化
2.1.1 DEAE Sephadex A-25 柱纯化结果

图1 DEAE Sephadex A-25柱洗脱曲线
Fig.1 The elution curve of the crude polysaccharide from
walnut kernel pellicle on DEAE Sephadex A-25 column
由图 1 可见，核桃仁种皮多糖过 DEAE Sephadex
A-25 凝胶柱，仅得到一个峰，收集峰值处几管洗脱液
于透析袋中，透析 48 h，进行冷冻干燥，得到
WKPP-70-1，进行进一步纯化。
2.1.2 Sephadex G-75 凝胶柱纯化结果

图2 Sephadex G-75柱洗脱曲线
Fig.2 The elution curve of the crude polysaccharide from
walnut kernel pellicle on Sephadex G-75 column
将WKPP-70-1上 Sephdex G-75柱用三蒸水洗脱，
洗脱曲线如图 2，收集出锋处附近的洗脱液，冷冻干
燥得到纯度较高的 WKPP-70-1-1 进行抑菌作用研究。
2.2 紫外光谱分析
由图 3 可以看出，在 260 nm 处没有出现核酸的特
征峰，280 nm 处也没有出现蛋白的特征峰，因此可以
推断出纯化后的多糖基本不含蛋白等杂质。

图3 WKPP-70-1-1的紫外吸收光谱
Fig.3 UV spectrum of WKPP-70-1-1
2.3 红外光谱分析

图4 WKPP-70-1-1红外光谱图
Fig.4 The infrared spectrogram of WKPP-70-1-1
如图4所示，WKPP-70-1-1的红外光谱显示其具有
多糖类物质的特征吸收峰：3332 cm-1出现一种宽峰是
O-H的伸缩振动峰，2838~2945 cm-1出现吸收峰是C-H
伸缩振动峰，表明多糖存在分子内和分子间的氢键；
1606 cm-1出现吸收峰为C=O和C-N伸缩振动，说明羰
基的存在；1415 cm-1的吸收峰为C-H的变角振动；1332
cm-1的吸收峰为-COOH；1244 cm-1的吸收峰为酯基或
O-乙酰基；1020~1098 cm-1的吸收峰是C-O所伸展振
动峰；894 cm-1吸收峰来判别β－糖苷键的存在。总之，
红外光谱检测的结果充分说明纯化样品中确实存在下
列结构及官能团：糖的吡喃环、羰基、羟基和氨基等
基团。这些均与粘多糖的常见结构及基团相吻合。
2.4 多糖含量的测定
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2.4.1 标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线如图5所示。实验数据表明，标
准葡萄糖在20~100 μg/mL之间呈良好的线性关系，实
验数据处理后得回归方程：
y = 0.0105x - 0.0354，R2 = 0.9972

图5 葡萄糖标准曲线
Fig.5 Calibration curve of glucose
2.4.2 多糖含量的测定
依据公式计算，结果见表1。根据数值说明经过葡
聚糖柱层析之后样品多糖含量明显升高。
表1 样品的多糖含量
Table 1 Polysaccharide contents of WKPP-70 and WKPP-70-1-1
样品 WKPP-70 WKPP-70-1-1
多糖含量/% 44.97 74.67
2.5 抑菌试验结果分析
2.5.1 WKPP-70-1-1 对细菌的抑制作用

(A)大肠杆菌 (B)沙门氏菌

(C)枯草芽孢杆菌 D 金黄葡萄球菌
图6 WKPP-70-1-1的抑菌效果
Fig. 6 Antibacterial effects of WKPP-70-1-1
表2 WKPP-70-1-1的抑菌效果（抑菌圈直径 mm）
Table 2 Inhibition zones of WKPP-70-1-1 (mm)
供试菌种 大肠杆菌
沙门
氏菌
枯草芽
孢杆菌
金黄葡萄
球菌
抑菌圈直径(mm) 10 10.5 9.5 8.5
由图6和表2可知，WKPP-70-1-1对这四种常见细
菌具有一定的抑制作用，尤其是沙门氏菌和大肠杆菌
效果较为显著；WKPP-70-1-1对枯草芽孢杆菌和金黄
葡萄球菌也有一定的抑制作用。
2.5.2 WKPP-70-1-1 的最小抑制浓度（MIC）
表3 WKPP-70-1-1的最小抑制浓度（MIC）
Table 3 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of
WKPP-70-1-1
浓度（μg/mL） 供试菌种
50 100 200 300 400 500 600
大肠杆菌 ++++ +++ ++ + + + +
沙门氏菌 ++++ +++ ++ + + + +
枯草芽孢杆菌 ++++ +++ +++ ++ + + +
金黄葡萄球菌 ++++ ++++ +++ ++ ++ + +
“+”表示菌落数在 0-50；“+ +”表示菌落数在 50-100；“+ + +”
表示菌落数在 100-200；“ + + + +”表示菌落数超过 200。
由表 3 可知，WKPP-70-1-1 对着四种细菌有一定
的抑菌作用，虽不能完全抑制细菌的生长但是却可以
有效地减少菌落的生成。因此，本试验以使菌落数在
0-50 个的浓度作为 MIC。其 MIC 值分别为大肠杆菌
300 μg/mL，沙门氏菌 300 μg/mL，枯草芽孢杆菌 400
μg/mL，金黄色葡萄球菌 500 μg/mL。
3 结论
本文对核桃仁种皮多糖的结构和抑菌功能作了
初步的研究，通过用0.25 mol/L的NaOH-乙醇溶液提
取、去脂、去蛋白、DEAE-Sephadex A-25柱和Sephadex
G-75 柱 纯 化 最 终 得 到 一 种 纯 度 较 高 的 多 糖
WKPP-70-1-1，其糖含量为74.67%。
抑菌试验表明WKPP-70-1-1对大肠杆菌、沙门氏
菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌均有一定的抑制作
用。其中大肠杆菌MIC 值 300 μg/mL，抑菌圈直径为
10 mm；沙门氏菌MIC 值300 μg/mL，抑菌圈直径为
10.5 mm；枯草芽孢杆菌MIC 值400 μg/mL，抑菌圈直
径为9.5 mm；金黄色葡萄球菌MIC 值500 μg/mL，抑
菌圈直径为8.5 mm。研究结果具有一定的理论和应用
应用价值, 如可将核桃仁种皮多糖作防腐保鲜剂, 以
达到防腐抑菌的功效， 在食品和医药领域将有较为广
阔的开发前景。 (下转第369页)
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综上所述，经紫外光谱、比旋光度和凝胶渗透
色谱等方法分析表明胞外多糖分 EPS-1A 为相对均
一多糖。
2.4 理化特性
实验表明：胞外多糖分 EPS-1A 为白色絮状固
体，无异味，可溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等
有机溶剂，热稳定性良好；碘反应不显蓝色，说明此
多糖为非淀粉类；与斐林试剂和三氯化铁反应均为阴
性，说明不含有单糖和多酚类物质；考马斯亮蓝反应
和 260 nm 吸收反应均为阴性，表明很可能不含有糖
醛酸、蛋白质和核酸类物质。
3 结论
采用DEAE-52纤维素(Cl-)离子交换和 Sephadex
G-100 葡聚糖凝胶柱层析对乙醇沉淀得到的冬虫夏
草胞外多糖进行分离、纯化，得到 EPS-1A 级分。
经紫外光谱、比旋光度和凝胶渗透色谱分析表明胞
外多糖分 EPS-1A 为相对均一组分，中性糖含量为
99.0%，重均相对分子质量为 4.0×104，为非淀粉类，
不含单糖、蛋白质、核酸和多酚类物质的水溶性多
糖。
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