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Determination of 10 phenolic compounds in extract from Bidens bipinnata by HPCE

HPCE法测定鬼针草提取液中10种酚类化合物



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 17 期 2013 年 9 月

·2404·
HPCE 法测定鬼针草提取液中 10 种酚类化合物
吴婷妮,余长柱,李 荣,孙晓梅,李 俊*
安徽医科大学药学院,安徽 合肥 230032
摘 要:目的 建立 HPCE-DAD 法测定鬼针草中 10 种酚类化合物(木犀草苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、水
杨酸、木犀草素、山柰酚、槲皮素、没食子酸和原儿茶酸)的方法,比较 6 种不同体积分数的乙醇对上述化合物提取效率的
影响。方法 实验考察了缓冲液 pH、浓度、分离电压、毛细管冷却液温度等因素对分离的影响。在 214 nm 检测波长下,60
cm 长毛细管中,25 mmol/L 硼砂(pH 9.5),分离电压 25 kV,毛细管冷却液温度 25 ℃时上述各化合物在 16 min 内能得到
完全分离。结果 木犀草苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、水杨酸、木犀草素、山柰酚、槲皮素、没食子酸和原
儿茶酸分别在 5.0~120、5.0~120、5.0~120、5.0~120、1.0~120、2.5~120、5.0~120、2.5~120、2.5~120、2.5~120 mg/L
与其峰面积呈线性关系,其检出限分别为 2.5、2.5、2.5、2.5、0.5、1.0、2.5、1.0、1.0、1.0 mg/L,精密度 RSD≤5.17%
(n=6),测定样品的加样回收率在 94.4%~105.8%,RSD 在 0.32%~4.33%。结论 鬼针草中木犀草苷、芦丁、槲皮素-3-O-
葡萄糖苷、槲皮苷、水杨酸、木犀草素、山柰酚、槲皮素、没食子酸和原儿茶酸的量分别为 95.04~105.84、78.03~110.45、
96.45~177.96、178.78~300.00、62.06~66.54、71.08~72.85、77.39~95.30、68.27~77.43、68.47~88.47、107.24~142.43 μg/g。
关键词:HPCE-DAD;鬼针草;酚类化合物;芦丁;水杨酸;木犀草素;山柰酚;槲皮素;没食子酸;原儿茶酸
中图分类号:R286.02 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)17 - 2404 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.17.012
Determination of 10 phenolic compounds in extract from Bidens bipinnata
by HPCE
WU Ting-ni, YU Chang-zhu, LI Rong, SUN Xiao-mei, LI Jun
School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
Abstract: Objective To develop a novel method using high-performance capillary electrophoresis coupled with DAD (HPCE-DAD)
for the simultaneous determination of 10 phenolic compounds (luteolin-7-O-glucoside, rutin, quercetin-3-glucoside, quercetin-3-
rhamnoside, salicylic acid, luteolin, kaemferol, quercetin, gallic acid, and protocatechuic acid) in Bidens bipinnata. The extraction
efficiency of above mentioned compounds was compared using six different ethanol/water solutions. Methods The effects of pH
value and concentration of buffer, applied voltage, and temperature on the separation were researched. The 10 compounds were
baseline separated within 16 min in a 60 cm length capillary at a separation voltage of 25 kV with a running buffer consisting of 25
mmol/L borate (pH 9.5) at wavelength of 214 nm. Results Excellent linearities of luteolin-7-O-glucoside, rutin,
quercetin-3-glucoside, quercetin-3-rhamnoside, salicylic acid, luteolin, kaemferol, quercetin, gallic acid, and protocatechuic acid were
observed at 5.0-120, 5.0-120, 5.0-120, 5.0-120, 1.0-120, 2.5-120, 5.0-120, 2.5-120, 2.5-120, and 2.5-120 mg/L,
respectively. The detection limits were at 2.5, 2.5, 2.5, 2.5, 0.5, 1.0, 2.5, 1.0, 1.0, and 1.0 mg/L, respectively. The relative standard
deviations (RSD) of precision were below 5.17% (n = 6). The mean recoveries for 10 phenolic compounds in B. bipinnata ranged from
94.4% to 105.8%, with RSD values of 0.32%-4.33%. Conclusion The contents of luteolin-7-O-glucoside, rutin, quercetin-3-
glucoside, quercetin-3-rhamnoside, salicylic acid, luteolin, kaemferol, quercetin, gallic acid, and protocatechuic acid in B. bipinnata are
95.04-105.84, 78.03-110.45, 96.45-177.96, 178.78-300.00, 62.06-66.54, 71.08-72.85, 77.39-95.30, 68.27-77.43, 68.47-
88.47, and 107.24-142.43 μg/g, respectively.
Key words: HPCE-DAD; Bidens Bipinnata L.; phenolic compounds; rutin; salicylic acid; luteolin; kaemferol; quercetin; gallic acid;
protocatechuic acid

