全 文 ：第 13卷 第 3期
2 0 0 5年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．13 No．3
July， 2005
氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究*
钟文辉 何 国庆
(南京师范大学化学与环境科学学院 南京 210097)(浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310029)
孙 明 喻子牛 冯孝善
(华中农业大学生命科学技术学院 武汉 430070)(浙江大学环境与资源学院 杭州 310029)
摘 要 研究从土壤 中分离出 1株降解 2，4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株“GT241—1”，并从 中克隆出参 与降解
2，4-二氯酚的氯粘康 酸环异构酶基 因(dcpC)，该基 因编码 的氯粘康 酸环异构酶可将 2，4一二氯一顺，顺一粘康酸转化为
反式一2’氯一双烯内酯。采用的基因克隆策略是用 Southern杂交对其邻近基 因进行定位后构建 基因组 文库 ，再用斑
点杂交从基因文库中筛选 目的转化子。经序列测定得知 dcpC基 因编码 区 1110bp，且核苷酸和推测的编码氨基酸
序列分析表明 dcpC 属氯粘康酸环异构酶基 因家族 ，并与该基因家族的其他基因有一定差异。
关键词 假单胞菌 2，4一二氯酚 氯粘康酸环异构酶基 因 基 因克隆
Cloning and sequence analysis of chloromuconate cycloisomerase gene．ZHONG Wen—Hui(Colege of Chemistry and Envi—
ronmental Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China)，HE Guo-Qing(Co lege of Biosystem Engineering
and Food Sciences，Zh@ang University，Hangzhou 310029，China)，SUN Ming，YU Zi—Niu(College of Life Science and
Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)，FENG Xiao-Shan(Co lege of Environmental and
Resource Sciences，Zh~iang University，Hangzhou 310029，China)；CJEA，2005，13(3)：112～115
Abstract A 2，4-dichlorophenol degrading Pseudomonas strain GT241—1 was isolated from a soil sample．The ch1oromu—
conate cycloisomerase gene，designated as dcpC which encodes chloromuconate cycloisomerase involved in transform ing 2，
4-dichloro-cis，cis—muconate into trans-2-chlorod ienelactone，was cloned from this bacterium strain
． The gene cloning
strateg y was to construct genomic library after location of its neighbouring gene by So uthern blot and to screen the aim
transform ant by dot blotting．Sequencing results show that the length of dcpC is 1 1 10bp．The sequence analysis of dcpC
and the deduced amino acid show that dcpC belongs to chloromuconate cycloisomerase gene family and is different from
