全 文 ：第 28卷　第 6期 西北农业大学学报 Vol. 28 No. 6
2000年 12月 Acta Univ. Ag ric. Bo reali-occidenta lis Dec. 2000
[文章编号 ]1000-2782( 2000) 06-0025-05
砂地柏叶中鬼臼毒素的分离与鉴定
王继栋 1 ,田　暄 2 ,张　兴 1
( 1西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心 ,陕西杨陵 西农校区 712100;
2兰州大学应用有机化学国家重点实验室 ,甘肃兰州 730000)
　　 [摘　要 ]　在生物活性跟踪测试指导下 ,从砂地柏叶的乙醇提取物中通过硅胶柱层析 ,
分离得到一种对菜青虫有高拒食活性的成分 ,经紫外光谱 ( UV )、红外光谱 ( IR)、质谱 ( M S)、
氢核磁共振谱 ( 1H-NM R)分析 ,鉴定其为鬼臼毒素。其对菜青虫在高质量浓度下呈拒食作用 ,
低质量浓度下则具胃毒毒杀作用。
[关键词 ]　砂地柏 ;鬼臼毒素 ;植物性杀虫剂
[中图分类号 ]　 S482. 39　　　 [文献标识码 ]　 A
砂地柏 ( Sabina vulgaris Ant. )为分布于西北各省区的一种沙地植物。西北农业大学
无公害农药研究服务中心筛选、发现了其杀虫活性 ,并首次以活性跟踪法从其果实石油醚
提取物中分离得到一种杀虫活性物质—— 脱氧鬼臼毒素。在研究中对不同地区砂地柏及
其不同部位中的脱氧鬼臼毒素含量与生物活性作了较为系统的测试 [1, 2 ] ,发现其中可能还
含有其他杀虫活性成分 ,尤其是陕西榆林砂地柏叶子样品表现出很高的拒食活性 ,值得进
一步探讨。砂地柏叶子的生物量较为丰富 ,比其他部位易采收处理。本研究在前述工作的
基础上 ,继续在生物活性跟踪的指导下 ,从砂地柏叶中分离出其他有杀虫活性的成分。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　砂地柏叶采自陕西榆林 ,晾干 ,粉碎过 0. 37 mm筛 ,保存于 - 35℃低温冰箱内备用。
二氯甲烷、丙酮等溶剂均为分析纯试剂 ,硅胶为柱层析用硅胶 ( 49～ 74μm)。鬼臼毒素和
脱氧鬼臼毒素标样均由兰州大学应用有机化学国家重点实验室提供。
试虫为菜青虫 ( Pieris rapae L. ) ,由大田采回 4龄幼虫 ,于室内用新鲜甘蓝叶片饲养
至 5龄前期 ,挑取健康整齐的幼虫供试。
1. 2　测试仪器
X4 型显微熔点测定仪 ,紫外 ( UV )光谱仪 (日本岛津 ) , 170SX富里叶变换光谱仪
( FT-IR) (美国 ) , AM-400核磁共振仪 ( AM-400 NMR) (德国 BRVKER公司 ) , HP-5988
GC /M S气质仪 (日本惠普公司 ) ,圆二色谱 ( Ci rcular dich roism,简称 CD)仪 , JASCO 20C
自动记录旋光光谱仪 (日本分光公司 )。
[收稿日期 ]　 1999-10-14
　 [基金项目 ]　国家自然科学基金资助项目 ( 39979506)
　 [作者简介 ]　王继栋 ( 1972- ) ,男 ,现为华南植物研究所博士研究生。
1. 3　提取分离方法
取陕西榆林砂地柏叶粉碎物 1 500 g ,经石油醚 ( 60～ 90℃ )提取 3次脱脂后 ,再用工
业乙醇提取 3次 ,每次 12 h,过滤、浓缩得浸膏 215 g。以二氯甲烷∶丙酮为淋洗剂 ,结合生
物测定进行硅胶柱层析分离。
1. 4　生测方法
以菜青虫为试虫 ,采用小叶碟添加法 [3, 4 ]进行生物活性测定。
1. 5　化合物结构鉴定
从砂地柏叶中分得的结晶物经熔点、紫外光谱 ( UV )、红外光谱 ( IR)、质谱 ( M S)、核
磁共振 ( NM R)测试后 ,分别对照有关文献分析鉴定其结构。
2　结果与分析
2. 1　活性成分的分离结果
　　对提得的 215 g浸膏进行柱层析 ,以二氯甲烷∶丙酮 (体积比 )为 80∶ 1, 40∶ 1,
30∶ 1, 20∶ 1, 10∶ 1, 5∶ 1, 3∶ 1, 2∶ 1, 1∶ 1及丙酮 ,甲醇系列溶剂为淋洗剂 ,每馏分收集
100 mL,共得 148个馏分。经薄层层析 ( TLC)检测后 ,合并相应馏分 ,共得 15个组分。浓
缩各组分 ,其中 7～ 13组分有沉淀 ,滤出沉淀 ,把滤液浓缩至干 (沉淀部分以角码 1标志 ,
滤液部分以角码 2标志 ) ,以菜青虫为试虫进行活性测试 ,结果见表 1。
表 1　榆林砂地柏叶的提取物柱层析所得各组分对菜青虫生测结果
组　分 拒食率 /%
24 h 48 h
最终死亡率 /%
叶 1 29. 51 24. 39 18. 18
叶 2 56. 95 60. 55 18. 18
