全 文 ：第 30卷　第 2期
1998年 3月
生物化学与生物物理学报
ACT A BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA
Vo l. 30, No. 2
M ar. , 1998
收稿日期: 1997— 05— 05　　接受日期: 1997— 06— 27
* 国家自然科学基金资助课题
蓖麻蚕 rDNA基因核骨架结合区在酵母中的
自主复制功能*
何明亮　赵慕钧　李载平
( 中国科学院上海生物化学研究所 , 中国科学院上海生命科学联合开放实验室 , 上海 200031 )
摘要　　蓖麻蚕核糖体 RNA基因 ( rDNA ) 5′-非转录间隔区有长约 1 kb的核骨架结合区 SAR ( scaffo ld-associa t-
ed r egion) [1 ]。本文对该 SAR元件的酵母自主复制功能进一步研究 , 证明该 SAR 5′端 688 bp含有 12个 ACS
( ARS的核心序列 ) 同源序列 , 但无 ARS活性 , 而其 3′端仅 3个 ACS同源序列 , 但对酵母的转化率比全片段还高
40～ 50倍。体外结合实验证明 , 蓖麻蚕 rRN A基因的 SAR能专一地同酵母核骨架结合 , 提示 ARS的功能体现与
核骨架结合紧密相关。 rRNA基因 SAR与 ARS的功能在进化上可能是很保守的。在此基础上可进一步分析 SAR
中与 DN A复制相关的正调及负调元件。
关键词 　　蓖麻蚕 ; rRNA基因 ; 核骨架结合区 ( SAR); 酵母自主复制序列 ( ARS)
　　真核生物的 DNA复制十分复杂 , 它受染色体
上 DNA复制起点 ( replica tion o rigin)和终止位点
( termina to r)的控制 , 并受细胞周期控制 ( cell cy-
cle control ) , 它与染色质的构象变化 , 与核骨架
( nuclear scaf fold)或核基质 ( nuclear matrix )密切
相关 [ 2]。在目前为数不多的几个已被证明是真核基
因的 DNA复制起点中 , 还未在一级结构上找到共
同的调控元件 [3 ]。真核细胞染色质上专一性与细胞
核骨架 /核基质结合的 DNA区域 , 称为 SAR /
MAR元件 , 是染色质环状结构域形成的基础。
SAR位于染色质环的基部 , 通过与核骨架蛋白的
相互作用 , 控制染色质环的开放或关闭。由于众多
的转录调控因子和复制有关的蛋白质复合体结合在
核骨架上 , 或者就是核骨架的构成成份 , 因此 SAR
在基因的表达和 DNA复制的调控中起重要作
用 [4, 5 ]。酵母基因组复制的研究表明 , 一些自主复
制元件 ( autonomously replicating sequence, ARS)
在染色体上能够启动染色体的复制 , 并与酵母核骨
架有专一性结合 [6 ]。那么 SAR元件与 ARS功能之
间存在什么联系? Amati发现果蝇的 SAR在出芽
酵母和裂殖酵母细胞中有自主复制 ( ARS)功能 [4 ] ,
我们检测的蓖麻蚕 rRN A基因 SAR元件也有 ARS
活性 [ 1]。 SAR元件具有 ARS活性说明了 SAR在进
化上的保守性 , 并且有可能是真核基因的 DNA复
制起点。为了进一步探索 SAR元件对 DNA复制的
作用机制 , 我们对 SAR元件的 ARS功能作进一步
研究 , 发现 SAR 5′端 688 bp虽含 12个 ACS同源
序列 ( ARS consensus sequence, ACS) , 但无 ARS
活性 , 而 3′端仅 3个 ACS同源序列 ,但对酵母的转
化率比全片段高 40～ 50倍。说明单一的 ACS核心
序列并不能决定 ARS的活性 , 系受一定的机制所
控制。 DNA体外结合实验的结果显示 , 蓖麻蚕 rD-
N A的 SAR ( Sac II-EcoRI片断 )能专一地与酵母
核骨架结合 , 说明 SAR的核骨架结合功能可以在
种间进行 , 并且与 ARS的活性有关。
材 料 和 方 法
1. 1　材料