other genes in the gene family．
Key words Pseudomonas，2，4-dichlorophenol，Chloromuconate cycloisomerase gene，Gene cloning
(Received sept．10，2004；revised Oct．16，2004)
2，4一二氯酚(2，4-DCP)及其衍生物均为有毒、难降解化合物 ，目前国内外有关 2，4一二氯酚的厌氧生物降
解、2，4一二氯酚降解菌特性和降解酶定域及活性的研究已见诸报道[卜 ，但对微生物的 2，4一二氯酚降解基因
结构及分子特征的研究 目前尚少见报道。2，4一二氯酚的好氧生物降解过程先后涉及 2，4一二氯酚羟化酶、
3，5一二氯儿茶酚 1，2一双加氧酶、氯粘康酸环异构酶、反式氯双烯 内酯异构酶和双烯 内酯水解酶的催化作用，
最后生成 2一氯马来乙酸。其中氯粘康酸环异构酸基因(本研究代号为 dcpC)是降解 2，4-二氯酚的关键基因
之一 ，它编码的氯粘康酸环异构酶可将 2，4一二氯一顺 、顺一粘康酸转化为反式一2一氯一双烯 内酯 。氯粘康酸环异
构酶也参与对 2，4一D的降解。根据对 2，4一D降解基因的研究[ ， ，编码粘康酸环异构酶的基因(tfdD)与编
码 3，5一二氯儿茶酚 1，2一双加氧酶、反式氯双烯内酯异构酶及双烯内酯水解酶的基 因紧密连接在一起并构成
约 3．7kb的二氯儿茶酚氧化操纵子 。本试验研究编码降解 2，4一二氯酚的氯粘康酸环异构酶基 因的克隆及
序列，为构建高效降解2，4一二氯酚的基因工程菌奠定基础。
1 试验材料与方法
假单胞菌“GT241—1”是从生产 2，4一二氯酚及 2，4一D化工厂的排污 口取土样 ，添加 2，4一二氯酚于 25～
* 国家自然科学基金项 目(30080013)和农业微生物学国家重点实验室开放基金项 目(AML0210)资助
**通迅作者
收稿 日期 ：2004—09—10 改回日期：2004—10—16
第 3期 钟文辉等 ：氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究 113
30℃ ，驯化 3个月后从中分离得到的 1株降解 2，4一二氯酚能力较强、并能利用 2，4一二氯酚为唯一 C源生长
的细菌菌株。以大肠杆菌 DH5a为 DNA操作的受体菌，用大肠杆菌克隆载体 pDG780作克隆载体 [大小
4445bp，硫酸卡那霉 素抗性 (Km )]。LB培养基按文献 [8]配方 ，LA培养基 为固体 LB培养基。用添加
20t~g／mL硫酸卡那霉素的 LA培养基筛选转化子或培养重组菌株。用 SDS裂解法大量制备菌株“GT241—1”
总 DNA J。用 EcoRI、Xba I、EcoRI／Xba I对总 DNA分别进行完全酶切。琼脂糖凝胶 电泳结束后用
EB染色 ，在长波紫外灯下迅速切下 目的 DNA带并装入 1．5mL Eppendorf离心管 ，以微小玻璃珠吸附法(使
用进 口试剂盒)回收和纯化 DNA。从核苷酸序列资料库中检索序列，比较降解 2，4一D等底物的几个 3，5一二
氯儿茶 酚 1，2一双加 氧酶基 因的保 守 区序列 后设计 1对 引物 ，上 游 引物(3313号)序 列 GTCAAGGAT—
GTTGTCGATGC，下游引物(3314号)序列 CGAAGTAGTACTGCGTGGTC。用该引物对含 3，5一二氯儿茶
酚 1，2一双加氧酶基因的模板(微生物细胞或 DNA)扩增得大小 610bp片段。扩增反应体系体积 25t~L，首轮
循环 94℃变性 5min，之后以 94℃lmin、63℃1rain和 72℃1min进行 25个循环。用引物 3313～3314号对菌
株“GT241—1”的总 DNA进行 PCR扩增 ，获得在空间位置上临近于 dcpC的610bp特异性 DNA片段 ，经标记
后作 Southern杂交和斑点杂交的探针 ，采用德国 Boehringer Mannheim 地高辛试剂盒标记探针。Southern
杂交具体方法为将总 DNA完全酶切 ，酶切产物经 8g／L琼脂糖 电泳，Southern印渍将 DNA转移至尼龙膜
上 ，紫外光下固定 5．5min并 68℃预杂交 8h，再加入探针于 68℃杂交 20h，经洗膜后进行显色。参照文献[8]
方法进行斑点杂交、大肠杆菌质粒抽提、质粒大小检查 、DNA体外重组操作及大肠杆菌的常规转化，DNA酶