收稿日期:2013-03-28
基金项目:安徽高校省级科学研究项目(KJ2013Z139);安徽医科大学校科学研究项目(2012xkj018)
作者简介:吴婷妮(1984—),女,助理实验师,研究方向为天然药物活性成分分析。E-mail: wtn2001ok@163.com
*通信作者 李 俊 E-mail: lj@ahmu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 17 期 2013 年 9 月

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鬼 针 草 Bidens bipinnata L. 为 菊 科
(Compositae)管状花亚科鬼针草属 Bidens L. 1 年生
草本植物,药材资源丰富,药用历史悠久,主治痢
疾、肝炎、胃痛、蛇虫咬伤等[1-2]。木犀草苷、芦丁、
槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、水杨酸、木犀草素、
山柰酚、槲皮素、没食子酸和原儿茶酸是鬼针草中
比较常见的酚类成分,具有抗微生物、抗氧化、抗
炎以及细胞毒性等药理作用[3]。
鬼针草药材活性成分分析方法主要是 HPLC
法,邓亚宁等[4]用 HPLC 法测定了鬼针草总黄酮部
位中芦丁的量。胡伟等[5]用 HPLC 测定了鬼针草药
材中金丝桃苷的量。李玉兰等[6]建立了小花鬼针草
的毛细管电泳特征图谱,尚未见毛细管电泳法
(HPCE)分离测定鬼针草中单体组分的报道。HPLC
法实际应用中常常遇到一些难题,如色谱柱容易污
染,使用寿命短;有机溶剂消耗多;甚至有时采用
梯度洗脱也难以实现组分的完全分离。毛细管电泳
法[7]高效、快速、低耗、简便、抗污染、抗干扰能
力强,是 HPLC 法的一种很好的补充。本课题以鬼
针草中的酚类化合物为研究对象,建立了 HPCE-
DAD 分离测定分析方法。
1 仪器与试药
P/ACE MDQ毛细管电泳系统(美国Beckman),
配备有二极管阵列检测器(DAD);未涂层石英毛
细管(60 cm×75 μm,有效长度 50 cm,河北鑫诺
光纤厂);PHS—3C 型精密酸度计(上海精密科学
仪器有限公司);FA2004A 型电子天平(上海精天
电子仪器厂);BP211D型电子天平(德国Startarius);
Milli—Q 型超纯水机(美国 Millipore);中药粉碎机
(瑞安市永历制药机械有限公司)。
木犀草苷(批号 100521,质量分数>98%)、
芦丁(批号 100305,质量分数>99%)、槲皮素-3-O-
葡萄糖苷(批号 100406,质量分数>98%)、槲皮
苷(批号 100127,质量分数>98%)、木犀草素(批
号 100612,质量分数>98%)、山柰酚(批号 100317,
质量分数>98%)、没食子酸(批号 100502,质量
分数>98%)均购于上海融禾医药科技发展有限公
司;槲皮素(批号 100081-200907,HPLC 测质量分
数为 96.5%)、原儿茶酸(批号 110809-200604,质
量分数为 99.9%)均购于中国食品药品检定研究院;
水杨酸购于上海山浦化工有限公司,质量分数≥
99%。鬼针草购于合肥市百姓缘大药房,产地为安
徽亳州,经安徽医科大学药学院副教授程文明鉴定
为菊科管状花亚科鬼针草属草本植物鬼针草 Bidens
bipinnata L. 的干燥全草。甲醇为色谱纯,天津市四
友精细化学品有限公司制造;乙醇为分析纯,上海
振兴化工一厂生产;硼砂为分析纯,汕头市西陇化
工厂有限公司生产。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
鬼针草粉碎成粉末,精密称取 1.00 g 粉末 6 份,
置于 6 个锥形瓶中,分别加水及 20%、40%、60%、
80%、100%乙醇 15 mL,超声提取 40 min,4 000
r/min 离心 30 min,取上清液,0.45 μm 微孔滤膜滤
过,即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取木犀草苷 4.0 mg,置 10 mL 量瓶中,
70%乙醇溶解后稀释定容,精密称取芦丁、水杨酸、
山柰酚、槲皮素、没食子酸各 10 mg,分别置 5 mL
量瓶,甲醇溶解后稀释定容,精密称取槲皮素-3-O-
葡萄糖苷、槲皮苷、木犀草素、原儿茶酸各 5.0 mg,
分别置 5 mL 量瓶中,甲醇溶解后稀释定容。其他
不同浓度的工作液,用上述对照品溶液稀释得到。
所有溶液均在 4 ℃避光保存。
2.3 电泳条件
运行缓冲液 25 mmol/L 硼砂(pH 值 9.5),分离
电压为 25 kV;检测波长为 214 nm;压力进样 3.4
kPa,5 s;温度为 25 ℃。每天开机后依次用 1 mol/L
HCl(5 min)、水(0.5 min)、甲醇(5 min)、水(0.5
min)、1 mol/L NaOH(5 min)、水(1 min)、缓冲
溶液(5 min)冲洗,进样前依次用甲醇(5 min)、
水(0.5 min)、1 mol/L NaOH(5 min)、缓冲溶液(5
min)冲洗以保证重复性。
2.3.1 缓冲溶液 pH值和浓度影响 pH值和缓冲溶
液浓度是影响 Zeta 电势、电渗流以及被分析物荷电
大小的重要因素,从而影响了迁移时间和被分析物
的分离情况。为了获得最优化的条件,首先对 pH
值和缓冲溶液浓度进行了研究。本实验电泳溶液为
硼砂体系,在 25 mmol/L 硼砂,25 kV 的条件下比
较了溶液 pH 值分别为 9.1、9.3、9.5、9.7、10.0 几
种酚类化合物的分离情况(图 1)。pH 值 9.1 时,水
杨酸和木犀草素未能基线分离;pH 值 9.3 时,木犀
草素和山柰酚两峰完全重合;pH 值 9.5 时,各物质
均完全分离;pH 值 9.7 时水杨酸和木犀草素未基线
分离;pH 值 10.0 时,水杨酸和木犀草素、山柰酚
和槲皮素、没食子酸和儿茶酸完全重合。因此,选
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 17 期 2013 年 9 月

