全 文 ：灰树花菌丝体中几种多糖的分离及结构表征
李春林1 , 于广利1 , 赵　峡1 , 王　莹1 , 李国强2 , 徐泽平3
(1.中国海洋大学 海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003;2.青岛科技大学 应用化学系 ,
山东 青岛 266042;3.济南澳利生物工程有限公司 , 山东 济南 250014)
　　摘　要:目的 从灰树花菌丝体中分离多糖 ,并进行结构分析。方法 灰树花菌丝体经 85%乙醇脱脂后, 依次用热
水、冷碱和热碱对其进行提取。所得多糖采用气相色谱 、高效液相色谱 、红外光谱 、高碘酸氧化 、Smith 降解等方法分
析。结果 热水提取得到了 1种水溶性杂多糖 ,相对分子质量为 85 000 ,含岩藻糖-甘露糖-葡萄糖(0.03∶0.74∶1)和少量
糖醛酸;碱提取得到2 种含β-(1 , 6/ 1 , 3)连接的水溶性葡聚糖 ,相对分子质量分别为 95 000和 140 000。结论 灰树花菌
丝体水提取可得到杂多糖;碱提取可得到具有超螺旋结构的水溶性 β-(1 , 6/ 1 , 3)-葡聚糖。
　　关键词:灰树花菌丝体;β-葡聚糖;多糖;结构表征
　　中图分类号:Q539.03;R282.71　　文献标识码:A　　文章编号:1005-1678(2004)01-0020-03
Extraction and characterization of several polysaccharides from the
mycelium of liquid-cultured Grifola frondosa
LI Chun-lin1 , YU Guang-li1 , ZHAO Xia1 , WANG Ying1 , LI Guo-qiang2 , XU Ze-ping3
(1.Marine Drug and Food Institute , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China;2.Department
of Applied Chemistry , Science and Technology University of Qingdao , Qingdao 266042 , China;
3.Jinan Agristar Bioengineering Co., LTD., J inan 250014 , China)
　　Abstract:Purpose To extract polysaccharides from the mycelium of Grifola frondosa.Methods The
mycelium was extracted with 85% ethanol , hot water , cold alkali , and hot alkali extraction , respectively.By
GC , IR , HPLC , NaIO4 oxidation and Smith degradation methods was studied the characterization of polysaccha-
rides.Results One water soluble heteropolysaccharide(GFM1)which contained fucose , mannose , glucose (Fuc
∶Man∶Glc=0.03∶0.74∶1)and a small amount uronic acid was obtained , and its molecular weight was 85 000.
Two kinds of water soluble β-(1 ,6/1 ,3)-glucan(GFM3 ,GFM4)were obtained using alkali extraction , and their
molecular weight was 95 000 and 140 000 , respectively.Conclusion Heteropolysaccharide can be extracted with
hot water , and branched water-soluble β-(1 , 6/1 , 3)-Glucan which can form superhelix structure could be ex-
tracted with alkali from Grifola frondosa Mycelium.
Key words:Grifola frondosa Mycelium;β-glucan;polysaccharide;characterization
收稿日期:2003-03-24;修回日期:2003-06-23
基金项目:国家自然科学基金项目(30370345)