切和连接等操作均按供应商推荐方法。由上海申友生物技术有限责任公司测定 DNA序列。
2 结果与分析
2．1 基因文库构建、目的转化子的筛选与验证
菌株 GT241—1总 DNA分别经 EcoRI、Xba I和 EcoRI／Xba I酶切 ，用 7g／L琼脂糖凝胶电泳并转尼
龙膜后进行 Southern杂交 ，结果均得到 1条杂交带 ，其
大小分别为 12kb、16kb和 11kb左右。回收 1lkb左右
A
B
的酶切片段并 与克隆载
体 pDG780连接后转化大
肠杆菌 DH5a，构建基 因
23130 bD 组文库。检查 DH5a中质
9416 bp 粒大小 并筛选 文库 中的
436Ib 重 组 子 (占 转 化 子 的
30％～45％)，采 用 斑 点
杂交印迹图谱(见图 1)从
约 1000个重组子中筛选
图 1 斑点印迹图谱
Fig．1 Dot blotting profile
*图中 a为点种的转化子，b为 Dot bloting图谱。
目的转化子的质粒 pZ8122，用
将 pZ8122酶切并回收其外源片段，分别用 Sma I、Pst I、Kpn I、Sac I ⋯
O OKb一
和 BamH I酶切，结果 ￡I、Kpn I、Sac I和 BarnH 1分别将之切成 3、4、2 4．4kb-
和 2个片段 ，其中>3．7kb的片段分别有 0、1、2和 2个片段；而 Sma I不能将
外源片段切断。用引物 3313～3314号对 >3．7kb的 5个酶切片段分别进行
PCR扩增 ，结果显 示该对 引物对 BarnH I酶切得到 的 4．3kb左 右的片段
6 6kb
4．4kb
(Bn HI-B)Nt c I酶切得到的 5kb左右的片段( c I—A)能扩增出预期大 图3 质粒pBC 6及酶切图谱
小的。NA片段，而对其他片段则未能扩增出预期大小。NA片段。将载体 ： 。i；
pDG780分别用 BarnH I-Xba I、BamH I-EcoR I和 BarnH I酶切后 ，再分别 经 H 砒双爵切 的几乎重叠的4．m和4．m
与回收的BamH I—B片段连接并转化大肠杆菌DH5a，结果表明用BarnH I— ，3为载体删 ，4为 基因的t克耋 最。
114 中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
EcoR I酶切的载体能成功与 BarnH I—B片段连接获得转化子 BCDE4—6。pBCDE4—6经 BarnH I／EcoR I双
GTGAAGATTGACGCGATTGAAGCAGTGATCGTGGATGTGCCGACCAAGCGGG 1 120酶切 ，得到 几乎重 叠
CGATCCAGATGTCGATCACTACCGTGCACCAGCAGAGCTACGTTATCGTCCGGGTGTATTCGGAGGGGCTCGTTGGTGTC 1200的 4．3kb和 4．4kb片
GGCGAGGGTGGAAGCGTTGGTGGTCCCGTCTGGAGCGCAGAGTGTGCGGAGACGTTCAAGATCATCGTGGAACGGTATCT 1280段 (见图 3)。将经缩
CGCGCCCCACCTCCTCGGAAATGATGCGTTCAACGTTTCAGGTGCACTGCAAACCATGGCGCGTGCCGTCACCGGAAACG 1360短的 dcpC基 因的亚
CCTCTGCAAAGGCTGCGGTCGAGATGGCGTTACTGGATCTCAAAGCTCGAGCGTTAGGCGTATCGATCGCCGAGTTACTT 1440克隆 片 段 作 序 列 测
GGCGGGCCGTTGCGCAGTGCGATTCCGATTGCCTGGACATTC~GCGAGCGGAGATACGAAACGCGATCTCGATTCTGCCGT 1 520定 ，结果 显示该 片段
CGAGATGATTGAAAGACGACGACACAATCGCTTCAAAGTCAAGCTTGGCTTCCGGTCGCCCCAAGACGATCTCATCCATA 1600全长 4303bp，其 中含
TGGAGGCTTTGTCAAATAGTCTCGGATCGAAGGCCTACCTTCGCGTTGACGTGAATCAGGCTTCGGACGAGCAAGTGGCG 1680 dcpC的部 分序列 见
