全 文 ：阴地蕨多糖提取工艺及抗肿瘤活性测定研究
曹剑锋 1，2 任朝辉 3 罗春丽 1 夏丽莎 1 李亚萍 1 王超英 1
（1贵州师范学院贵州省生物资源开发利用特色重点实验室，贵州贵阳 550018； 2贵州师范学院转化与分离研究所； 3贵州师范大学）
摘要 水提醇沉法提取阴地蕨多糖，以多糖得率为指标，考察提取温度、提取时间、料液比及提取次数对多糖得率的影响，通过正交试
验优化提取工艺参数；采用 MTT 法检测阴地蕨多糖对癌细胞 CT-26、K562、WEHI-3 细胞作用 48 h 后的增殖抑制作用。试验结果表明，提
取时间和温度是阴地蕨多糖提取率最主要的影响因素，优化的最佳提取条件为：温度 100℃，料液比为 1∶40（mg/mL），提取时间 4 h 和提取
次数 3 次。阴地蕨多糖对 3 种肿瘤均有生长抑制作用，且呈现一定的浓度依赖性，抑制作用强弱为 WEHI-3＞K562＞CT-26，半数抑制浓度
IC50分别为 0.85、2.13、2.52 mg/mL。
关键词 阴地蕨多糖；水提醇沉法；正交试验；MTT 法；抗肿瘤活性
中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）15-0261-02
Optimazation of Extraction of Botrychium ternatum（Thunb） Sw. Polysaccharides and Its Antitumor Activity Detection in vitro
CAO Jian-feng 1，2 REN Chao-hui 3 LUO Chun-li 1 XIA Li-sha 1 LI Ya-ping 1 WANG Chao-ying 1
（1 Guizhou Bioresource Development and Utilization Key Laboratory，Guizhou Education University，Guiyang Guizhou 550018； 2 Research Institute of
Transformation and Separation，Guizhou Education University； 3 Guizhou Normal University）
Abstract The Botrychium ternatum（Thunb） Sw. polysaccharides was extracted by water extraction-alcohol precipitation method. The extraction
process was optimized by investigating polysaccharide yield as the response value of extraction time ，extraction temperature，solid to solvent ratio and
extraction time. Based on the results of single-factor experiments，orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process
parameters. MTT assay was adopted to detect the inhabitation of polysaccharides with three different kinds of malignant tumor cell lines in vitro and IC50
values were calculated，respectively.The results showed that the best conditions for water extraction-alcohol precipitation were determined as follows ：
extraction temperature was 100 ℃；the time was 4 h；solid to liquid ratio was 1∶40（g/mL）；and the extractiontime was 3 times. The polysaccharides had
antitumor effects on WEHI-3＞K562＞CT-26，they inhibited cell proliferation in a dose dependent manner，and the IC50 of polysaccharides on the three
different kinds cell lines was 0.85，2.13，2.52 mg /mL，respectively.
Key words Botrychium ternatum（Thunb）Sw.polysaccharide；water extraction-alcohol precipitation；orthogonal array experiments；MTT assay；
antitumor activity
阴地蕨 [Botrychium ternatum（Thunb）Sw.]属于阴地蕨科
阴地蕨属植物，阴地蕨属植物全世界有 40余种，主要分布于
温带的高山地区和低地森林地区，我国现有 17 种，分布于全
国各地。该属植物具有清热解毒、利水通淋、消肿等广泛的药
理活性[1]，具有很高的药用价值，民间多用阴地蕨属植物治疗
肺热咳嗽、毒蛇咬伤、出血等疾病症状而受到了人们的关注[2]。
其中阴地蕨，别名一朵云、小春花、四块瓦等[3]，其味淡、苦，性
冷，有止咳、清肺热之功效[4]；王少明等[5]从阴地蕨中提取的木
犀草素、阴地蕨素等提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表
现为抑制自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移；陈晓清等 [6]
从阴地蕨分离得到的粗多糖提取物具有抑制鱼病病原菌包
括烂尾病病原菌、赤皮病病原菌和肠炎病病原菌的生物活
性，所以研究多糖的提取工艺及其抗癌活性具有重要意义 [6]。