叶 3 93. 57 94. 75 72. 73
叶 4 89. 90 93. 36 56. 37
叶 5 94. 03 96. 09 63. 64
叶 6 89. 44 94. 87 45. 46
叶 71 45. 51 32. 87 20. 66
叶 72 89. 67 88. 28 67. 27
叶 81 43. 97 63. 17 63. 64
叶 82 80. 14 90. 35 51. 52
叶 91 18. 71 20. 03 0
叶 92 76. 92 80. 92 34. 55
叶 101 89. 44 94. 20 56. 37
叶 102 99. 31 99. 67 12. 73
叶 111 24. 57 24. 05 27. 27
叶 112 74. 05 81. 31 9. 10
叶 121 2. 00 27. 12 0
叶 122 28. 82 36. 50 0
叶 131 19. 06 29. 00 12. 73
叶 132 13. 55 13. 55 0
叶 14 12. 86 12. 86 0
叶 15 2. 41 2. 41 12. 73
　　注:每处理 10头试虫 ,各样品均以丙酮稀释成 100倍液供试。
26 西北农业大学学报 第 28卷
由表 1可以看出 ,叶 3, 4, 5, 6, 72 , 82 , 92 , 101和 102各组分对菜青虫都有较好的拒食活
性 ,其中以组分叶 102对菜青虫的拒食率最高。以脱氧鬼臼纯品作为标样 ,经 TLC检测后
表明组分 102中的主要成分不为脱氧鬼臼毒素。 将叶 102用二氯甲烷∶丙酮 (体积比为
1∶ 1)溶解后 ,用活性碳两次脱色 ,再浓缩后进行第二次柱层析 ,淋洗液系统同前 ,共得 21
个馏分。经 T LC检测后合并为 P1 , P2 ,结晶Ⅰ (微量 ) , P3 , P4 , P5 ,结晶Ⅱ ( 1. 5 g ) , P6 , P7 , P8 ,
结晶Ⅲ (微量 ) , P9 , P10和 P11。以菜青虫为试虫对各组分进行生物活性测定 ,结果见表 2。
表 2　组分叶 102柱层析所得各组分对菜青虫生物测定结果
组　分 拒食率 /%
24 h 48 h
最终死亡率 /%
P1 89. 52 89. 91 33. 33
P2 91. 66 88. 57 30. 00
P3 91. 86 90. 47 0. 00
P4 86. 19 85. 14 20. 00
P5 98. 32 94. 16 0. 00
P6 99. 16 99. 08 20. 00
P7 96. 63 97. 69 20. 00
P8 95. 28 95. 05 0. 00
P9 94. 44 86. 18 10. 00
P10 63. 16 50. 69 20. 00
P11 64. 21 51. 61 20. 00
结晶Ⅰ 52. 00 52. 07 20. 00
结晶Ⅱ 100. 00 99. 82 10. 00
结晶Ⅲ 37. 89 36. 52 0. 00
　　注:每处理 10头菜青虫 ,样品以丙酮稀释成 200倍液供试。
由表 2可看出 ,结晶Ⅰ 和结晶Ⅲ的拒食率和死亡率均不高 ,属无活性成分。结晶Ⅱ在
200倍液下拒食率可达 100% ,将其稀释至 2 000倍 ,测定了对菜青虫的作用。24 h拒食率
降为 80% ,但 48 h后表现出中毒症状 ,最终死亡率高达 90%以上 ,说明其也有很强的胃
毒毒杀作用。
2. 2　结晶Ⅱ的鉴定
结晶Ⅱ的纯化:用无水乙醇重结晶。
物理性质　结晶Ⅱ为白色针状结晶 ,易溶于氯仿 ,熔点 182～ 184℃。
波谱分析数据　结晶Ⅱ用乙醇溶解 ,其紫外光谱主要有 3个吸收峰: 224. 4 nm ( A=
1. 628) , 274. 4 nm ( A= 0. 513)和 292. 2 nm ( A= 0. 612)。
红外光谱 ( IR): 3 345～ 3 478 cm- 1 ,υO-H吸收 ; 3 045～ 3 112 cm- 1 ,苯环上υC-H吸收 ;
2 956, 2 889 cm
- 1
,苯环上υC-H吸收 ; 2 768 cm- 1 ,υ-OCH3吸收 ; 1 757 cm- 1 ,五无内酯环υC= 0吸
收 ; 1 625, 1 588, 1 506, 1 489 cm- 1 ,苯环上υ-C= C-吸收 ; 1 236, 1 128 cm- 1 ,五元内酯环 υC-O
吸收。
质谱 ( M S)显示 M+ 414( Base peak, 89% ): 399( M+ -CH3 , 5% ) ; 397( M+ -OH, 2% ) ;
396( M
+ -H2O, 2% ); 312( M
+ -H2O-C4 H4O2 , 3% ) ; 297 ( 312-CH3 , 4% ) ; 181 (苄基裂解 ,