TCCGTCTACATTCCTGAACTGGAGGCGCTTGGCGTGGAACTCATCGAACAGCCGGTCGGCCGCGAAAATACGCAAGCGTT 1760图 4。DcpC 编 码 区
GAGGCGGCTCTCCGACAACAACCGCGTGGCCATCATGGCCGATGAGAGCCTGAGTACGTTGGCCTCGGCATTCGATCTCG 1840紧接于 3，5一二氯儿茶
G GcGAccGAAGTGTGGATGTcTTTTcGcTGAAGcTTTGcAAcATGGGAGGGGTcTcGGcGAcGcAAAAGATAGcAGcG 1920酚 1，2一双加氧酶基因
GTcGcGG从Gc从GcGGGATTGcATcGTATGGcGG从c从T6CTTGAcTcGAcGATcGGcAcATcGGTTGcAcTTcAGcT 。。( B)编 码 区
。 经
cTATTcTAcGGTTccATcGcTTccGTTcGGTTGcGAAcTGATcGGTcccTTcGTGTTGGcAGAcAcGcTGAGccAcGAGc 。 。基 因库 BLAST联 网
cGcTcGcGATccGGGATTAcGAAcTGcAGGTTcccAcTGGcGTAGGTcAcGGcATGAcGcTTGAcGAGGAcAAGGTGcGc 6o检索显示
， C与真
c从TAcGcAcGcGTcAGcTAGg g g g g gg g gg g gg g g g g g g g 。氧产碱杆菌质粒 pJP4
图4 dcpC基因序列* 的氯粘康酸环异构酶
Fig．4 The sequence of gene 基 因(GenBank Acces一
*图中大写字母区(序列中第1069～2178位)为止 c编码区；起始密码子和终止密码子用黑体标出；小写字母区为非编码区。 sion No．M35097)有
99％的同源性；dcpC编码的氨基酸序列与 pJP4的氯粘康酸环异构酶序列(GenBank Accession No．M35097、
B35255)有 94％的 同源性 ，与 Ralstonia eutropha 的氯粘 康 酸 环异 构 酶序 列 (GenBank Accession No．
AB019032)有 62％的同源性，表明 dcpC属氯粘康酸环异构酶基因家族，但与该基因家族的其他基因存在一
定差异。
3 小结与讨论
假单胞菌 GT241—1降解 2，4一二氯酚能力极强，能彻底降解 2，4一二氯酚且性能稳定，还可降解 2，4一D、苯
甲酸和儿茶酚等有机物⋯ ，是 1株性能优良的 2，4-二氯酚降解菌株。参与降解 2，4-二氯酚的多个基 因中，
编码起始几步降解酶的基因即2，4一二氯酚羟化酶基因、3，5一二氯儿茶酚 1，2一双加氧酶基因、氯粘康酸环异构
酶基因、反式氯双烯内酯异构酶基因和双烯内酯水解酶基因是关键基因。大多数细菌通过修饰邻位裂解途
径、经 由氯代儿茶酚降解氯代芳香化合物，降解基因通常位于降解性质粒上且组成操纵子结构[。~1¨ ，本研究
用 Southern杂交并对邻近 3，5一二氯儿茶酚 1，2一双加氧酶基因进行定位 ，通过构建基因文库并用斑点杂交，
从约 1000个重组子中筛选得到 1个 目的转化子。该 目的转化子的质粒 pZ8122所携带的外源片段约 11kb，
经缩短的dcpC基因的亚克隆片段全长 4303bp，上下游两端分别为 BarnH I和 EcoR I酶切位点。该亚克隆
片段为一基因簇，含有 dcpC基因和参与降解 2，4一二氯酚的其他几个关键基因。其中 dcpC与已在 GenBank
登记的氯粘康酸环异构酶基因家族中的其他基因有一定差异，与 pJP4的二氯儿茶酚氧化操纵子中的 tfdD
差异最小 ，同源性达 99％；dcpC编码氨基酸序列 的差异较大。dcpC基因与编码氯儿茶酚开环后的后续几
步降解酶的基因也紧密相连，推测也构成操纵子与其他氯粘康酸环异构酶序列。
参 考 文 献
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山 东 省 济 南 市 创 建 绿 色 生 态 市
山东省济南市是全国著名的历史文化名城 和国家园林城市，济南市委、市人 民政府在充分分析该市城市生态特征、生态过
程、生态格局和生态潜力以及城 市生态适宜性 、生态承载力、生态稳定性与可持续性 、发展状况及发展趋势后 决定开展生态城市
建设，这是济南市实施可持 续发展战略的重大举措 。2003年 9月济南市委托 山东大学组织编制 了《济南生态市建设规划》，确定