大肠杆菌 TG1 ( tet- , amp- ) ; 酵母 EAL103
( leu
- , trp
- , ura
- ) ; 含有蓖麻蚕完整转录单位的
质粒 pAR III, 酵母整合型质粒 YIP5及克隆载体
质粒 pBluescript , pSK( Stratagene) ,由本实验室提
供。限制性内切酶、 T4 DNA聚合酶、 T4 DNA连接
酶 购 自 GIBICO-BRL、 NewEngland Biolabs 或
Boehringer Mannheim等公司。 Ly ticase, 二碘水杨
酸锂 ( L IS) 购自 Sigma公司。酵母基本氮源购自
Difco公司。
1. 2　方法
1. 2. 1　检测酵母自主复制质粒的构建　　用
EcoRI和 Sma I切割酵母整合型质粒 YIP5, 低熔点
胶分离出包含四环素抗性基因 ( tetR )及 URA 3基
因的 DNA片段 ,同时用 EcoRI和 EcoRV切割载体
pSK ( Stra tagene) , 将它们用 T4 DNA连接酶连接
后 , 构建成酵母整合型质粒 pSKY。 rDN A片段可
直接插入该载体的多克隆位点 , 用于 ARS功能检
测。克隆操作基本参照分子克隆手册 [7 ]。
1. 2. 2　酵母转化　　酵母受体菌的制备及转化方
法见参考文献 [5] , 略有修改。接种 EAL103于 3
m l Y PD培养基 ( 20 g /L gluco se, 10 g /L bacto-
yeast ex t ract, 20 g /L bacto-peptone)中于 30℃培
养过夜 , 转移至 20 m l YPD培养基中培养至 A600=
0. 3～ 0. 5, 稀释于 200 ml的 Y PD液体培养基中 ,
于 30℃培养 1～ 2代 ( 2～ 4 h) , 25℃ 3 000 r /min
离心 5 min, 菌体用 10 ml的 T E洗两遍 , 悬浮于 1.
5 ml的 TE /LiAc中 , 1体积 ( pH 7. 5)的 10× T E,
1体积的 1 mo l /L LiAc, 8体积的灭菌水 , 于 30℃
轻轻摇动 30 min。取 1μg质粒 DNA及 200μg变
性小牛胸腺 DNA, 使 DNA总体积≤ 50μl, 加入
200μl受体菌和 1. 2 ml PEG4000 ( 8体积 500 g /L
的 PEG4000, 1体积的 10× TE, 1体积的 1 mol /L
LiAc) , 混合后于 30℃振摇 30 min。 42℃热冲 15
min, 3 000 r /min离心 1 min, TE洗两遍。加入
200μl Y PD, 于 30℃培养 30 min, 涂在 SD选择培
养基 ( 20 g /L g luco se, 6. 7 g /L ni t rogen base w /o
amino acids, 20 g /L agar, 30 mg /L Leu, 30 mg /L
Trp)平板上 , 于 30℃培养 4～ 5天 , 菌落计数。
1. 2. 3　酵母复制型质粒的提取及鉴定　　从选择
培养基平板上挑取酵母单菌落于 50 ml液体选择培
养基 SD中培养 24 h, 离心 , 收集菌体 , 水洗一遍。
将菌体悬于 2 ml SCE ( 1 mo l /L甘露醇 , 0. 1 mo l /
L乙酸钠 ( p H 7. 0) , 0. 01 mol /L EDT A, 100 mg /
L Lyticase, 0. 1%β -巯基乙醇 )中 , 37℃保温 1 h,
离心后收集菌体 , 然后按大肠杆菌质粒提取方法提
取质粒。用提取物转化大肠杆菌 TG1, 涂布于含有
四环素、氨苄青霉素 (终浓度为 50 mg /L) 的 LB
( 10 g /L蛋白胨 , 5 g /L酵母抽体物 , 10 g /L NaCl,
15 g /L琼脂粉 )平板上 , 37℃培养过夜。再从大肠
杆菌中提取质粒 , 经 EcoRI, SacII酶切后 , 于 12
g /L的琼脂糖中电泳。
1. 2. 4　带 ARS功能质粒丢失率的测定　　从 SD
平板上随机挑取 3个菌落分别放入 3 ml SD液体培