作者简介:李春林(1975-),男, 河北唐山人, 硕士研究生 ,从事多
糖与寡糖的结构研究;于广利,联系人 ,E-mail:glyu@ouc.edu.cn。
　　灰树花(Grifola frondosa)属于担子菌纲多孔菌属
担子菌 ,为名贵食用和药用真菌。其液体发酵工艺已
经成熟 ,可以大量获得菌丝体 ,其菌丝体水溶性多糖
提取物具有良好的免疫调节和抗癌活性[ 1 ,2] 。目前 ,
国内对灰树花多糖的研究较为活跃 ,但大多集中于灰
树花胞外多糖的研究[ 3-5] 。本实验以发酵培养灰树花
菌丝体为原料 ,分别用加压热水 、冷碱和热碱对菌丝
体细胞壁进行了多糖的提取 ,获得 3种水溶性多糖 ,
并采用气相色谱(GC)、纸色谱 、凝胶渗透色谱(GPC)、
红外(IR)光谱和刚果红结合等实验 ,对 3种多糖的结
构特征进行了初步的研究 ,为糖类抗癌药物的研究开
发提供了一定的结构信息。
1　材　料
灰树花菌丝体 ,济南奥利生物工程有限公司 ,批
号:20020915;牛血清白蛋白 、岩藻糖 、半乳糖 、阿拉伯
糖 、葡萄糖 、甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖醛酸 ,均为 Sigma
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公司;系列标准Dextran[(相对分子质量(Mr)分别为
21 400 、41 100、133 800 、270 000 、410 000 、2 000 000)] ,
Fluka公司 。
HP5890Ⅱ气相色谱仪 ,安捷伦公司;1350高效液
相色谱仪 , BIO-RAD公司;R132示差检测器 ,GILSON
公司;SB-804 HQ柱(7.8 mm×300 mm),Shodex OHpak
公司;Aminex HPX-87H 柱(7.8 mm ×300 mm), BIO-
RAD公司;UV-2102PC 紫外可见分光光度计 ,尤尼柯
公司;Nexus 470 红外光谱仪 , Nicolet 公司;LabScale
TFF System 超滤仪(截留 Mr 3 000), Millipore 公司;
EZ550Q冷冻干燥仪 ,FTS公司。
2　方　法
2.1　供试品制备[ 6]
灰树花菌丝体50 g 于85%乙醇中回流提取3次 ,
离心后于 40℃减压干燥得脱脂菌丝体。脱脂菌丝体
置压力反应器内于 0.1 ～ 0.15 Mpa 下用热水提取 3
次 ,合并提取液 ,冷却后经离心得上清液和不溶物
P1;上清液经浓缩 、透析 、烘干得供试品GFM1。P1在
4℃下 ,用 10%氢氧化钠溶液提取 3次 ,离心得不溶物
P2和上清液 ,上清液经乙酸中和 ,离心得沉淀 GFM2
和上清液 ,上清液经超滤 、浓缩冻干得供试品 GFM3。
P2在 60℃下 ,用 10%氢氧化钠溶液提取 2次 ,经离心
得残渣和溶液部分 ,溶液部分用乙酸中和后离心得不
溶物P3 ,溶液部分经超滤 ,浓缩冻干得供试品GFM4。
2.2　供试品总糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法于 490 nm测吸收值。
2.3　蛋白质含量的测定[8 , 9]
采用Folin-酚法于 750 nm测吸收值。
2.4　Mr 测定
用Shodex Ohpak SB-804 HQ柱进行测定 ,流动相
为含0.025%NaN3的水溶液 ,柱温为45℃,流速为 0.5
ml/min ,示差检测器。
2.5　单糖GC分析[ 7]
采用糖腈乙酸酯法:取各供试品 10mg 溶于
3.6 mol/L硫酸 2ml ,置安瓿瓶中105℃封管水解12 h ,
经BaCO3 中和 、过滤 、阳离子树脂交换 、浓缩 、冻干 ,经
衍生化后 ,直接进行GC 分析。
2.6　纸色谱分析[ 7]
供试品处理方法与 GC相同 ,用 8 cm×26 cm 色
谱用新华纸展开 ,展开液为乙酸乙酯-乙酸-水(3∶1∶
3),用苯胺-邻苯二甲酸显色。
2.7　IR分析
用溴化钾压片法分析。
2.8　刚果红结合实验分析[ 2]
用0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配制
0.1%刚果红溶液 ,用水配制 1 mg/ml的供试品溶液。
各取 1 ml在 20℃下反应 10 min后 ,于波长 400 ～ 600
nm内扫描。
2.9　高碘酸钠氧化和 smith降解产物分析
供试品经高碘酸钠氧化后 ,用0.01 mol/L 氢氧化
钠溶液滴定;Smith降解产物用Aminex HPX-87H 柱进
行分析 ,柱温 65℃,流动相为 5 mmol/L 硫酸 ,流速为
0.6 ml/min ,紫外(210 nm)检测器和示差检测器连用。
3　结果和讨论
3.1　糖含量 、蛋白质含量和Mr测定结果
对灰树花菌丝体提取得到的 3个水溶性多糖组
