全 文 ：52　 2005, No. 4化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering
基金项目:广东省重大项目(A301020301)
收稿日期:2005 - 01 - 28
作者简介:黄建林(1961 -),女 ,湖北武汉人 , 博士 ,主要从事药用植物分析方面的研究。
微波萃取 、高效液相色谱法测定番石榴叶
中的齐墩果酸和熊果酸
黄建林1 , 张展霞2
(1. 湖北大学化学与材料科学学院 ,湖北 武汉 430062;2. 中山大学化学与化学工程学院 ,广东 广州 510275)
　　摘　要:建立了微波萃取 、高效液相色谱测定番石榴叶中齐墩果酸和熊果酸的方法。 采用分式析因设计实验考察了微波萃取
参数的影响 ,番石榴叶粒度和萃取时间是影响齐墩果酸和熊果酸的微波萃取产率的最重要因素。优化的微波萃取条件如下:60 ～
80 mesh番石榴叶 、10 m L乙醇 、80℃和10 min。微波萃取与索氏萃取得到的齐墩果酸和熊果酸产率一致 ,然而 ,前者仅需10 min , 后
者则需要4 h。
关键词:微波辅助萃取;高效液相色谱;番石榴叶;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:R 284. 2　O 652. 63　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672 - 5425(2005)04 - 0052 - 03
　　齐墩果酸和熊果酸广泛分布于药用植物中 ,具有
重要的药理活性 , 如抗炎 、镇静 、防肿瘤 、降血糖
等[ 1 , 2] 。测定药用植物中齐墩果酸和熊果酸的含量
时 ,常采用索氏萃取法进行萃取。索氏萃取法具有操
作简单 、不需过滤萃取液及萃取重现性好等优点 ,但萃
取时间较长 , 一般需要 2 ～ 4 h[ 3 ～ 5] 。微波辅助萃取
(MAE)是利用微波能的加热效应来加速溶剂对固体
样品中目标化合物萃取的新技术。与传统的样品预处
理方法相比 ,MAE具有快速 、节省溶剂 、环保 、效率高
等优点 ,因此在分析化学的许多分支领域 ,如环境分
析 、药物与天然产物分析和聚合物分析的应用研究中
受到广泛重视。药用植物中齐墩果酸和熊果酸的微波
辅助萃取研究尚未见文献报道 。
番石榴叶是传统的植物药 ,我国及其它热带 、亚
热带国家民间有用番石榴叶及其提取物治疗肠胃
炎 、痢疾 、糖尿病等疾病的传统[ 6 , 7] 。作者研究了影
响番石榴叶中齐墩果酸和熊果酸的微波萃取参数 ,
建立了番石榴叶中齐墩果酸和熊果酸的 MAE-
HPLC 定量分析方法 ,该法具有准确 、操作简便和分
析速度快的优点 。
1　实验
1. 1　仪器和试剂
MARS-X微波加速溶剂萃取仪(CEM , 美国),
LC-VP 高效液相色谱仪(岛津 ,日本);5 μm , 250 mm
×4. 6 mm ,C18反相液相色谱柱(Lunar ,美国)。
齐墩果酸(中国药品生物制品检定所 ,北京),熊果
酸(Sigma ,美国),色谱纯甲醇 、乙腈(Merck ,德国),分
析纯甲醇 、乙醇(广州化学试剂厂),纯净水(怡宝 ,广
州),番石榴叶采自中山大学校园。
1. 2　微波萃取
称取 0. 5000 g 干燥的番石榴叶置于微波萃取罐。
加一定体积的溶剂浸没番石榴叶后 ,将密闭的萃取罐
置于微波萃取仪内 ,在一定温度下加热一定时间。待
萃取罐冷却后过滤 ,残渣用萃取溶剂清洗 2 ～ 3次 ,合
并滤液和洗涤液 ,用萃取溶剂定容至25 mL。
1. 3　色谱分析
将番石榴叶萃取液用0. 45 μm膜过滤后 , 取
10 μL注入液相色谱仪 。流动相由 0. 05%磷酸水
溶液(溶剂 A)、甲醇(溶剂 B)和乙腈(溶剂 C)组成 。
11% A /56%B /33%C 等梯度洗脱 ,流动相流速为