养基中于 30°C振荡培养 24 h, 用灭菌水按 10、
10
2、 103倍稀释后 , 分别涂布于 Y PD及 SD平板上 ,
将 YPD平板于 30°C培养 2天 , SD平板培养 3～ 4
天 , 菌落计数。同时 , 取上述液体 ( SD)培养物 , 用
Y PD培养基稀释至 A6 00= 0. 0 003, 于 30℃振荡培
养 16 h, 按上述方法分别涂布于 YPD及 SD平板
上培养 , 菌落计数并用公式 ( 1) 计算每代丢失
率 [8 ]。
丢失率 = 1 - e[ln (b /a ) ] /n ( 1)
公式中 a表示经过液体培养前酵母细胞中含有质粒
的百分率 , b表示经过液体培养后酵母细胞中含有
质粒的百分率 , n表示在液体中培养的代数。
1. 2. 5　螺旋稳定性分析　　使用 Thermodyn程
序 [9 ] , Rosw ell Park肿瘤研究所 Kow alski教授赠
送。通过滑动窗口的方法计算自由能 (ΔG) , 窗口
为 100 bp, 每步移动 1 bp。
1. 2. 6　与酵母核骨架的体外结合　　酵母核骨架
的分离参照文献 [6 ]。分离的酵母核骨架经 Hae III
酶切过夜 , 于 60°C保温 10 min。加入 10 ng的 [α-
32
P ] d ATP末端标记的 rDN A探针和 10μg 经
Hae III酶切的λDNA作为竞争 DNA, 于 37℃保温
3 h, 台式离心机中 10 000 r /min离心 10 min。分别
从上清和沉淀中纯化 DNA, 样品于 12 g /L的琼脂
糖介质中电泳。抽干后 , 放射自显影。
结 果
2. 1　酵母整合型载体 pSKY及含有 rDNA片段的
穿梭质粒 pSEY的构建
酵母整合型质粒 YIP5可以在大肠杆菌中复
制 , 带有氨苄青霉素 ( Amp)和四环素 ( Tc) 抗性
基因可作为筛选标记。但它不能在酵母中复制 , 只
有通过重组到酵母染色体上才能随染色体的复制而
复制。 YIP5带有 URA3基因可作为在酵母菌株
(URA 3缺失 ) 中的筛选标记。我们用 EcoRI和
Sma I切割 YIP5质粒 , 分离得到 2. 5 kb包含有四
环素抗性基因和 URA 3基因的 DNA片段 , 将其插
入到 pBluescript ( pSK)的 EcoRI-EcoRV位点 , 构
建成酵母整合型质粒 pSKY。该 pSKY带有原 pSK
质粒的多克隆位点 , 以便于各种 rDN A片段的直接
插入 , 用于检测 ARS功能。我们对蓖麻蚕 rDN A
全基因进行分段检测 , 结果总结于图 1。
2. 2　蓖麻蚕 rDNA的核骨架结合区 DNA (Sac II-
EcoRI片断 )具有酵母 ARS活性
从质粒 PARIII分离出蓖麻蚕 rDN A非转录间
148 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Fig. 1　 Organization of A . ricini. rDNA unit
and ARS loca liza tion
( A) physical map. B, Bam HI; S, SacII; E, EcoRI; P, Pst I;
G, B gl II; L, Sal I; A, AccI. ( B) ARSs. The ARS activi ty of
various rDN A subf ragm en ts ( sch emat ized as rectangles ) were
tested. Fragments show ed to harbo r an ARS ( or not ) are repre-
sen ted as fil led ( or empty) . ( C ) SAR. Th e f ragment can bind
th e yeas t nuclear scaf fold in vitro ( or not ) w as indicated wi th
　　　　　　　 f ill ed box ( or open box ) .