22% ); 168(苄基裂解 , 39% ); 44( CO+2 , 100% )。
由相对分子质量为 414及砂地柏中含大量鬼臼类物质推测该物质可能为鬼臼毒素。
27第 6期 王继栋等: 砂地柏叶中鬼臼毒素的分离与鉴定
氢核磁共振谱 ( 1 H-NMR): δ2. 50( s, 1H,-OH) ,δ2. 80( m , 2H, H2, 3 ) ,δ3. 75( s, 6H,
H3′, 5′) ,δ3. 81( s, 3H, H4′) , 4. 05( t, 1H, H11β , J= 9. 5 Hz) ,δ4. 55( m , 2H, H1 , H11α) ,δ4. 75( d,
1H, H4 , J= 8. 8 Hz) ,δ5. 95( d, 2H, -OCH2O-, J= 1. 2 Hz) ,δ6. 35( s, 2H, H2′, 6′) ,δ6. 50( s,
1H, H8 ) ,δ7. 12( s, 1H, H5 )。
由上述四谱数据 ,经查阅文献 ,证明该结晶Ⅱ为鬼臼毒素 [5～ 11 ]。
圆二色谱 ( CD)图:由参考文献 [12]知 , 284 nm处第 1偶合谱带中 ,长波长吸收的最
大值ΔX1的绝对值减短波长吸收的最大值 ΔX2的绝对值小于零时 , C-2位的取代基处于α构
型 , C-4位苯环处于准 a键。
|ΔX
1
|= 0. 50 ( 286. 5 nm) ,
|ΔX
2
|= 3. 60 ( 273 nm ) ,
|ΔX1|-|ΔX2|< 0。
所以 C-2位的取代基处于α构型 ,进一步证实该物质为鬼臼毒素。
不同展开剂中的展开情况　以鬼臼毒素、脱氧鬼臼毒素和结晶Ⅱ作对照授以不同的
展开系统 ,以薄层层析 ( T LC)展开 ,其结果如表 3。
表 3　结晶Ⅱ 、鬼臼毒素与脱氧鬼臼毒素在不同展开剂中的 Rf值
展开剂
(二氯甲烷∶丙酮 )
Rf值
鬼臼毒素 结晶Ⅱ 脱氧鬼臼毒素
5∶ 1 0. 482 0. 482 0. 859
10∶ 1 0. 242 0. 242 0. 515
　　连续多次展开 ,结晶Ⅱ和鬼臼毒素的 Rf值始终相同 ,结果证明结晶Ⅱ即为鬼臼毒素。
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28 西北农业大学学报 第 28卷
The isolation and identification of podophyllo toxin
from Sabina vulgaris Ant.
WANG Ji-dong
1 , TIAN Xuan
2 , ZHANG Xing
1
( 1 Research and Development Cen ter of B iorational Pest icides ,Nor thwest S cience and Technology
University of Ag ricul ture and Forestry ,Yang lin g , Shaanx i 712100,Ch ina;
2 Na tional Laboratory of App lied Organic Chemist ry ,Lanzhou Universi ty ,Lanzhou 730000, China )
Abstract: Acco rding to the guidance of bioactiv ity assa ying and using silica column
chroma tog raphy, a compound having high anti feeding activi ty to the tested insect Pieris
rapae L. is iso lated from the ethanol ex t ract of the leaves of Sabina vulgaris Ant. . Its
molecular st ructure is identified to be podophy llotoxin, a know n compound, by UV , IR,
M S and
1
H-NMR. It i s also found tha t the podophy llotoxin has anti feeding activ ity in
higher concentra tions and has stomach poisionous activ ity in low er concentrations to the
5 instar la rv a of Pieris rapae L. .
Key words: Sabina vulgaris Ant. ; podophy llotoxin; bo tanical insecticide
29第 6期 王继栋等: 砂地柏叶中鬼臼毒素的分离与鉴定