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·药理·
刺糖多糖免疫活性的初步研究
赵 津,常军民,郑 杰,程煜凤,李改茹*(新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830054)
摘要:目的 研究刺糖多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。方法 采用水提醇沉法得刺糖多糖。建立免疫抑制小鼠动物模
型,小鼠灌胃刺糖多糖,利用碳粒廓清实验测定非特异性免疫功能;血清溶血素实验反映抗体生成水平;测定血清中细胞因子的
生成水平来评价刺糖多糖的免疫活性。结果 刺糖多糖可以增强免疫抑制小鼠的碳粒廓清能力和血清溶血素水平,能够提升由
环磷酰胺造成的免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-10的含量。结论 刺糖多糖对免疫抑制小鼠免疫功能有促进作用。
关键词:刺糖多糖;水提醇沉;免疫活性
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.014
中图分类号:R965 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2016)02-0158-04
Preliminary study on the immune activity of polysaccharides fromSaccharum alhagi
ZHAO Jin,CHANG Junmin,ZHENG Jie,CHENG Yufeng,LI Gairu*(Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China)
Abstract:Objective To assess the immunomodulation effects of polysaccharides from Saccharum alhagi in immunosuppression
mice.Methods The polysaccharides were extracted with water,and precipitated with ethanol fromSaccharum alhagi.Immuno-
suppression mice model was induced by cyclophosphamide,and intragastricaly administered with polysaccharides fromSaccharum
alhagi.Nonspecific immune function was evaluated by the carbon granular clearance test,antibody level by hemolysin test and
cel factor determination,including IL-2,IL-6,and IL-10.Results Polysaccharides fromSaccharum alhagi could enhance carbon
granular clearance and hemolysin levels in immunosuppression mice,and also increase the content of IL-2and IL-10.Conclusion
The polysaccharides fromSaccharum alhagi showed strong immune activities to immunosuppression mice.
Key words:polysaccharides fromSaccharum alhagi;water extraction and alcohol precipitation;immune activities
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:81460633)
作者简介:赵津,女,硕士研究生
*通信作者:李改茹,女,副教授
刺糖(Saccharum alhagi)是豆科植物蝶形花亚
科骆驼刺属,由骆驼刺叶子中的分泌液凝结成的糖
粒,黄白色,一般呈圆形或椭圆形,气微,味甜,它的主
要成分是糖类物质。一般生长于荒漠、半荒漠区,在
我国主要分布在新疆、甘肃、宁夏及内蒙古地区。具
有滋补强壮、益精壮阳、祛痰止咳、消肿止痛等功效,
维吾尔医常用之与其他药材配伍使用,治疗痢疾、腹
泻、胃胀等疾病[1]。
多糖(polysaccharides)是天然大分子化合物,糖
类在人体内的主要作用是提供能量资源,维持生命活
动的正常运转。研究发现,植物多糖具有免疫调节作
用,可作为广谱免疫促进剂,激活巨噬细胞、淋巴细胞
等多种免疫细胞,增强其分泌细胞因子的能力,从而
提高细胞的活性,进一步加强免疫作用;还具有抗肿
瘤、抗病毒、抗感染、降血脂、促进蛋白质生物合成的
作用,同时多糖作为药物具有天然无毒性的功效,因此
广泛受研究专家的重视[2-4]。本文研究了刺糖多糖对
免疫低下型小鼠的影响,希望为刺糖的进一步研究和
开发奠定基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 AB135-S型分析天平(北京赛多利斯天
平有限公司);Multifuge X3R型离心机(赛默飞世尔