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1-木犀草苷 2-芦丁 3-槲皮素-3-O-葡萄糖苷 4-槲皮苷 5-水杨酸 6-木犀草素 7-山柰酚 8-槲皮素 9-没食子酸 10-原儿茶酸
1-luteolin-7-O-glucoside 2-rutin 3-quercetin-3-glucoside 4-quercetin-3-rhamnoside 5-salicylic acid 6-luteolin 7-kaemferol
8-quercetin 9-gallic acid 10-protocatechuic acid

图 1 硼砂缓冲液 pH 值对酚类化合物分离的影响
Fig. 1 Effect of pH values of borate buffer on separation of phenolic compounds

择缓冲液 pH 值为 9.5。
在 pH 值 9.5,电压 25 kV 的条件下优化了硼砂
浓度(15、25、35 mmol/L,图 2)。15 mmol/L 时木
犀草素和山柰酚重合,25、35 mmol/L 时 10 个化合
物均完全分离,但 35 mmol/L 时分析时间更长。结
果表明,缓冲溶液浓度越大,分离度越好,同时电
流越大,电渗流越小,分析时间越长,且产生的焦
耳热越多,灵敏度也越低。所以选择缓冲溶液浓度
25 mmol/L。
2.3.2 分离电压的影响 在 pH 值 9.5,硼砂浓度 25
mmol/L 时,比较了分离电压 20、25、30 kV 对鬼针
草 80%乙醇提取液的影响(图 3),25 kV 时槲皮素-
3-O-葡萄糖苷与提取液中其他成分分离效果较好,
20、30 kV 时槲皮素-3-O-葡萄糖苷与其他成分重合。
同时可看出,分离电压越大,分离时间越短,峰越
窄,但焦耳热越多,噪声越大。实验选择分离电压
25 kV。
2.4 提取溶剂的优化
本实验考察了水及 20%、40%、60%、80%、
100%乙醇对 10 种酚类化合物提取效率的影响,采
用上述建立的方法,分析了 6 种不同溶剂的提取液,
每种样品按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备,
重复进行 3 次,实验报道的结果为 3 次分析数据的
平均值。各种溶剂提取液电泳谱图见图 4,分析结
果见表 1。水提取液中除木犀草素外,各化合物的
量均较高,因此,本实验选择水作为提取溶剂。