0. 6 mL min - 1 。采用外标法定量 , 测定波长为
210 nm 。
2　结果与讨论
2. 1　微波萃取条件
采用 5 因素 2 水平二分之一分式析因设计
(25 - 1)[ 8] ,实验初步考察了溶剂 、溶剂体积 、样品颗粒
度 、萃取温度和时间 5 个因素及相关 2 因素交互作用
对齐墩果酸和熊果酸萃取产率的影响 。试验参数 、水
平和实验结果列于表 1。
黄建林等:微波萃取 、高效液相色谱法测定番石榴叶中的齐墩果酸和熊果酸 /2005 年第 4 期 53　
表 1　 分式析因设计实验模型和实验结果
Tab. 1　 Fractional factorial design matrix(25- 1) and
experimental results
编号 温度℃ 时间min 体积mL 粒度mesh 溶剂
齐墩果酸收率
mg g - 1
熊果酸收率
mg g - 1
1 80 5 10 10～ 20 乙醇 0. 39 1. 25
2 100 5 10 10～ 20 甲醇 0. 42 1. 34
3 80 10 10 10～ 20 甲醇 0. 57 1. 83
4 100 10 10 10～ 20 乙醇 0. 55 1. 76
5 80 5 20 10～ 20 甲醇 0. 43 1. 37
6 100 5 20 10～ 20 乙醇 0. 44 1. 41
7 80 10 20 10～ 20 乙醇 0. 59 1. 77
8 100 10 20 10～ 20 甲醇 0. 57 1. 82
9 80 5 10 40～ 60 甲醇 0. 71 2. 27
10 100 5 10 40～ 60 乙醇 0. 69 2. 21
11 80 10 10 40～ 60 乙醇 0. 78 2. 51
12 100 10 10 40～ 60 甲醇 0. 78 2. 59
13 80 5 20 40～ 60 乙醇 0. 68 2. 18
14 100 5 20 40～ 60 甲醇 0. 69 2. 23
15 80 10 20 40～ 60 甲醇 0. 80 2. 61
16 100 10 20 40～ 60 乙醇 0. 82 2. 68
表 2　 方差分析结果
Tab. 2 ANOVA results
变差来源 齐墩果酸
平方和 自由度 均方 F
熊果酸
平方和 自由度 均方 F
时间 0. 0638 1 0. 0638 89. 86 0. 6848 1 0. 6848 244. 57
体积 0. 0010 1 0. 0010 1. 41 0. 0060 1 0. 0060 2. 14
粒度 0. 2475 1 0. 2475 348. 59 2. 8308 1 2. 8308 1011. 00
时间-粒度 0. 0022 1 0. 0022 3. 10 0. 0060 1 0. 0060 2. 14
误差 0. 0078 11 0. 00071 0. 0305 11 0. 0028
总和 0. 3224 15 3. 5581 15
F 0.01(1 ,11)=9. 65 , F 0. 10(1 , 11)=3. 23
方差分析结果显示 ,只有萃取时间和样品粒度两个
因素对齐墩果酸和熊果酸的萃取产率具有显著影响 ,萃
取时间越长 、样品粒度越小 ,齐墩果酸和熊果酸的萃取
产率越高。其它因素及因素间的二阶交互作用的影响
则不显著 ,甲醇和乙醇对两种酸的萃取产率没有表现出
显著的差异;用10 mL乙醇萃取得到的收率与用20 mL
乙醇萃取得到的收率之间无显著性差异;分别在80℃和
100℃萃取得到的两种酸的收率间也无显著差别 。由于
乙醇的毒性低 ,因此将乙醇选作萃取溶剂 ,乙醇的体积
和萃取温度则分别定为10 mL和 80℃。
为了确定最佳的萃取时间和样品粒度 ,按照 25 -1
设计实验结果给出的优化方向 ,即增加萃取时间和减
