全 文 ：文章编号:1006-3110(2008)01-0229-03
高效液相色谱法测定木芙蓉叶中芸香苷含量的研究
沈　平 , 黄道平 , 谢燕湘
　　摘要:　目的　建立木芙蓉提取物中芸香苷含量的 HPLC 定量测定法。 　方法　 采用 HPLC 法进行测定 , 干木芙
蓉叶用 60%甲醇水浴回流提取 ,选择 Nove-park C l8(3.9×150 mm , 4 μm)色谱柱 , 以甲醇:1%醋酸溶液(50:50)为流动
相 ,流速 1 ml/min , 紫外检测器波长为 254 nm 进行高效液相色谱测定。 　结果　木芙蓉提取液中芸香苷分离良好 ,测定
芸香苷含量在 0.2%左右。 　结论　 本方法快速 、准确且操作简单 , 可作为木芙蓉叶中芸香苷含量测定的有效方法。
关键词:　高效液相色谱;芸香苷;木芙蓉
中图分类号:R-331　　　　　文献标识码:B
　　芸香苷又名芦丁 ,为黄色结晶粉末或无晶形粉末 ,有苦味 ,
略溶于冷水 ,能溶于热水 、乙醇 、甲醇 , 遇光易变质[ 1] 。芸香苷
可用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血 , 降低人体血脂和胆
固醇 ,是治疗高血压 、心血管疾病等多种疾病的良药[ 2 , 3] 。芸香
苷主要存在于豆科植物槐的花蕾 、果实等植物中[ 4] 。目前测定
芸香苷的方法有滴定法 、紫外可见光光度法 、荧光法[ 5] 等。本
文采用高效液相色谱法测定木芙蓉叶中芸香苷的含量 ,采用甲
醇回流法对木芙蓉叶进行提取。
1　材料与方法
1.1　主要仪器与试剂　高效液相色谱仪(waters1525 美国 w a-
ters公司生产), 配套的紫外检测器 , 液相色谱进样针(25 μl),
作者单位:常德市疾病预防控制中心(湖南　常德　 415000)
作者简介:沈平(1982-),男 ,学士 ,检验师 ,主要从事理化检验工作。
Nove-park C l8(3.9 ×150 mm , 4 μm), 电子天平(岛津
AUW220), 甲醇(色谱纯)、冰醋酸(AR纯)、芸香苷对照品(中国
药品生物制品检定所提供)、去离子水 、木芙蓉叶(采自湖南省
常德市临江公园内)。
1.2 　色谱条件　 色谱柱为 nove-park Cl8(3.9×150 mm , 4
μm),流动相为甲醇+1%醋酸溶液(50:50), 流速为 1.0 ml/
min ,检测波长 254 nm , 进样量为 10μl。
1.3 　样品预处理　新鲜木芙蓉叶先用自来水冲洗干净 ,再用
去离子水洗涤 2 次 , 凉干 , 置于洗净的蒸发皿中 , 于 60 ℃干燥
24 h。用电子天平精确称取干木芙蓉叶约 3 g , 置于 100 ml圆
底烧瓶中 , 再用量筒量取 40 ml、60%的甲醇溶剂加入到圆底烧
瓶中 , 70 ℃水浴回流 2.5 h 左右 , 趁热抽滤 , 残渣用甲醇洗涤 2
～ 3 次洗涤液并入滤液 , 滤液再用定量滤纸过滤 , 滤液用 60%
甲醇定容于 100 ml容量瓶中 , 再用移液管从中移取 10 ml于 25
2.2 　干扰的消除　石墨炉原子吸收法测定水中的钒必须考
虑干扰的消除 ,文献报道的一些干扰 , 可以加入铝盐使最终浓
度达 2 000μg/ml AI3+即可克服。地表水中常见成分元素不产
生干扰 ,废水中的共存离子和化合物在常见浓度下也不干扰测
定。但当钒的浓度为 1 mg/ L , 而铅 、钼的浓度超过 300 mg/ L ,
铁的浓度超过 200 mg/ L , 砷 、锑 、铋的浓度超过 100 mg/ L , 硝酸
的浓度超过 6%时 , 将会抑制钒的吸收信号 , 使钒的测定结果偏
低。
表 2　水中钒含量测定回收率实验
样品 测定均值(μg/ L) 加标量(μg/ L) 测定总值(μg/L) 回收率(%)
井水 15.2 25.0 38.0 91.2
15.2 50.0 65.5 100.6
15.2 60.0 78.2 105.0
2.3　线性范围及检出限　在本方法确立的条件下 , 钒的线性
范围在 0～ 100 μg/ L ,相关系数是 0.9970。根据该仪器设定的