图 2 硼砂缓冲液浓度对酚类化合物分离的影响
Fig. 2 Effect of borate concentration on separation of phenolic compounds
pH 9.1
0 4 8 12 16 0 4 8 12 16 0 4 8 12 16
pH 9.3 pH 9.5
0 4 8 12 16 0 4 8 12 16
t / min
pH 9.7 pH 10.0
1 2 3 4
7
56
8
9
10
1 234
5
6+7
8
9
1
10 10
10
2 3 4
5
6
7 8
9
1 2 3 4
5
6
78
9
1 2 3 4
5+6
7+8 9+10
15 mmol·L−1 25 mmol·L−1 35 mmol·L−1
0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24
t / min
1 2 3 4
5
6 7 8
9 10
1 2
34
5
6
78
910
10
9
8
1 2 4
3
5
6+7
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图 3 分离电压对鬼针草提取液的影响
Fig. 3 Effect of separation voltage on extracting solution of B. bipinnata







图 4 鬼针草样品溶液 HPCE-DAD 谱图
Fig. 4 HPCE-DAD electropherograms of extracting solution of B. bipinnata

2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察、检出限和定量限试验 在优
化条件下,分析测定了 1.0~120 mg/L 不同浓度的
混合对照品溶液,以峰面积积分值(Y)对质量浓
度(X)作图,得到线性方程、线性范围和相关系
数(0.998 4~0.999 9),并根据 3 倍信噪比和 10 倍
信噪比对应质量浓度确定其检出限和定量限。结果
表明线性关系良好,最小检出限为 0.5 mg/L,最小
定量限为 1.0 mg/L,见表 2。
2.5.2 精密度试验 在上述优化条件下,将 10
mg/L 的混合对照品溶液在同 1 天内重复进样 6 次,
计算峰面积的 RSD,表示精密度。结果表明精密度
RSD≤5.17%,见表 2。
2.5.3 稳定性试验 取供试品水提取液在 0、2、4、
6、8、12 h 测定 10 种化合物的峰面积,得 RSD 分
别为 4.17%、2.11%、4.39%、1.62%、2.73%、4.27%、
1.08%、4.55%、1.28%、1.77%,表明供试品溶液在
12 h 内稳定。
2.5.4 重复性试验 取同一批供试品粉末 6 份,制
备水提取液,进样测定,计算各化合物的质量分数,
得 RSD 为 2.41%、1.31%、4.30%、1.78%、4.31%、
5.37%、1.74%、4.31%、2.58%、4.38%。
水提取液 20%乙醇提取液 40%乙醇提取液
60%乙醇提取液 80%乙醇提取液 乙醇提取液
1
2
3
4
5
6 7
8
9
10
1
2
3
4
56 7
8
9
1
10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10 1
2
3 4
5
6 7 8 9
10
10
1 2
3 4 5
6 7
9
3 3
3
4 8 12 16 4 8 12 16 4 8 12 16
t / min
20 kV 25 kV 30 kV
4 6 8 10 12 14 16 4 6 8 10 12 14 16 4 6 8 10 12 14 16
t / min
4 6 8 10 12 14 16 4 6 8 10 12 14 16 4 6 8 10 12 14 16
t / min
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表 1 6 种样品液的分析结果 (n=3)
Table 1 Assay results for six kinds of samples (n=3)
质量分数 / (μg·g−1)
提取溶剂
木犀草苷 芦丁 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 槲皮苷 水杨酸
水 95.24±2.67 106.04±4.91 176.56± 8.35 178.78±7.62 65.72±1.84
20%乙醇 93.02±3.85 94.66±2.88 151.92± 4.77 174.08±6.61 66.31±1.61
40%乙醇 88.79±0.94 94.18±2.45 118.64± 5.17 164.12±7.90 65.23±0.53
60%乙醇 96.66±5.32 95.31±2.99 119.96±10.50 166.69±6.67 67.36±0.62
80%乙醇 85.48±2.85 80.98±1.98 96.65± 4.81 103.15±3.27 63.08±0.81
乙醇 74.56±1.03 72.00±0.41 71.96± 3.62 65.95±3.07 -
质量分数 / (μg·g−1) 提取溶剂
木犀草素 山柰酚 槲皮素 没食子酸 原儿茶酸
水 - 91.82±4.36 74.11±3.16 86.13±3.35 133.96±7.94
20%乙醇 70.83±1.83 71.75±1.07 68.45±0.32 75.56±2.16 124.32±2.90
40%乙醇 73.74±0.82 73.54±3.84 69.05±0.90 79.27±3.18 115.68±5.11
60%乙醇 81.28±1.17 72.83±1.39 69.13±1.69 78.12±0.80 117.55±6.01
80%乙醇 77.03±1.52 72.21±3.54 - 74.11±1.11 99.89±3.65
乙醇 72.71±0.81 - - 73.53±1.95 79.13±3.45
“-”未定量
“-” not be quantitative