隔区 Sac II-EcoRI之间大约 1 kb片段 , 插入 pSKY
多克隆位点 Sac II-EcoRI之间 , 构建成质粒 pSEY。
分别取 pSKY及 p SEY转化酵母 EAL103, 每个样
品平均分成 3份 , 分别涂布于 YNB平板上 , 30°C
培养 5天。 3次平行实验的结果表明: pSKY转化
的酵母通常不能在选择培养基上生长 , 但有时有 0
～ 2个转化子而 pSEY转化的平板上通常有 20～ 50
个转化子。 pSEY对酵母 EAL103的转化率显著高
于 pSKY, 实验表明 , pSEY中所含有的 rDN A片
段具有酵母 ARS活性。从而验证了蓖麻蚕 rDN A
基因的 SAR元件具有酵母 ARS功能的结论 [1 ]。
2. 3　 SAR元件中的 262 bp片段 (AccI-AccI )具有很
高的转化率
将 Sac II-EcoRI片段用 Acc I切割 , 低溶点胶分
离出 688 bp及 262 bp片段。经补平、削平后插入
pSKY之 Sam I位点 ,分别构建成 pSAY和 pAAY,
结果显示 pSAY没有转化活性 , 而 pAAY的转化
率比 pSEY要高出 40～ 50倍 (表 1)。 pAAY质粒
所携带的 Acc I-Acc I 262 bp片断是 pSEY所携带的
SAR片断的一部分 , 具有较全片断高得多的转化
活性。为了对 rDN A全基因进行 ARS活性检测 ,
将 rDNA全基因分别用 EcoRI、Bam HI等切割 , 片
段经低熔点胶回收后插入 p SKY的 EcoRV位点 ,
构建成质粒 p EEY、 pPBY、 pBSY、 pEPY, 经检测均
无 ARS活性 (图 1, 表 1)。
Table 1 T ransfo rma tion o f yeast EAL103 cell by silkw o rm
A . ricini rDNA subfragment cloned into pSKY
Plasmid
DN A fragmenta
cloned in p SKY
Transformation
eff iciencyb
Mitot ic
s tabili t yc
Plasmid
los sd
pSKY — 0- 2 — —
pSEY Sac II-Eco RI 20- 50 5. 6% 15. 8%
pSAY Sac II - Acc I 0 — —
pAAY AccI - AccI 1 200- 2 000 7. 4% 13. 6%
pEEY EcoRI - EcoRI 0- 3 — —
pEPY Eco RI -Pst I 0 — —
pPBY Pst I -Bam HI 0 — —
pBSY B am HI -Sa cII 0 — —
　　 a Fragm ents are nam ed as in Fig. 1; b In colonies per microgram
of DNA; cPercen tage of plasmid-con taining cells af ter 24 h grow th
u nder selectiv e condit ions; d Th e rate of plasmid loss per generation.
2. 4　 pSEY( SAR)质粒在酵母中自主复制
为进一步确证 pSEY中的 rDN A片段能够驱
动质粒在酵母中自主复制 , 我们分别取 pSKY和
pSEY所转化的酵母菌落中 , 随机挑取 3个菌落
( p SKY转化的平板上的菌落全部挑取 ) , 分别接种
于 50 m l SD液体培养基于 30°C振摇培养 30 h。收
集菌体 , Ly ticase破壁后按从 E. col i中提取质粒的
方法 (碱法 ) 提取质粒 [7 ] , 将提取物分别转化大肠
杆菌 TG1, 在含氨苄青霉素、四环素的 LB平板上
培养过夜。结果表明来源于 pSKY的酵母提取物都
不能转化 TG1, 而来源于 pSEY的酵母提取物却能
转化 TG1。再从这些转化子中提取质粒进行酶切分
析 (图 2) , 结果显示来源于酵母中的质粒 ( Lane 5)
与体外构建的 pSEY ( Lane 4)是同一的。这表明:
在随机取样的单克隆中 , pSEY确实存在于酵母细
胞之中 , 且没有整合到酵母染色体上 , 它独立地在
酵母中复制。但质粒在酵母中的丢失率很高。在细
胞分裂过程中 , 质粒因随机分配而造成丢失。若质