测定检出限程序 ,连续测定空白溶液 7 次 , 用 3 倍空白溶液吸
光度值的标准偏差除以标准曲线斜率得到钒检出限为 8 μg/ L。
2.4 　石墨管的影响　本法应使用热解涂层石墨管 , 因钒属
高温元素 ,难以原子化 , 故要采用高温原子化。 为了防止石墨
炉分析时会有“记忆效应” , 应采用“空烧”减少 , 空烧过后再测
空白溶液确认无“记忆效应”后再测样品溶液 ,这样才能确保消
除“记忆效应”的干扰。
2.5 　保护气的影响 　保护气应使用氩气 ,避免使用氮气 , 据
报道氮气能与石墨管上的碳形成碳氮化合物损坏石墨管和干
扰测定 ,使用氩气测定的灵敏度可提高 2倍。
3　小结
采用适当处理的样品 , 石墨炉原子吸收法测定水中的钒 ,
灵敏度 、回收率高 , 检出限低 ,精密度好 ,抗干扰能力强 , 操作简
单 、快速 , 可以满足水中钒日常分析工作的需要。
[ 参考文献]
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(收稿日期:2007-09-26)
229实用预防医学　2008年 2月　第 15卷　第 1期　Practical Preven tive Medicine , Feb.2008 , Vol 15 , No.1
ml容量瓶中用 60%甲醇定容。 2　结果与讨论
2.1　色谱图　标准品及样品的色谱图对照见图 1 、图 2。
　　　　　　　　图 1　芸香苷标准物质样品 图 2　木芙蓉叶提取物样品
2.2　标准曲线的确定　以峰面积 A 对浓度 C(mg/ L)作图 ,得
到相关线性方程。见表 1 和图 3。
表 1　A(峰高)—C(标准物质浓度)关系试验
序号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
芸香苷的浓度(mg/ l) 4.16 8.32 16.64 24.96 33.28 41.60
峰面积 37245 97092 221800 349913.5 489945.5 591576
图 3　芸香苷的标准曲线
表 2　回流水浴温度考察试验
序号 ① ② ③ ④
回流水浴温度 ℃ 55 65 70 75
芸香苷的含量( x) 0.092% 0.125% 0.136% 0.123%
2.3　对回流提取方法各影响因素的讨论
2.3.1　回流水浴温度　芸香苷需要一定的能量与甲醇中的羟
基形成化学键 ,来完成溶解过程 , 所以加热利于溶解提取[ 6] , 但
温度过高会破坏溶解形成的化学键 ,使溶解度降低。用纯甲醇
做回流试剂(其沸点为 64.6 ℃),选择四个有代表性的温度(55
℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃),每次回流 1 h ,四次平行实验 , 结果表明
提取最合适水浴温度为 70 ℃, 见表 2。
表 3　溶剂浓度考察试验
序号 ① ② ③ ④
甲醇溶剂的浓度 50% 60% 70% 80%
芸香苷的含量( x) 0.20% 0.21% 0.19% 0.17%
表 4　精密度试验数据及处理结果
浓度(mg/ l) 实测浓度(mg/ l) 平均值 RSD
8.09
8.36 8.47 8.30 6.02%
8.25
8.37
25.17
25.08 24.35 25.02 5.32%
25.35
25.12
41.73
41.8 42.67 41.58 5.99%
42.31
39.59
2.3.2　溶剂的浓度　 芸香苷分子中含有多个醇羟基和酚羟
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基[ 7] ,能溶于极性物质水中和溶于非极性物质甲醇中 , 在甲醇
的水溶液中溶解比较好 , 现用 40 ml不同浓度的甲醇(50%、
60%、70%、80%)于 70 ℃水浴上回流 3 h , 四次平行试验得出提
取溶剂甲醇的适宜浓度为 60%, 结果见表 3。
2.3.3　溶剂用量　分别用四个不同量 60%甲醇作溶剂于 70
℃水浴中回流1 h。四次平行实验 , 得到提取的溶剂甲醇适宜用
