全 文 ：虎斑游蛇醇提物对下丘脑单胺类神经递质含量的影响
赵文静,张 乔,旺建伟
(黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要: 目的:研讨虎斑游蛇醇提物镇痛作用机理与下丘脑单胺类神经递质含量变化的关系。方法: 建立伤害性疼痛动
物模型, 通过化学荧光法,测定大鼠下丘脑组织中 5 -HT、5 -HTAA、NE含量 ,观察虎斑游蛇不同浓度醇提物对其含量的
影响。结果: 虎斑游蛇醇提物对大鼠下丘脑组织中单胺类神经递质含量有影响, 其中升高 5 -HT的含量、降低 5 -
HTAA、NE的含量, 且以高剂量组作用显著,呈量效关系。结论:虎斑游蛇醇提物镇痛作用机理之一与通过影响下丘脑单
胺类神经递质含量有关 ,具有中枢镇痛作用。
关键词: 虎斑游蛇;镇痛; 单胺类神经递质; 5 -HT; 5 -HTAA; NE
中图分类号: R28 文献标识码: B 文章编号: 1000 - 1719( 2008) 06 - 0937 -03
Exper imental Study of Effect on Content ofM onoam ine Neural
Transm itter in Hypotha lamusby A lcohol and Nerve Centre System
ZHAO Wen-jing, ZHANG Q iao, WANG J ian-wei
(H eilong jiang University o f Ch inese M ed icine, Harb in 150040, H eilongjiang, Ch ina )
Abstrac t: Objective: S tudy on re la tion between m echan ism o f analgesic ac tion of ex trac tion o f natrix tigrina late ra lis by a lcoho l and
m onoam ine neural transm itte r in hypo tha lamus.M ethods: Estab lishing achem ode ls, obse rve on the content of 5 -HT, 5 -HTAA,
NE in hypo tha lamus of rats by chem icalm e thods to study e ffect of extrac tion o f na trix tigr ina lateralis by alcoho l to which. R esults:
Extraction o f na trix tig rina latera lis by a lcohol ha s action to content o fm onoam ine neural transm itte r in hypo tha lamus. It can pro-
m ote conten t o f 5 -HT, inhabite content of 5 -HTAA and NE, the high g rowp has obv ious e ffec.t Conclusion: Analgesic action of
ex traction o f natrix tigrina la te ra lis by a lcoho l effects antinociceptive in central ne rvous, the one o f mechanism is re lated to e ffec t
the content of monoam ine neura l transm itte r in hypo thalam us.
K eywords: natrix tigrina la te ra lis; ana lge sic ac tion; m onoam ine neural transm itter; 5 -HT; 5 -HTAA; NE