粒整合到染色体中 , 就不会发生丢失。我们将含有
pSEY及 pAAY的酵母于完全培养基 Y PD中经约
8代培养 ( 16 h) , 经计算 [8 ] p SEY每代的丢失率为
15. 8% , pAAY每代的丢失率为 13. 6%。这说明它
们在酵母中都是不稳定的 (表 1)。这里的丢失率只
用于检查质粒在酵母中的存在方式 , 不表示 ARS
活性的相对强弱。
149第 2期 何明亮等: 蓖麻蚕 rDNA基因核骨架结合区在酵母中的自主复制功能
Fig. 2　 Identifica tion o f the state of pSEY
in yeast cells
DN A fragm en ts w ere s eparated in 10 g /L agarose g el by elec-
t roph oresi s. Lane 1, p SK was dig es ted wi th EcoRI; Lane 2, p SKY
was dig es ted w i th EcoRI; Lane 3, p SEY w as digested w ith Eco RI;
Lane 4, p SEY w as digested wi th both Sac II and EcoRI; Lane 5, ex-
t racts f rom yeas t clon es w ere used to t ransforming E. col i TG1
(amp- and t et- ) and s t reak ed on LB plate con taining amplicil lin and
tet racycline. Th e plasmids w ere ex t racted f rom the E. col i clones de-
scribed abov e and digested wi th both Sa cII and EcoRI.
2. 5　SacII-EcoRI片段与酵母核骨架相结合
从蓖麻蚕 rDN A的亚克隆中 , 分离出 1. 5 kb
的 Sac II-Sac II片段 , 再经 EcoRI酶解出 1 kb的
Sac II-EcoRI片段和 0. 5 kb的 EcoRI-SacII片段 ,
经 [α-32 P ] d AT P末端标记后 , 二者共同与经
Hae III酶切的酵母核骨架于 37°C保温 3 h离心 ,
同时在反应体系中加入 1 000倍于探针量的经
Hae III酶切的λDNA作为非特异性竞争 DNA。我
们发现 , 0. 5 kb的片段全部保留在上清的溶液中 ,
不与核骨架结合 (图 3, lane S) ; 1. 0 kb的 Sac II-
EcoRI片段可以专一性地同核骨架结合而出现在沉
淀部分 (图 3, lane P)。说明 SAR元件与核骨架蛋
白的结合可以在种间进行 , 并且与 ARS的活性有
关系。
讨 论
3. 1　核骨架结合与酵母自主复制之间存在内在联
系
　　我们发现 , 蓖麻蚕 rDN A的 SAR ( Sac II-
EcoRI)片段内 , 包含有与酵母自主复制 ARS相关
的保守序列 ( ACS) ,并发现它具有酵母 ARS的功
Fig . 3　 The DNA fragment which has function as yeast
ARS can bind specifically to yeast nuclear scaffo lds in v itro
The binding assay. Nuclear scaf fold s w ere prepared and dig es ted
w ith Hae III, and then the end-labeled DN A ( SE and ES f ragments )
and nonsp ecif icλDN A ( diges ted wi th HaeIII) w ere added and incu-
bated at 37°C for 3 h. Equal p roportions of Scaf fold-bound ( lane
P) and released ( lane S) DN A fractions w ere loaded on agarose gel.
Th e dried g el w as autoradiog raph ed.