科技有限公司);Szz PC型紫外分光光度计(上海棱
光技术有限公司);Model 680型酶标仪(伯乐生命医
学产品有限公司)。
1.2 试药 刺糖(购于新疆民族医院);注射用环磷
酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号14022525);
盐酸左旋咪唑片(山东仁和堂药业有限公司,批号
130105);墨汁稀释液:临用前,将墨汁用生理盐水稀
释4倍,即得;鸡红细胞悬液(CRBC):鸡血约10mL,
用肝素抗凝,再加入等体积9g·L-1的氯化钠注射
液,混匀并多次洗涤,以3 000r·min-1离心15min,
弃上清液,继续洗涤2~3次,取离心后的红细胞
4mL,加入9g·L-1氯化钠注射液16mL,现配现
用;豚鼠血清稀释液:豚鼠3只,取血,离心,冷藏保
存,临用前加生理盐水稀释10倍,即得。
1.3 动物 清洁级昆明种小鼠,体质量18±2g,雌
雄各半,由新疆医科大学实验动物中心提供,动物合
格证号:SYXK(新)2011-0001,室温环境下饲养,自
由饮食、进水。
2 实验方法
2.1 水提醇沉法提取分离刺糖多糖 将药材置于圆
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底烧瓶中,加入石油醚,60℃恒温水浴回流2h,脱
脂,将滤渣加入乙醇,80℃恒温水浴中回流2h,除
去小分子醇溶物,挥干溶剂,将滤渣加蒸馏水回流提
取,浓缩滤液,800g·L-1乙醇醇沉,干燥,得粗
多糖[1]。
2.2 动物分组及给药方法 取实验小鼠,随机分成
6组,模型组、空白对照组、阳性对照组及刺糖多糖高
(800 mg·kg-1)、中 (400 mg·kg-1)、低 剂 量
(200mg·kg-1)治疗组,每组8只。空白对照组给予生
理盐水,阳性对照组给予左旋咪唑(50mg·kg-1),治疗
组分别给予不同浓度刺糖多糖提取物,每天灌胃给药
1次,连续12d。给药当天起,模型组、阳性对照组和
治疗组同时腹腔注射CTX(50mg·kg-1),而空白对
照组用相同方法注射生理盐水,连续3d。
2.3 对碳粒廓清功能的影响 小鼠在第12天给药
后禁食不禁水12h,分别称定小鼠质量,并在每只鼠
的尾静脉注射0.2mL墨汁稀释液。分别在注射后2
和10min,用提前经肝素处理的定量毛细管从小鼠
眼眶取血40μL,溶于4mL 1g·L
-1的碳酸钠溶液,
将溶液与所取血液混匀。在680nm 处用紫外分光
光度计测定吸光度Al和A2,以碳酸钠溶液为空白对
照。脱臼处死小鼠,摘取胸腺、脾脏,称定小鼠质量,
根据公式计算脏器指数,并用吞噬指数表示小鼠碳粒
廓清能力[5-7]。
脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体质量(g);碳
粒廓清率K =(lgA1-lgA2)/(T2-T1);吞噬指数
=K1/3×体质量/(肝质量+脾质量)。
2.4 对血清溶血素含量的影响 在给药第5天时,
各组小鼠每只均腹腔注射鸡红细胞悬液0.2mL。第
12天给药后禁食不禁水12h,摘眼球取血,并离心收
集血清,加生理盐水稀释100倍,取经生理盐水稀释
的血清l mL,与鸡红细胞悬液、豚鼠血清稀释液各
0.5mL混合,在37℃恒温箱中孵育30min后,放入
0℃冰箱终止反应。然后离心,吸取上清液,在540nm
处比色,将不加小鼠血清的空白对照管调零,测定吸
光度,以吸光度读数作为判定血清溶血素的指标,比
较各组的差异[8-10]。
2.5 指标检测 小鼠在末次给药后禁食不禁水12h,
分别称定小鼠体质量,脱臼处死小鼠,摘眼球取血,按组别
装入EP管,静置后,4℃ 以3 000r·min-1离心15min,取
血清,分装,-20℃保存,测定细胞因子[11-12]。采用
ELISA法,按照试剂盒说明书进行操作,分别将小鼠
血清以及不同浓度的对照品加入96孔微孔板的相应
待测孔中,每孔50μL,加样时尽量不触及孔壁,轻轻晃
动混匀,用封板膜封板后置于37℃中温育30min;弃
去液体,甩干,每孔加洗涤液300μL,静置30s后弃去,
如此重复5次,拍干;每孔加入酶标试剂50μL,空白
孔除外;37℃温育30min;弃去液体,甩干,每孔加洗
涤液300μL,静置30s后弃去,如此重复5次,拍干;
每孔先加入显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL,
37℃避光显示15min;每孔再加入终止液50μL;以
空白孔调零,450nm波长测量各孔的A值[13]。以标
准物的浓度为横坐标、A 值为纵坐标,分别得出IL-
2、IFN-γ、IL-10、IL-6的线性回归方程为Y=0.001 3
X-0.212 4(r=0.998 1),Y=0.002 2 X+0.032 4
(r=0.995 5),Y=0.004 X-0.100 3(r=0.997 4),
Y=0.036 9 X+0.130 5(r=0.995 0)。
2.6 统计学方法 测得指标后,以均数±标准差(x±s)
表示,采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,方差分
析处理组间差异,得出数据。
3 结果
3.1 对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 见表1。由
表1可见,经环磷酰胺构建的模型组,其碳粒廓清率
和吞噬指数均低于空白对照组(P<0.05,P<0.01),
说明环磷酰胺能显著降低小鼠的碳粒廓清能力和巨