收稿日期: 2008 - 01 - 24
基金项目:黑龙江中医药大学科研基金重点项目 ( 200507)
作者简介:赵文静 ( 1960 - ) ,女,黑龙江哈尔滨人,教授, 硕士生导师,硕
士,长期从事中药学及药用动物及动物药的教学及科学研
究。
通讯作者:旺建伟, Te:l 0451 - 88680869。
虎斑游蛇 Natrix tig rina. Late ra lis( B ertho ld ),具有
祛风湿,止痹痛, 解毒等功能,在民间应用广泛,是一种
有着重要开发及药用价值的动物类药材。通过前期工
作,已发现虎斑游蛇镇痛作用具有中枢性部位特点,因
此本实验旨通过测定虎斑游蛇对中枢单胺类神经递质
含量的影响,以期探讨其镇痛作用机理,为临床开发蛇
类动物药及更深入研究提供科学的实验依据。
1 实验材料
11 1 药材及制备
虎斑游蛇捕捉于黑龙江省虎林县境内,活体经分
类鉴 定 为游 蛇 科 动 物 虎 斑 游蛇 Na trix tigrina
(B erthold)。药材经干燥磨粗粉, 制成 100% 醇提液
(含生药量 1g /mL)。根据所需浓度以生理盐水稀释。
11 2 药品及试剂
5 -羟色胺 ( 5 -HT, Sigma, 863178) ,邻苯二甲醛
( S igma, 863178) ,过碘酸钠 (天津市天大化工实验厂,
20041123) , 铁氰化钾 (天津市天大化工实验厂,
20041025) , L -半胱胺酸 (上海新兴化工试剂研究所,
040518), 布桂嗪 (沈阳第一制药厂, 20040716) , 阿司
匹林 (陕西省西安市西达公司秦虹制药厂, 040304)
11 3 实验动物
W istar大白鼠, 由黑龙江中医药大学实验动物中
心提供。
11 4 实验仪器
电子天平 [梅特勒 -托利多仪器 (上海 )有限公
司, PL202 -S型 ],电热恒温水浴器 (江苏医疗仪器厂,
HH - S型 ) ,高功率数控超声震荡器 (昆山市超声仪器
有限公司, KQ - 800KDE) ,自动平衡微型离心机 (北京
医用离心机厂, LDZ4 -0. 8),荧光分光光度计 (日本#
岛津, RF - 5301PC )。
2 实验方法
21 1 动物分组 模型复制及给药
取健康 W istar大鼠 40只, 雌雄各半, 体重为 160
~ 200g,随机分成 4组,分别灌胃给予虎斑游蛇醇提物
( 100%、50% )、0. 9%生理盐水及阳性对照药 (阿司匹
林等效剂量 )。每日灌胃给药 1次, 连续给药 7天, 末
次给药后 80m in, 大鼠左足跖皮下注射 5%甲醛溶液
50LL, 造成伤害性疼痛模型。
21 2 组织取材及处理
模型复制 40m in后进行组织取材。各组大鼠断头
取脑,迅速在冰台上分离下丘脑,称重, 锡箔折叠密封
#937# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2008.06.140.zhaowj.075
包裹 (勿将脑组织挤压变形 ), 按化学荧光法测定单胺
类神经递质含量。
21 21 1 5 -HT 5 -H IAA的提取和测定 立即将下
丘脑置于含有冰冷酸性正丁醇 ( 1mL正丁醇 /100mL
组织 )的匀浆器中, 在冰浴条件下充分匀浆后, 离心
5m in( 3000r /m in) ,分 2次吸取 5mL上清液, 分别加到
10mL带塞离心管 A和 B中, A、B管中已含有 21 5mL
正庚烷和 1mL 01 1mL /L HC l。然后, 向 A管中加入
01 2mL 01 01mo l /L HC ,l然后,向 B管中加入 01 2mL含
标准 5 -HT 200ng的 01 01mo l /L HC l(内标管 ) , 机械
震荡 5m in, 离心 5m in( 1500 r /m in)后,吸取水相 1mL,
置于 4e 冰箱中待测 5 -HT。吸取上述 A、B管中余下