量为 40 ml。
2.3.4　回流时间　用 40 ml , 60%的甲醇作溶剂 ,于 70 ℃水浴
回流提取 ,进行五次平行试验 , 结果在 2.5 h 内随提取时间的增
加芸香苷的含量明显增加 , 之后虽然含量有增加 , 但变化并不
大 ,所以选择 2.5 h 作为回流时间。
2.4　芸香苷测定条件的讨论
2.4.1　色谱柱的选择　 C18柱对黄酮类化合物能够有效的分
离 ,且 C18柱子芸香苷的出峰时间在 3 min 之内。 本实验选用
C18柱作为色谱柱。
表 5　试验结果处理及回收率试验
次序 木芙蓉叶质量
(g)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
含量 or回收率
(%)
含量 or回收率平均值
(%)
第 一 次 5.94 0.198
3.0064 0 6.12 0.204 0.20(含量)
6.03 0.201
8.1 114.8
3.0070(已知含量 0.20%)1.04 7.53 106.7 105.8(回收率)
6.76 95.83
6.35 0.211
第二 次 3.0092 0 6.78 0.225 0.23(含量)
7.46 0.248
7.57 95.10
3.0089(已知含量 0.23%)1.04 8.21 103.1 95.55(回收率)
7.04 88.44
6.38 0.212
第三次 3.0060 0 5.49 0.183 0.21(含量)
7.13 0.237
7.02 95.46
3.0065(已知含量 0.21%)1.04 6.93 94.23 92.65(回收率)
6.49 88.25
2.4.2　检测波长的选择　将芸香苷的甲醇标准溶液在紫外分
光光度计上进行扫描 , 得到芸香在 190 ～ 600 nm 范围内有 202、
254 nm 2 个特征吸收峰 ,在 202 nm 处芸香苷吸收较254 nm 大 ,
但由于 1%醋酸溶液 , 甲醇的影响 , 以 202 nm 作为检测波长干
扰因素多 , 所以选择 254 nm 作为检测波长。
2.4.3　流动相的选择　选择甲醇-1%醋酸溶液(V/ V)为 70:
30 , 60:40 , 50:50 三个不同比例进行比较 , 结果显示当甲醇-
1%醋酸为 50:50时芸香苷与其他成分的分离效果良好。
2.4.4　流速的选择　选取 0.8 、1.0 、1.5 ml/min三个不同流速
进行试验 , 通过实验发现当流速为 l ml/ min 时峰形对称 , 分离良
好 , 且系统压力适中 ,所以选择样品测定的流速为 l ml/min。
2.5 　精密度试验　 取芸香苷标准溶液高 、中 、低三个浓度
(8.32、24.96 、41.6 mg/ L), 分别进行 HPLC 测定 , 结果显示有
较好的精密度 , 见表 4。
2.6　试验结果及回收率试验　 分别称取两份木芙蓉叶 , 置于
100 ml圆底烧瓶中 ,在另一份样品的烧瓶中加入已知含量的芸
香苷标准溶液 , 再在两个烧瓶中分别加入 40 ml , 60%的甲醇 , 随
后的处理方法同样品处理 , 测定其芸香苷的含量 ,可得到样品中
芸香苷含量的平均值为 0.213%,相对平均偏差为 5.16%;回收
率的平均值为 98%, 相对平均偏差为 5.13%, 三次实验结果见
表 5。
3　小结
本文采用高效液相色谱法测定木芙蓉提取物中芸香苷的含
量。水浴回流提取温度 70 ℃, 时间 2.5 h , 甲醇浓度 60%,甲醇
用量 40 ml , 提取效果好;分离测定样品采用 C18(3.9×150 mm ,
4μm), 流动相为甲醇+1%醋酸(50/50 , V/ V), 流速为 l ml/
min ,紫外检测器的检测波长为 254 nm , 测定结果很好 , 对提取
的样品进行测定得知芸香苷的含量在 0.2%左右。
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(收稿日期:2007-10-13)
　
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