小番石榴叶颗粒度进行萃取 。图 1 显示 ,番石榴叶颗
粒度在 60 ～ 80 mesh 至 80 ～ 100 mesh之间时 ,齐墩果
酸和熊果酸的产率基本保持不变并达到最大 。减小样
品的颗粒度 ,样品的表面积则增大 ,萃取过程中的扩
图 1　番石榴叶粒度对萃取收率的影响
ig. 1　Effects of sample particle size on extraction yield
散 、渗透 、溶解等过程就越快。因此 ,小颗粒样品的萃
取效率往往比大颗粒样品的萃取效率高 ,但样品粉碎
度过细 ,样品颗粒表面太大 、吸附作用增强 ,反而影响
扩散速度 ,降低萃取效率。另外 ,样品颗粒度太小时 ,
还将增加过滤操作的难度 、减慢萃取液的过滤速度。
因此 ,番石榴叶粒度以 60 ～ 80 mesh为宜。将萃取时
间分别增加至 20 min和30 min时 ,齐墩果酸和熊果酸
的产率与萃取10 min时得到的相同。
采用微波辅助技术从番石榴叶中萃取齐墩果酸和
熊果酸时 ,优化的萃取条件为:60 ～ 80 mesh番石榴
叶 、10 mL乙醇 、80℃、10 min 。
2. 2　色谱分析条件
齐墩果酸和熊果酸是差向异构体 ,性质相似 ,难分
离。实验中发现流动相的组成 、比例以及流速的变化
对两种酸的保留时间和峰形有较大影响。以甲醇 、乙
腈和 0. 05%磷酸水溶液为流动相 ,三者的比例为 56∶
33∶11 、流速为0. 6 mL min- 1时 ,分离效果最好。齐
墩果酸和熊果酸的保留时间分别为 29. 933 m in 和
31. 022 min ,分离度为 1. 2 ,可满足定量分析的要求 。
齐墩果酸浓度在 2. 1 ～ 127. 2 μg mL - 1范围内
与峰面积呈线性关系 ,线性方程为:Area = 7956. 1
cOA - 396. 1(r = 0. 9994)。熊果酸浓度在 2. 3 ～
136. 8μg mL - 1范围内呈线性 ,线性方程为:Area =
8013. 6 cUA - 404. 6(r =0. 9993)。
2. 3　微波和索氏萃取法的比较
我国药典采取索氏萃取法萃取中草药中的熊果酸
以测定其含量[ 3] 。在测定中药中齐墩果酸和熊果酸含
量的文献报道中 ,也多采取索氏萃取法 。所以 ,以索氏
萃取法作为对照与微波辅助萃取法作了比较 ,索氏萃
取条件与文献[ 3]相同 ,所用溶剂为乙醚 ,萃取时间为
4 h ,结果见表 3 。表 3 中的数据显示 ,微波萃取得到
的齐墩果酸和熊果酸收率与索氏萃取法得到的一致 ,
但微波萃取时间仅为10 min 。
54　 黄建林等:微波萃取 、高效液相色谱法测定番石榴叶中的齐墩果酸和熊果酸 /2005 年第 4 期
表 3　 微波和索氏萃取收率 / mg g- 1
Tab. 3　　Extraction yields obtained with MAE and Soxhlet
化合物 萃取收率微波 索氏
齐墩果酸 0. 89 0. 92
熊果酸 2. 89 2. 95
2. 4　回收率与精密度实验
将一定量的齐墩果酸和熊果酸标样加至两种酸含
量已知的番石榴叶中 ,在优化的微波萃取条件下进行
萃取 ,并测定萃取物中两种酸的收率 ,计算回收率和相
对标准偏差 ,结果列于表 4中 。
表 4　 回收率及精密度测定
Tab. 4　Determination of recovery and precision of the method
化合物 加入量
mg g - 1
回收量
m g g - 1
回收率
%
RSD(n=6)
%
齐墩果酸 0. 61 0. 54 88. 5 1. 7
熊果酸 1. 60 1. 45 90. 6 1. 3
参考文献:
[ 1] 　肖崇厚 ,杨松松 ,洪筱坤.中药化学[ M] .上海:上海科学技术出版
社 , 1997:477.