的有机相各 31 8mL, 分别加入到含有 01 45mL P. B的
带塞离心管 C 和 D 中, 向 C 管中加入 01 05mL
01 01mol /L HC ,l向 D管中加入 01 05mL含标准 5 -
H IAA 50ng的 01 01mol /L HC l(内标管 ) , 机械震荡
5m in,离心 5m in( 1500 r /m in)后, 吸取水相 01 45mL, 置
于 4e 冰箱中待测 5 -H IAA。将待测含有 5 -HT水相
样品 1mL中依次加入 011mL 10mg /mL半胱氨酸、2mL
01 004% OPT和 01 1mL 01 02% NaIO4溶液。将待测含
有 5 - H IAA水相样品 01 45mL中依次加入 01 05mL
10mg /mL半胱氨酸、0165mL 0. 004% OPT和 01 04mL
01 02% NaIO4溶液, 摇匀后, 放入热浴中煮沸 10m in,
然后用水冷却至室温。在激发光波长为 365nm激发,
发射光波长为 480nm发射,狭缝 5条件下测定样品的
荧光强度。结果见表 1。
21 21 2 NE的分离和测定 立即将下丘脑置于冰冷的
匀浆器中, 加 5mL酸性正丁醇, 匀浆 1~ 2m in, 倾出匀
浆液至离心管,离心 10m in ( 1500r /m in), 吸上层正丁
醇液 2mL, 加入含有 115mL 01 1mL /L的磷酸缓冲液
( pH 61 5)的具塞离心管中, 震摇 10m in, NE被抽提到
缓冲液中。取上述磷酸提取液 11 5mL加入 01 4mL
01 1mol /L EDTA,放入 30e 恒温水浴中,再加入 01 2mL
碘试剂, 准确反应 2m in后, 加入 01 4mL碱性 N a
2
SO
4
溶液, 准确反应 2m in,最后加入 01 5mL 6mol /L H ac, 反
应液在沸水中加热 2m in,移入冷水中冷却至室温。反
应液在荧光计上以 385nm 激发, 485nm发射, 狭缝 5
处测定荧光强度。
21 3 数据处理
实验数据以均数 ?标准差 (€x ? s)表示,组间差异
比较采用 Students T - test分析。
3 结 果
见表 1。
表 1 各组大鼠下丘脑内单胺类神经递质含量比较 ( n= 10, €x ? s)
组别 剂量
( g /kg)
单胺类神经递质
5 -HT 5 -HIAA NE
模型对照组 - 552. 6 ? 124. 3 673. 4 ? 148. 7 536. 7 ? 126. 1
虎斑游蛇醇提物高剂量组 20 757. 6 ? 197. 2* * 504. 7 ? 155. 4* 407. 7 ? 130. 6*
虎斑游蛇醇提物低剂量组 10 642. 1 ? 142. 9 582. 5 ? 172. 4 547. 5 ? 143. 3
阳性对照组 0. 015 676. 6 ? 136. 6* 531. 2 ? 146. 3* 402. 8 ? 152. 9*
注:与模型对照组比较, * P < 0105, * * P < 0101。
从表 1可见,虎斑游蛇醇提物高剂量组可升高疼
痛模型大鼠下丘脑中 5 -HT的含量, 降低 5 -H IAA、
NE的含量,且呈量效关系。与阳性对照组相比较, 有
明显性差异 ( P < 0105) ,与模型对照组相比较,亦有统
计学意义 (P < 0105 )。而其低剂量组则无明显作用,
与模型对照组、阳性对照组相比较, 无统计学意义 (P
> 01 05)。提示虎斑游蛇醇提物高剂量组对疼痛模型
大鼠下丘脑内单胺类神经递质含量有影响作用。
4 讨 论
蛇类药物具有广泛的药用价值, 其显著的疗效已
被公认。但随着现代工艺的发展和剂型的改进, 药用
蛇多种剂型在临床上的大量应用, 导致药用蛇类的需
求量日益倍增,加之近年来滥捕乱杀和生态平衡的破
坏,使蛇类药源明显匮乏, 日见稀少。因此开发利用非