了济南生态市建设的总体定位、总体 目标和近期(至 2007年)、中期(至2012年)、远期(至 2020年)的分阶段 目标。济南生态市总
体 目标是到 2020年在济南全市形成具有完善服务功能的生态环境 、遵循循环经济理念的产业体 系、持续稳定安全的投资环境、
和谐优美的生活环境、以“山、泉、湖、河、城”为特色的泉城景观风貌、弘扬文化传统的生态文明。按 照这一总体 目标 ，其规划分为
3个阶段。即近期 阶段 (2003～2007年)为启动推 进阶段 ，到 2007年通过 国家环境保护模 范城 市验 收，受保护地 区面积达到
409 ，南部山区水源涵养区和黄河沿岸生态功能保护区达到正常运行状态，初步形成集中与分散回用相结合的 多层次城市污
水处理和回用网络．城市回用水利用率达 20％以上 ，城镇生活污水处理率达 60％，城 市建成 区绿化覆盖率达 39％；中期阶段
(2008-2012年)为发展和提高阶段 ，基本形成具有泉城特色的城市生态格局，初 步建立循环经济体系，城市水功能区水质达标率
达 100％．城 市空气质量优良天数达 330d。所有县(市)全部建成 国家级生态示范区，25％的县(市)达到 生态县标准 ；远期阶段
(2013-2020年)为全面发展阶段，完成区域生态环境体系建设，实现资源循环利用，城镇可再生资源回收利用率达 95％以上 ，建
成有效的水资源蓄留和回用体系，无地下水超采 ，80％以上的乡镇达到环境优美乡镇标准，所有县(市)全部建成生态县。按照规
划．对济南市辖区范围生态建设布局进行生态功能区划，划分 了南部山区生态功能区等 5个生态功能区，20个亚区和 146个生态
单元，其中南部山区与黄河沿岸生态功能区以生态保护和恢复为主要任务，中心城区和山前平原生态功能区以生活生产服务为
主，北部平原生态功能区以生产服务为主，兼顾对沙化盐碱区域的生态恢复。并对各生态功能区的产业和城镇发展进行综合布
局 ，规划了以柳埠 自然保护 区等 2区 l因为主的39个种群源、2O余条生态廊道、6个城市生态节点和 l3个关键生态节点、3大片
(南部山区水源涵养区、沿黄河、白云湖及周边)和若干小片(泉域及散泉)生态功能保护区构成的区域生态体 系，列 出南部山区北
缘丘陵区、小清河等 4个生态脆弱区和南部低山丘陵区杂木林地等 5种重点生态保护区域。按照生态市建设标准，济南市将在
循环经济体系建设、环境污染防治体 系、安全保障体 系、自然生态保护体 系、恢复泉城特色保障体 系、生态型人居环境与循环型社
会体系和生态文化体 系等 7个重点领域制定建设 目标、具体建设措施和重点工程项 目，保障城市生态系统的高效运转，维护区域
生态安全 ，带动 区域 自然生态环境的发展。即在循环经济体 系建设领域确定 了济南市生态产业发展战略，产业结构和空间布局
的优化方案。重点从产业调整、建设生态产业群等 7个方面建设新工业经济体 系。从农业生态环境建设等 3个层次逐步形成优
化的农业经济体 系，大力发展 生态物流业、生态商业等多种服务行业，保障城 市生态系统的健康 高效运转；在环境污染防治体 系
建设领域以水、气污染治理为重点，从总量控制、区域治理、生产过程控制和加强监测等方面制定措施与方案，在近、中期 完成治
理任务，中远期则重点加强废弃物循环利用；在安全保障体系建设领域强调水资源保护和生态安全保护，着重加强以中水回用为
主的资源循环利用和节水农业建设，通过提 高蓄留量和用水效率，改变制约济南市发展 的水资源状况 ；在 自然生态保护体 系建设
领域着重制定 了2区 1园和生态功能保护区的建设措施 ，南部山区东片丘陵等 4个区域 生态恢复措施，以此带动区域 自然生态
环境的恢复和发展；在恢复泉城特 色的保障体 系建设领域重点规划 了影响恢复泉城特 色风貌的水生态体 系建设 ，道路与公共交
通、供热供 气供电、信息网络等基础设施建设，人 口、绿地等方面的结构控制等 21方案，并规划 了老城 区和商埠区景观建设、“两
横四纵”的中心城区结构性生态隔离带建设等重点建设项目；在生态型人居环境与循环型社会体系建设领域重点规划了发展生
态建筑和通过 生态居住小区建设逐步进行循环社区试点建设等方案；在生态文化体 系建设领域重点加强基础教育和科普宣传，
开展生态文化活动，引导绿 色消费等方面建设，发掘和发扬优 秀的生态文化传统，保障规划建设的实施，为创建济南绿 色生态市
及其可持续发展奠定良好基础。
(段武德 农业部 北京 100026)