表 2 线性关系、检出限、定量限及精密度
Table 2 Results of linear relationship, LOD, LOQ, and RSD
化合物 线性方程 r 线性范围 / (mg·L−1) 检测限 / (mg·L−1) 精密度 RSD / %
木犀草苷 Y=749.32 X+221.12 0.999 4 5.0~120 2.5 4.50
芦丁 Y=792.10 X+152 0.998 4 5.0~120 2.5 3.74
槲皮素-3-O-葡萄糖苷 Y=896.70 X+663.04 0.999 0 5.0~120 2.5 4.16
槲皮苷 Y=1 109.2 X+544.94 0.999 4 5.0~120 2.5 4.21
水杨酸 Y=2 228.8 X+1 679.5 0.999 9 1.0~120 0.5 3.71
木犀草素 Y=2 264.5 X+749.52 0.999 2 2.5~120 1.0 4.23
山柰酚 Y=1 772.5 X+1 346.3 0.998 6 5.0~120 2.5 5.17
槲皮素 Y=2 405.0 X+1 218.6 0.999 7 2.5~120 1.0 5.03
没食子酸 Y=4 214.9 X+228.73 0.999 9 2.5~120 1.0 4.24
原儿茶酸 Y=4 098.0 X+3 024.8 0.999 7 2.5~120 1.0 3.97

2.5.5 加样回收率试验 精密称取 6 份 1.0 g 样品,
分别精密加入相当量的对照品溶液,按“2.1”项下
水提取液制备方法制备,在优化条件下分析测定,
计算加样回收率。结果木犀草苷、芦丁、槲皮素-3-O-
葡萄糖苷、槲皮苷、水杨酸、木犀草素、山柰酚、
槲皮素、没食子酸、原儿茶酸的加样回收率分别为
99.83%、101.07%、100.37%、99.69%、99.09%、
100.49%、100.49%、98.913%、100.96%、98.85%;
其 RSD 分别为 0.94%、4.33%、1.48%、1.07%、1.30%、
1.49%、1.07%、0.40%、0.72%、0.32%。
2.6 样品测定
在选定的实验条件下,取不同批次鬼针草药材
的样品溶液进样测定峰面积,根据线性回归方程计
算出各化合物的质量分数,结果见表 3。
3 讨论
本实验考察了不同体积分数的乙醇对 10 种酚
类化合物提取效率的影响,结果表明,芦丁、槲皮
素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、原儿茶酸随乙醇体积分
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 17 期 2013 年 9 月

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表 3 鬼针草提取液中酚类化合物的质量分数 (n=3)
Table 3 Determination of phenolic compounds in extracting solution of B. bipinnata (n=3)
质量分数 / (μg·g−1) 样品
木犀草苷 芦丁 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 槲皮苷 水杨酸
1 98.00±1.67 110.45±4.36 177.96±7.68 186.17± 5.84 66.54±2.40
2 95.04±2.09 100.75±4.86 167.60±7.32 179.21± 4.92 63.61±2.07
3 95.24±2.67 106.04±4.91 176.56±8.35 178.78± 7.62 65.72±1.84
4 115.04±4.50 84.42±2.52 104.64±3.79 280.12±12.95 64.71±1.88
5 105.84±5.13 78.03±3.16 96.45±3.66 261.81±10.01 62.06±2.86
6 98.58±2.50 82.50±2.91 110.11±4.66 300.00± 8.41 66.10±1.76
质量分数 / (μg·g−1) 样品
木犀草素 山柰酚 槲皮素 没食子酸 原儿茶酸
1 71.18±2.53 92.81±4.04 77.43±1.84 88.47±3.77 142.43±4.29
2 71.50±3.31 87.05±4.07 71.14±2.45 82.29±2.37 126.69±6.13
3 - 91.82±4.36 74.11±3.16 86.13±3.35 133.96±7.94
4 71.30±2.44 85.76±3.92 70.68±1.70 72.15±2.60 111.50±3.01
5 72.85±1.70 77.39±2.66 68.27±3.79 68.47±2.58 107.24±5.15
6 71.08±0.30 95.30±2.83 73.63±1.76 72.12±3.20 123.01±2.61

数增高,提取效率下降;木犀草苷、水杨酸、木犀
草素、山柰酚、槲皮素、没食子酸的量偏低,在各
提取液中量相差很小。
检测结果表明,HPCE-DAD 是分析鬼针草酚类
化合物的一种可以选择的方法,选择合适的提取溶
剂很重要,中药中化合物的提取效率与其溶解性、
在中药中的量均有关。为保证实验的重复性,毛细
管一定要进行充分的冲洗,本实验中乙醇提取液比
较容易吸附于毛细管壁,增加碱液冲洗非常重要。
参考文献
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