传统药用蛇尤显得十分重要。虎斑游蛇为资源丰富的
蛇种,民间应用疗效肯定, 故本实验旨在运用现代药理
学研究方法,对虎斑游蛇进行镇痛实验研究,并探讨其
镇痛作用机理以期科学的验证其药用价值。为补充蛇
类药材的严重缺乏和合理开发新型药用蛇提供坚实的
科学依据。
中枢类镇痛药的作用是激动阿片受体,激活脑内
抗痛系统,阻断痛觉传导, 产生中枢性镇痛作用。具体
机制:一是阿片受体激活后,突触后神经元钾离子电导
提高,产生超级化,从而抑制了神经元兴奋。二是突触
前阿片受体的激活抑制了神经递质从初级传入神经的
释放,从而阻断了兴奋的传导。因此,神经递质的释放
被认为在神经元兴奋传导中扮演着重要角色。单胺类
神经递质包括 DA、NE和 5 -HT, 它们既是神经递质,
又能直接致痛,在疼痛过程中参与了致痛和镇痛两方
面的作用。
单胺类神经递质在中枢神经元具有兴奋与抑制两
种效应,但以抑制为主, 故可提高痛阈而加强镇痛效
应。很多证据都表明 5 -HT能机理同抗伤害感受的
作用有直接的关系,传统上一直认为 5 -HT对伤害性
刺激的传递有抑制作用 [1 ]。5 -HT在中枢神经系统是
以神经递质形式起抑痛作用的,其广泛分布于各脑区,
以中缝核含量最高, 其下行的传导纤维在脊髓后角与
内啡肽神经元发生突触联系。虎斑游蛇醇提物在中枢
能明显升高下丘脑中 5 -HT含量, 在神经冲动到来
时,储存在囊泡中的 5 -HT大量释放到突触间隙, 作
用于突触后膜的 5 -HT受体,从而有利于 5 -HT的镇
痛作用的发挥。因此表明虎斑游蛇醇提物在 5 -HT
的疼痛下行调控机制中扮演了重要的角色,其作用机
理可能是虎斑游蛇使 5 -HT的升高导致内啡肽神经
元向痛传入神经上的阿片受体释放脑啡肽增加, 从而
形成突触前抑制, 阻断了兴奋性传导, 降低了疼痛冲
动,即说明虎斑游蛇可能是通过激活内源性抗痛系统
而达到镇痛作用 [2], 进一步机理尚需深入研究证实。
5 -HIAA是 5 -HT的最终代谢产物。释放的 5 -
HT有两条去路,一是通过 A型单胺氧化酶 (MAO )的
催化,使 5 -HT氧化脱胺生成 5 -羟吲哚乙醛。后者
通过依赖醛脱氢酶催化生成 5 -H IAA; 5 -羟吲哚乙
醛还可通过依赖醛还原酶生成 5 -羟色醇, 最后由肾
脏排除。二是由突触膜对 5 -HT的再摄入作用,再摄
入过程通常在 5 -HT能系统或其它单胺能神经末端
中进行 [3]。实验研究表明, 虎斑游蛇醇提物使 5 -HT
含量增加, 5 -H IAA含量减少, 但二者变化的数量关
系并未完全对应,只是相应于对照各组 5 -HT的升高
而下降,完全符合以上说明的生化代谢。 5 -H IAA下
降的数量关系和 5 -HT升高数量不等, 其作用机理可
#938# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期
能因为虎斑游蛇在作用单胺类神经元的同时, 会对单
胺类递质代谢产生不同的影响, 从而影响此种神经递
质代谢产物的含量。
NE是一种神经递质,在中枢其神经元主要位于脑
桥的蓝斑及延髓网状结构的腹外侧部分, NE虽然在脑
和脊髓均有分布,但作用各不相同:脊髓中的 NE有助
于镇痛,脑内的却能对抗镇痛。实验研究表明,虎斑游
蛇醇提物显著降低下丘脑 NE含量,使 NE在中枢对抗
镇痛的能力减弱,从而有利于镇痛作用的发挥。其作
用机理可能是虎斑游蛇对神经递质多巴胺 ( DA )发挥
作用, DA是一种中间产物, 它通过多巴胺 B羟化酶的
作用,在乙胺的 B碳原子上羟基化,从而影响到 NE的
生成。
本实验结果表明虎斑游蛇通过对中枢神经系统单
胺类递质代谢产生不同的影响, 从而影响此种神经递
质代谢产物的含量,而具有中枢镇痛作用。
参考文献
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[ 3 ] 周舒,娄艾琳. 5 -羟色胺的生理和病理生理 [M ]. 北京:人民卫生
出版社, 1988: 6, 103.