分的测定结果见表 1。
　表 1　灰树花菌丝体多糖组分的糖含量、蛋白质含量 、Mr 和
得率测定结果
多糖组分 糖含量/ %
蛋白质含量
/ % M r
得率
/ %
GFM1 70 25 85 000 5.0
GFM3 62 21 95 000 2.3
GFM4 78 18 140 000 5.8
　　从表1可以看出 ,3种多糖中的蛋白质含量逐渐
降低 ,而 Mr逐渐升高。GFM1为水提取多糖 ,该组分
存在于细胞壁最外层 ,Mr 较低 ,和有关文献报道的胞
外多糖的Mr相近 ,随着提取条件的加剧 ,分别从细胞
壁的不同部位提取不同结构的多糖 ,其 Mr 呈升高趋
势。
3.2　GC和纸色谱分析结果
GFM1 、GFM4 的 GC 分析图谱见图 1(GFM3和
GFM4的GC分析结果相同),分析结果表明:GFM1为
含岩藻糖(Fuc)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)(Fuc∶
Man∶Glc=0.03∶0.74∶1)的杂多糖 , 但GFM3和GFM4
均为只含葡萄糖的葡聚糖。从全水解纸色谱分析结
果可知 ,GFM1为含少量酸性糖的杂聚多糖 ,GFM3和
GFM4只含有葡萄糖 。
图 1　气相色谱图
1.岩藻糖;2.甘露糖;3.葡萄糖;4.肌醇
21中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2004 年第 25卷第 1期
3.3　IR分析结果
从GFM1的 IR图谱(图 2)可知 ,3 348 cm-1处为
O-H伸缩振动吸收峰 ,峰形较宽 ,表明存在分子间氢
键 ,1 652 cm-1处的吸收为酰胺键吸收峰 ,887 cm-1为
葡萄糖 β端基C-H的变角振动吸收峰 ,812 cm-1处为
甘露糖α端基C-H的变角振动吸收峰;GFM3在 3 383
cm
-1处有O-H 的伸缩振动吸收峰 ,且存在分子间氢
键 ,1 652 cm-1和 1 541 cm-1处的吸收为酰胺(-NH-
CO-)键吸收峰 ,898 cm-1为葡萄糖 β端基 C-H的变角
振动吸收峰;GFM4(图2)在 3 382 cm-1处为O-H的伸
缩振动峰 ,1 631 cm-1处的吸收峰为酰胺键吸收峰 ,
896 cm-1为葡萄糖 β端基C-H 的变角振动吸收峰。
图 2　IR光谱
　　从3种多糖复合物的 IR图谱可以推断 ,GFM1中
同时含有α和 β构型分子 ,而GFM3、GFM4则只含有 β
构型分子 ,属于 β-葡聚糖。
3.4　刚果红结合实验结果
刚果红与具有超螺旋结构的 β-(1 , 6/1 , 3)-D-葡
聚糖形成稳定的复合物 ,致使刚果红的最大吸收波长
发生红移。为了证明GFM1 、GFM3和 GFM4是否存在
超螺旋结构 ,本文进一步研究了它们与刚果红结合情
况 ,试验结果表明 ,GFM1不能使刚果红的最大吸收波
长红移 ,说明GFM1不存在超螺旋结构;GFM3使刚果
红的最大吸收波长从 480 nm红移至 496 nm 左右(图
3);GFM4使刚果红的最大吸收波长从 480 nm红移至
498 nm左右(图 3),从而证明 GFM3 、GFM4具有典型
的 β-葡聚糖超螺旋结构特征。
图3　多糖复合物与刚果红结合实验
a.刚果红;b.刚果红+GFM3;c.刚果红+GFM4
3.5　高碘酸氧化和Smith降解
由于GFM3、GFM4是单一的 β-葡聚糖 ,因此对两
者进行了高碘酸钠氧化和Smith降解产物分析。由于
Aminex HPX-87H柱能对 Smith降解产物中的葡萄糖 、
赤藓醇 、甘油进行很好的分离 ,本文采用该方法对降
解产物进行了 HPLC分析 ,并通过制作标准曲线 ,初
步确定了产物生成的葡萄糖和甘油的量。分析结果
显示 ,GFM3 、GFM4两者的Smith降解产物中含有大量
的甲酸和甘油 ,证明含有大量 β1-6结构 ,产物中无赤
藓醇表明不存在 1-4连接结构 ,稀酸水解后有大量葡
萄糖 ,说明存在较多 1-3结构。高碘酸氧化实验可
知 ,消耗的高碘酸钠与生成的甲酸摩尔比为 2∶1 ,
GFM3糖链分子中 β1-6与 β1-3摩尔比为2∶1 ,而GFM4
糖链分子中 β1-6与 β1-3摩尔比为1.4∶1 ,据此初步确
定GFM3 、GFM4糖链之间的连接方式为 β-(1 ,6/1 ,3)-
葡聚糖 。
4　结　论
本实验分别采用热水 、冷碱和热碱对灰树花菌丝
体进行提取 ,获得 3个水溶性多糖组分。初步确定
GFM1为α、β 型共存的杂多糖 ,并含有少量糖醛酸;
GFM3和GFM4为具有 β(1-6)和 β(1-3)分支结构的且
具超螺旋结构的 β-葡聚糖 ,对于这两种 β-葡聚糖的精
细结构 ,还需结合特定内切糖酶 ,并结合GC-MS 、NMR
和 ESI/MS等技术进一步确证 。
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