[ 2] 　郭舜民 ,郭尧惠. 天然药降血糖成分的研究进展[ J] .海峡药学 ,
2000 , 12 (1):1.
[ 3] 　中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[ M ] .
北京:化学工业出版社 , 2000:22.
[ 4] 　殷明文 ,袁珂 ,张淑玲. H PLC 测定车前草提取物中熊果酸 、齐墩
果酸的含量[ J] .河南科学 , 2000 , 18 (3):262.
[ 5] 　石力夫 ,蔡溱 ,吴广通, 等.不同产地女贞子中水溶性活性成分及
齐墩果酸的反相高效液相色谱分析[ J] .中国中药杂志 , 1998 , 23
(2):77.
[ 6] 　全国中草药汇 编写组.全国中草药汇 (上 )[ M] .北京:人民
卫生出版社 , 1975:856.
[ 7] 　Yorik o D , Kuniko O , Kazumi U , et al. Ef fect s of ext ract of gua-
va leaves on th e development of diabetes in the db /db mouse an d
on the postprandial blood glucose of human subject s[ J] . N ipp on
Nogeikagaku Kaishi , 1998 , 72 (8):923.
[ 8] 　Douglas C M .著 , 汪仁官 ,陈荣昭 , 译. 实验设计与分析[ M ] . 北
京:中国统计出版社 , 1998:373.
HPLCDetermination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Psidium Guava
Leaves Using Microwave-assisted Extraction for Sample Pretreatment
HUANG Jian-l in1 ,ZHANG Zhan-xia2
(1. School of Chemistry and Material , Hubei Univ ersity , Wuhan 430062 ,China;
2. School o f Chemistry and Chem ical Engineering , Sun Yat-sen Universi ty , Guangzhou 510275 ,China)
Abstract:A MAE-HPLC method for the de termination of oleano lic acid and urso lic acid in guava leaves w as
developed. A fractional factorial e xperimental design allow ed for the determination of the ef fects o f ext raction
variables. The most impo rtant va riables w ere the sample particle size and the ex t ract ion t ime. Optimized MAE
condi tions included 60 ～ 80 mesh of guava leaves , 10 mL of ethanol , 80℃ and 10 min. The method w as accu-
rate and superior to the Soxhlet method in saving much ex t ract ion time.
Keywords:microw ave-assisted ex t raction;HPLC;guava leave;o leanolic acid;ur solic acid
(上接第 51页)
[ 8] 　杨善元. 叶绿素的吸收光谱特征[ J] . 发光与显示, 1985:6(2):
149.
[ 9] 　谭石慈 ,邢达 ,唐永红 , 等.植物叶片超弱发光光谱研究[ J] .光子
学报 , 2000 , 29(11):961-965.
[ 10] 　周禾 ,杨起简.生物超弱光子辐射的探测技术[ J] .北京农学院学
报 , 1995 , 10(2):88.
[ 11] 　Fay P. The Blue G reen s[ M] . Edward Amords , 1982:200-232.
[ 12] 　邢达 ,谭石慈 ,王维江 ,等.自发和光诱导的生物超弱发光图像的
探测[ J] .激光生物学报 , 1997 , 22(1):1035-1039.
Study on the Properties of Ultraweak Bioluminescence from Anabaena Flos-aquae
ZHANG Xin-ping , YUE Xia-li , HU Xian-wen , CHEN Jian-jun , DONG Yuan-yan
(S chool o f Science , Huazhong Agricul tural Univ ersity , Wuhan 430070 ,China)
Abstract:Using BPCL ult raw eak bio luminescence analy zie r , the delayed bioluminescent spect rum o f Ana-
baena f los-aquae had been fi rst systemat ically detected . Spect ral lines emi tted f rom Anabaena f los-aquae were
440 nm and 575 nm.
Keywords:ult raw eak bio lum inescence;Anabaena f los-aquae;study