大黄虫丸抗肝肿瘤复发转移的实验研究
吴翠珍 1,亓 勇 2, 陶汉华 1
( 11山东中医药大学, 山东 济南 250355; 21泰安市中医院,山东 泰安 271000)
关键词: 大黄虫丸;肝肿瘤 ;复发转移
中图分类号: R28516 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2008) 06 - 0939 - 02
收稿日期: 2008 - 01 - 06
作者简介:吴翠珍 ( 1951 - ) ,女,山东莱芜人,教授,主要从事肿瘤病人
的饮食营养和治疗。
肝癌是严重威胁人类健康和生命的疾病之一, 目
前中西医尚无理想的治疗方法和药物, 根据肝癌病人
的临床表现, 中医辨证应属虚劳病范畴, 其病机具有
虚、瘀、毒的特点,临床观察大黄虫丸具有一定治疗
效果。
5金匮要略#血痹虚劳病脉证并治6中云: /五劳虚
极羸瘦,腹满不能饮食,食伤、忧伤、饮伤、房室伤、饥伤、
劳伤、经络营卫气伤, 内有干血,肌肤甲错,两目黯黑。
缓中补虚,大黄虫丸主之。0方药由 /大黄十分 (蒸 ),
黄芩二两,甘草三两,桃仁一升,杏仁一升,芍药四两,干
地黄十两,干漆一两,虻虫一升,水蛭百枚,蛴螬一升,
虫半升0组成,用法/上十二味, 末之, 炼蜜和丸小豆大,
酒饮服五丸,日三服。0 [1]本方在5金匮要略6中用于治疗
虚劳有干血证。现代药理研究证实大黄虫丸具有改
善微循环、抗凝血、降血脂、改善血小板功能以及肝保护
等作用。临床多用于治疗慢性活动性肝炎、肝硬化、再
生障碍性贫血、高血压、脑血栓形成、肝囊肿、善饥多食
症、原发性血小板减少性紫癜、慢性肾小球肾炎、静脉曲
张并发症与后遗症、肠粘连等。本方虽用于临床肿瘤的
治疗,但实验方面对其防治肝癌的机理研究甚少。本论
文目的在于研究大黄虫丸的抗肝癌作用机理,观察大
黄虫丸对荷肝癌 (H22 )小鼠模型肿瘤生长和免疫器官
的影响。实验证实了大黄虫丸在肝肿瘤治疗方面的
重要作用,为其临床应用提供了理论依据,也是对经方
更广阔应用作的有益探讨。
1 实验材料
实验目的: 观察大黄虫丸对 H22型小鼠肝癌的
抑制作用。
实验材料: 实验动物: 昆明种小鼠 40只, 雌雄各
半,体重 18~ 22g, SFP级,由山东省医学科学院实验动
物中心提供。
肝癌细胞株 H22肝癌小鼠, 由山东省医学科学院
药研所药理室提供。
中药制备:大黄虫丸 (简称 DHZ)按仲景原方组
成,一两约 14g, 一升约 200mL, 用量: 大黄 35g, 虫
28g, 黄芩 28g, 桃仁 95g, 杏仁 95g, 芍药 56g, 地黄
140g,干漆 14g, 虻虫 24g, 水蛭 168g, 蛴螬 28g, 甘草
42g。由山东中医药大学中医门诊部提供。并在山东
中医药大学中药实验室研粉末,过筛 ( 80目 ) ,备用。
2 实验方法
21 1 肿瘤接种方法及分组 无菌操作,抽取传代 7~ 9
天荷肝癌小鼠腹水,用生理盐水稀释至 2~ 3 @ 107 个细
胞 /mL,接种于小鼠前肢右侧腋部皮下, 012mL /只, 次日
将小鼠随机分为荷瘤模型组 (H22组 )、大黄虫丸高剂
量组 ( DHZ1组 )、大黄虫丸低剂量组 (DHZ2组 )、另设
未接种肿瘤细胞的空白组,每组 10只,雌雄各半。
21 2 给药方法 小鼠接种肿瘤细胞后 24h开始给药,
正常组及 H22组灌服生理盐水 10mL /次, 1次 /日; DHZ1
组灌服大黄虫丸药粉 011g /次, 1次 /日; DHZ2组灌服
大黄虫丸药粉 0105g /次, 1次 /日。连续给药 10天。
21 3 标本采集 末次给药 24h后断颈处死小鼠,剥离
肿瘤组织,无菌取脾及胸腺。
3 观察指标
31 1 一般状况 肉眼观察荷瘤小鼠一般状况的变化,
包括毛发、体重 (测用药前后动物体重变化 )、食欲等。
31 2 对肿瘤生长的抑制作用 完整剥离肿瘤, 称取瘤
#939# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期