能 [1 ]。为此 , 我们对 SAR元件的 ARS功能作进一
步检测 , 以探讨 SAR元件与 ARS的相互联系。我
们测定了质粒的转化率 , 检查了质粒在酵母中的独
立存在方式 , 以及质粒在细胞分裂中的丢失率 , 进
一步确证了 rDN A的 SAR元件在酵母中具有自主
复制功能。对 rDN A全基因作分段扫描检测 , 结果
表明仅 SAR区段的 DNA具有自主复制功能 , 而其
他非 SAR片断都不具有酵母 ARS活性 (图 1, 表
1)。体外结合实验又证明该 SAR能与酵母核骨架
专一性结合 (图 3)。我们推测酵母 ARS功能的实
现需要与酵母细胞核骨架相结合。 Amati和 Gasser
在 1988年就发现酵母染色体 ARS元件结合在核骨
架上 [6 ] , 而异源 DN A在酵母细胞中具有 ARS功能
的也能与酵母的核骨架结合 [ 5]。说明在酵母细胞
中 , DN A复制起始是在核骨架上进行的。 SAR和
ARS都是富含 AT的 DNA元件 , 它们共享共同的
核心序列。 ACS在 SAR元件中的频率大大高于非
SAR片段。对酵母 3号染色体研究表明 , ARS为
染色体复制所必需 [10 ]。在长 330 kb的染色体 DNA
上 , 共有 8个 ARS作为染色体 DNA复制起点 [11 ] ,
每个复制子平均跨越长度为 40 kb, 这与染色体上
DNA环的长度相当 , 即与 SAR的数目相一致。另
外 , DN A聚合酶α/引发酶 , DN A拓扑异构酶 II,
150 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
复制起始复合体 ( O RC)以及复制起始和新生链都
结合在核骨架上 [12 ]。因此 , 具有 SAR和 ARS共同
结构和功能特征的 DNA元件 , 似乎不可能为进化
上的纯粹巧合。 SAR可能为 DNA复制的起始提供
了专一性的结合位点 , 并可能通过调节染色体构象
的方式来调控 DNA复制。
3. 2　 ARS元件具有易解螺旋的特征 , 但易解链的
DNA并非都具 ARS功能 , SAR元件中存在对 ARS
活性的正调节和负调节的结构
　　我们用计算机程序 Thermodyn对 Sac II-EcoRI
片段的 DNA组成进行了螺旋稳定性分析 ,结果表
Fig . 4　 Yeast ARS consensus sequence ( ACS) and helical stability assay
of SAR ( Sac II -EcoRI) fragment o f A . ricini rDNA
A, th e near match es to th e Yeast ARS con sensus s equence ( ACS) are u nd erlined and indicated by ACS1 to AC S 15;
B, s liding window analysis of th e DN A helical s tabili ty of th e Sac II-Eco RI f ragment in th e N TS of A. Ricini rDNA wh ich has fu nction as yeast
au tonomou sly replicating sequ ence. Th e program Thermodyn[8 ] w as used to determine the energy required to unwind a 100 bp region of DN A
( window ) ( 1 kcal= 4. 184 k J) . Th e window w as mov ed along th e sequence in increments of 1 bp (s tep= 1) . The posi tion s and the 5′- to 3′-
di rection for T-rich s trand of 9 to 11 bp match es to th e yeas t ARS con sensus sequences are indicated b y arrow s. S1, n ucleas e S1 sensi tive si te.
151第 2期 何明亮等: 蓖麻蚕 rDNA基因核骨架结合区在酵母中的自主复制功能
明: 异源的 ARS元件同酵母 ARS元件一样具有易
解螺旋 ( DU E) 的特征 (图 4) , 其 ΔG≈ 70～ 95
kcal /mol , 这与酵母中的 ARS相似。蓖麻蚕 rDN A
的 SAR元件中包含 15个九配以上的 ACS同源序
列 (图 4A)。在 5′端的 688 bp内 , 含有 12个 ACS
同源序列 , 其中 ACS4, ACS5, ACS7, ACS8,
ACS9, ACS10富 T链的 3′端 100 bp内 A+ T含量
均≥ 70% , 具有易解链的特征 (图 4B)。特别是
ACS4, ACS5富 T链的 3′端有 A /T交替出现的特
征结构 ( AT) 18 , 它不论在染色体还是质粒上均表
现出对核酸酶 S1的超敏感性 [13 ]。但 5′端的 688 bp
片段未检测到酵母 ARS功能。在 Acc I之间的 262
bp片段内 , 含有 3个 ACS, 它也含有 DUE, 但却
具有比全片段高得多的转化活性 ; 用该片段构建成
的 pAAY的转化率比 1 kb的全片段的转化率高 40
～ 50倍。可见 , 该片段内存在 ARS活性的正调节
结构。具有 ARS所有特征的 5′端 688 bp片段 , 对
其 3′端的 262 bp片段的 ARS功能的体现 , 反而具
有抑制作用 ; 推测在该片段内还存在有负调节元
件。尽管我们的实验结果是很初步的 , 但可以看出
ARS的功能体现并不与 DU E的易解链程度正相
关 , 它可能还涉及到一些反式作用的蛋白质因子 ,
能否识别并正确地在这个区域装配成为起始复合