噬细胞的吞噬功能;阳性药组的碳粒廓清能力和吞噬
指数均明显高于模型组(P<0.05,P<0.01),说明所
选用的阳性药左旋咪唑能明显增强小鼠的碳粒廓清
能力和吞噬功能,并能使其恢复到正常水平;高剂量
组刺糖多糖与模型组比较,碳粒廓清率和吞噬指数均
有统计学意义(P<0.01),说明刺糖多糖能够增强小
鼠碳粒廓清功能和吞噬功能,并与剂量呈正比。
表1 刺糖多糖对小鼠碳粒廓清能力和吞噬功能的影响
Tab.1Effects of polysaccharides from Saccharum alhagi on
carbon granular clearance function and phagocytic function in
mice (x±s,n=8)
组别
剂量/
mg·kg-1
碳粒廓清率K 吞噬指数
空白对照组 - 0.032 7±0.006 2 5.22±0.44
模型组 - 0.011 0±0.003 9** 4.77±0.53*
阳性药组 - 0.033 0±0.006 9△△ 5.29±0.32△
低剂量组 200 0.022 2±0.003 1**△△
4. 53 ±
0.21**
中剂量组 400 0.026 4±0.003 1*△△ 4.89±0.39
高剂量组 800 0.030 0±0.003 3△△ 5.11±0.37
注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比
较△P<0.05,△△P<0.01。
3.2 对小鼠免疫器官的影响 见表2。由表2可
见,模型组的胸腺指数和脾指数明显低于空白对照组
(P<0.01),说明环磷酰胺能够造成小鼠免疫器官的
萎缩;阳性药组的胸腺指数和脾指数均高于模型组
(P<0.01),基本恢复到正常水平,说明阳性药左旋
咪唑能对抗环磷酰胺引起的小鼠免疫器官萎缩;低剂
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量组刺糖多糖与模型组比较,无统计学差异,但是中、
高剂量组刺糖多糖与模型组比较差异均有统计学意
义(P<0.05,P<0.01),说明刺糖多糖能够对抗由环
磷酰胺引起的小鼠胸腺萎缩和脾萎缩。
表2 刺糖多糖对小鼠免疫器官的影响
Tab.2Effects of polysaccharides from Saccharum alhagi on
the immune organ in mice (x±s,n=8)
组别 剂量/mg·kg-1 胸腺指数 脾指数
空白对照组 — 3.55±0.35 5.63±0.20
模型组 — 2.03±0.32** 4.65±0.25**
阳性药组 — 3.17±0.19△△ 5.64±0.23△△
低剂量组 200 2.42±0.10 4.67±0.29
中剂量组 400 2.78±0.17△△ 4.99±0.22**△
高剂量组 800 3.04±0.51△△ 5.34±0.43*△△
注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比
较△P<0.05,△△P<0.01。
3.3 对小鼠溶血素水平的影响 见表3。由表3可见,
模型组与空白对照组比较,其溶血素水平显著降低(P<
0.01),说明环磷酰胺能够影响小鼠的血清溶血素水
平,对小鼠的体液免疫功能有抑制作用;阳性药组的
溶血素水平比模型组高(P<0.05),说明所选用的阳
性药左旋咪唑能够明显提升小鼠的血清溶血素水平,
将其恢复到正常水平;低、中剂量组的刺糖多糖与模
型组和空白对照组比较,无统计学差异,但是高剂量
组和模型组比较(P<0.01),有统计学差异,能够增
强小
鼠血清溶血素水平;随着剂量的增加,血清溶血素水平
也逐渐增高,具有一定的量效关系。
表3 刺糖多糖对小鼠溶血素水平的影响
Tab.3Effects of polysaccharides from Saccharum alhagi on
hemolysin level in mice (x±s,n=8)
组别 剂量/mg·kg-1 溶血素(A)
空白对照 - 0.275±0.074
模型组 - 0.175±0.031**
阳性药组 - 0.269±0.061*
低剂量组 200 0.179±0.037
中剂量组 400 0.206±0.046
高剂量组 800 0.245±0.022△△
注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比
较△P<0.05,△△P<0.01。
3.4 对小鼠血清中细胞因子含量的影响 见表4。
由表4可见,环磷酰胺构建的模型组,其IL-2、IFN-γ、
IL-10和IL-6均低于空白对照组,差异有统计学意义
(P<0.05,P<0.01);阳性药组与模型组比较,A 值
也明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<
0.01),说明所选用阳性药左旋咪唑能增加免疫抑制
小鼠血清中细胞因子的含量;刺糖多糖低、中剂量组
与模型组比较,差异较小,无统计学意义;而刺糖多糖
高剂量组与模型组比较,IL-2和IL-10明显升高,差
异有统计学意义(P<0.01),IFN-γ和IL-6则仅有较
小的提升。综上所述,刺糖多糖对环磷酰胺引起的免
疫抑制小鼠血清细胞因子的含量有提升作用。
表4 刺糖多糖对小鼠细胞因子的影响
Tab.4Effects of polysaccharides fromSaccharum alhagi on hemolysin level in mice (x±s,n=8)
组别 剂量/mg·kg-1 IL-2细胞因子(A) IFN-γ细胞因子(A) IL-10细胞因子(A) IL-6细胞因子(A)
空白对照组 — 0.259±0.037 0.603±0.109 0.345±0.075 0.777±0.969
模型组 — 0.146±0.031** 0.463±0.136** 0.289±0.035* 0.632±0.054**
阳性药组 — 0.244±0.081△△ 0.593±0.074△△ 0.341±0.050△ 0.756±0.132△△
低剂量组 200 0.138±0.021 0.402±0.074** 0.289±0.018* 0.637±0.069**
中剂量组 400 0.153±0.017 0.446±0.082** 0.308±0.024 0.659±0.051**
高剂量组 800 0.205±0.036*△△ 0.485±0.058*△ 0.307±0.032 0.677±0.086*
注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01。
4 讨论
本实验采用经典的免疫学研究方法,用环磷酰胺
造免疫抑制小鼠动物模型,灌胃给药,观察灌服不同
剂量多糖的免疫抑制小鼠的碳粒廓清功能和吞噬指
数。实验结果表明,刺糖多糖能对抗免疫器官萎缩,
增强免疫抑制小鼠的吞噬指数(P<0.05)。
溶血素是一种抗红细胞抗体,动物血清与鸡血红
细胞一起可以产生溶血现象,通过这个过程中释放的
血红蛋白量可以确定溶血素的含量,进而反映小鼠合
成抗体的能力,可以依此评价小鼠的体液免疫。研究
结果表明,刺糖多糖可以增强体液免疫,提升免疫抑
制小鼠的血清溶血素水平(P<0.05)。
多糖可以通过激活免疫细胞,诱生多种细胞因子
作用于免疫系统,IL-2是辅助性T细胞分泌的一种
调节免疫应答的重要介质,通过对IL-2的含量测定,
也从分子水平反映了机体免疫功能的状态[14-15];IFN-γ
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主要是由活化的Th1细胞产生的重要的细胞因子之
一,可以有效地促进细胞免疫功能,IL-10是免疫和
炎症抑制因子,IL-6主要是由巨噬细胞、T细胞等多
种细胞产生,可以调节免疫应答功能[16-17]。本实验
研究结果表明,刺糖多糖能够增强由环磷酰胺造成的
免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-10的含量,而对
IFN-γ和IL-6的含量没有显著的提升。
机体免疫力低下是由多种因素引起的,多糖作为
一种植物性中药,可以增强细胞免疫和体液免疫,作
为免疫调节剂。刺糖在新疆维吾尔医院中常作为一
味增强机体免疫力的维药。本研究表明,刺糖多糖对
非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫均有促进作用,
具有良好的开发前景。
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(收稿日期:2015-07-17)
蔓荆子黄素抑制p53突变型人肺癌细胞生长及其机制研究
许 刚1,张云锋2,孟 磊1,周章剑1,张 昊1,宋永春1*(1.西安交通大学第一附属医院肿瘤外科,西安710061;2.西安
交通大学第一附属医院胸外2科,西安710061)
摘要:目的 了解蔓荆子黄素对p53突变型人肺癌 H322细胞增殖的影响,并对其机制进行初步研究。方法 在不同时间点
(24,48和72h)采用 MTT法检测不同浓度(0,0.1,0.2,0.5,1.0μmol·L
-1)蔓荆子黄素对细胞增殖的影响。在不同浓度蔓荆
子黄素的作用下,采用 Western blot法检测c-myc基因表达情况。结果 蔓荆子黄素能抑制 H322细胞增殖,且呈剂量和时间依
赖性,24,48和72h的IC50分别为0.577,0.501和0.473μmol·L
-1。不同浓度的蔓荆子黄素在同一时间点、相同浓度的蔓荆子
黄素在不同时间点对 H322细胞增殖的抑制作用均存在明显差异(P<0.05)。c-myc基因表达与蔓荆子黄素的浓度呈反比。结
论 蔓荆子黄素能抑制人肺癌 H322细胞的增殖,其机制可能是通过抑制c-myc的表达。
关键词:蔓荆子黄素;肺癌;增殖;c-myc蛋白
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.015
中图分类号:R965 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2016)02-0161-04
Inhibitory effects of vitexicarpin on mutated p53lung cancer cel and its mechanism
XU Gang1,ZHANG Yunfeng2,MENG Lei 1,ZHOU ZhangJian1,ZHANG Hao1,SONG Yongchun1*(1.Department of Surgical
Oncology,the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China;2.The 2nd Department of Thoracic
Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China)
161西北药学杂志 2016年3月 第31卷 第2期