体。因此 , SAR元件中还包含有未知的顺式的结构
元件 , 对 DNA的复制起调控的作用。
3. 3　异源 ARS元件可能是生物在进化过程中保留
下来的特征元件
虽然在多细胞生物基因组中发现了具有酵母
ARS活性的 DNA元件 , 然而其频率是非常小
的 [5 ]。我们用分段检测的办法 , 对蓖麻蚕 rDN A的
N TS以外的区域也进行了检测 (它覆盖了 rDN A
全基因 ) , 未发现具有功能的 ARS元件。目前对一
个确定的异源基因小片段在酵母的自主复制分析 ,
还为数不多。在多细胞生物中 , 在已确定的复制起
点 ( replica tion o rigin)结构中 , 往往包含一个酵母
ARS结构 , 如 DHFR基因的 Ori-β [14 ]。那么多细胞
真核生物具有酵母 ARS活性的 DNA元件 , 在其自
身染色质 DNA复制中 , 具有何种明确的功能?目前
还不清楚。我们发现的蓖麻蚕核糖体 RNA基因的
SAR元件中 , 具有酵母 ARS活性的片段只有 262
bp, 它将为进一步研究 ARS元件的结构 , ARS与
染色质 DNA复制起始的关系 , 以及与核骨架的相
互作用提供良好的实验系统。
参 考 文 献
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152 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
The Autonomous Replication Function (ARS) of the Scaffold-associated
Region ( SAR) of Silkworm Attacus ricini rDNA in Yeast
HE Ming-Liang , ZHAO Mu-Jun and LI Zai-Ping
( Shanghai Insti tute of B ioch emistr y, the Ch inese Acad emy of Sciences , Shanghai 200031, China;
( Shanghai Joint Laboratory of Life Scien ce , the Ch inese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China )
ABSTRACT　　 The one kilo-base scaffold-asso ciated region ( SAR) of silkw orm Attacus ricini rRN A gene
( rDN A) has been identi fied previously
[1 ]
. To investigate the critical sequence and the relativ e activi ty of
ARS ( autonomously replicating sequence) , a set o f rest riction f rom covered the w hole rRN A gene uni t
w ere subcloned into the nonreplicativ e pSKY vecto r. Among the seven pla smids const ructed, the plasmid
pSEY, hav ing SAR, gave obvious posi tive replication activity in yeast as determined by the t ransfo rmation
ef ficiency. Further dissection o f SAR demonst ra ted that plasmid pAAY, having a 0. 26 kb sma ll f ragment
o f S AR was 40- 50 fold mo re activ e th en the who le SAR, w hile pSAY, having the remaining par t of
SAR, show ed no activi ty. There w ere fif teen ARS consensus sequence ( ACS) w ithin SAR being identified
through sequence alignment. It wa s found that only three ACSs in pAAY, loca ted at the 3′end of SAR dis-
played a posi tiv e ARS activ ity and the remaining sequence having the o ther twelve ACSs functioned as a re-
presso r. The in vitro binding assay show ed that SAR from the si lkw o rm rRN A gene bound to the yeast nu-
clea r scaffold. These results suggest tha t SAR is evolutionarily conserv ed, and there is a close cor relation
betw een SAR and ARS activi ty. Detai led analysis of the posi tiv e and nega tiv e regulatory elements in SAR
can be carried out based on these resul ts.
KEY WORDS　　 Silkw orm Attacus ricini; rDN A; SAR; ARS
153第 2期 何明亮等: 蓖麻蚕 rDNA基因核骨架结合区在酵母中的自主复制功能