本研究在单因素试验基础上采用正交试验法从阴地蕨根中
提取多糖，以确定出最佳提取条件。采用 MTT法检测阴地蕨
多糖作用 48 h 后对小鼠结肠癌细胞 CT-26，人白血病 K562
细胞和小鼠白血病细胞 WEHI-3的细胞毒活性，计算对 3种
癌细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度 IC50，为进一步对阴地
蕨多糖进行研究提供基础数据参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 试材。阴地蕨药材购自贵州贵阳药材市场 ，经贵州
师范学院朱福寿教授鉴定为阴地蕨科阴地蕨属植物阴地
蕨；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、磷酸氢钾等试剂
均为国产分析纯。
1.1.2 试验仪器。仪器包括恒温水浴锅 （上海梅香仪器有
限公司）、真空抽滤机（郑州长城科工贸有限公司）、电子天
平（上海精密科技仪器有限公司）、冻干机（河南兄弟仪器设
备有限公司）、分光光度计（上海精密科技仪器有限公司）、
离心机（江苏正基仪器有限公司）、干燥箱（天津市泰斯特仪
器有限公司）、酶标仪（美国 Bio Rad3550）、CO2培养箱（美国
Thermo 公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 水提醇沉提取工艺。参照杨 林等的方法 [7]：阴地蕨根
干粉→蒸馏水浸提→3 500 r/min 离心 10 min→上清→减压
浓缩至原体积 10%→4 倍体积乙醇醇沉→3 500 r/min 离心
10 min→沉淀物→洗涤→阴地蕨粗多糖→脱色脱蛋白→纯
化多糖。
1.2.2 多糖得率测定与计算 。多糖含量以苯酚-硫酸法测
定 [8]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于 490 nm 波长
处测得的吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，
计算多糖得率：
提取率（%）=比色液浓度（μg/mL）×稀释倍数×200
供试样品质量（g）×106
×100
1.2.3 单因素试验和正交试验设计。参照陈 亮等 [9]的方法
设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比和提取
次数对多糖提取率的影响。并对多糖提取率进行计算，每组
试验重复 3 次。
基金项目 贵州省高等学校大学生创新创业训练计划项目（黔教办高
〔2014〕321 号 ）；贵州省教育厅自然科学研究招标项目
（黔教合 KY字[2015]374）；乌当区资源开发与利用技术中心
项目。
收稿日期 2016-06-24
261
食品科学 现代农业科技 2016年第 15期
在单因素试验的基础上，以阴地蕨多糖提取率为响应
值，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）
为试验因素，在 4因素 3水平上对阴地蕨多糖提取工艺进行
优化研究（表 1）。
1.2.4 多糖纯化。将阴地蕨粗多糖以活性炭脱色、saveage 法
脱蛋白、冷冻干燥 [10-11]，即得到纯化后的热水浸提的多糖。此
纯化的多糖用于后续抗癌活性评价试验。
1.2.5 抗肿瘤细胞活性。参照任 靖等的方法 [12]选取对数生
长期肿瘤细胞，用相应的培养基制成细胞悬浮液，用细胞计
数仪计数，按各细胞的最佳铺板浓度接种 90 μL 于 96 孔细
胞培养板，5% CO2，37 ℃培养。24 h 后加入样品 10 μL，继续
培养 48 h，在细胞培养结束前的 4 h，每孔中加入 10 μL 的
MTT 溶液继续培养到试验结束。倒置显微镜下观察细胞形
态，将上清液轻轻倒掉后，每孔中加入二甲基亚砜 150 μL，
在酶标仪 570 nm处测量每孔的吸光值。按下式计算抑制率：
抑制率（IR，%）=（对照 D570值-待测样品 D570值）/（对照
D570值-空白孔 D570值）×100
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
对葡萄糖标准溶液与对应的吸光度，绘制葡萄糖标准
曲线，拟合线性方程为 Y=0.012X+0.006，R2=0.996，可根据方
程计算多糖得率。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对粗多糖提取率的影响。从图 1 可看出，起初
随着料液比的增加，多糖的提取率随之增加 ，料液比到达
1∶60 时多糖提取率达到最高，随后随着料液比的增加，多糖
提取率稍呈下降趋势。
2.2.2 温度对多糖提取率的影响。从图 2 可以看出，随着温
度的升高，阴地蕨多糖的提取率相应增加。当温度达到 90℃
时多糖的提取率达到最高，温度再升高到 100 ℃时提取率
则稍有降低。
2.2.3 时间对多糖提取率的影响。从图 3 可以看出，随着时
间延长，阴地蕨多糖的得率增加，4 h后多糖的提取率随时间
延长继续增加，但是增加量不明显。
2.2.4 提取次数对多糖提取率的影响。从图 4 可以看出，随
着提取次数的增多，多糖得率逐渐增加。但是从第 3 次开始，
随着提取次数增多，阴地蕨多糖的提取率虽有继续增加趋
势，但是增加量不明显。
2.3 正交试验优化阴地蕨多糖提取工艺
分析表 2正交试验结果可知，提取时间对试验结果具有
显著性影响，其次是提取次数和温度，用水量对试验结果影
响较小。影响总多糖得率的因素主次顺序为 B＞D＞A＞C。通
过分析 4 个因素的影响，最优提取工艺组合为 A3B3C1D2，即
浸提温度为 100 ℃，料液比 1∶40，浸提时间 4 h，浸提次数 3
次。在此条件下重复进行验证试验 3 次，多糖得率分别为
5.67%、5.64%、5.58%，多糖的平均提取率为 5.63%。说明此
提取条件稳定可靠，多糖得率高。
2.4 阴地蕨多糖的抗肿瘤活性
采用 MTT 法对阴地蕨多糖的抗肿瘤活性进行了初步
（下转第 269 页）
提取温度（A）
℃
提取时间（B）
h
料液比（C）
g/mL
提取次数（D）
次
1 80 2 1∶40 2
2 90 3 1∶50 3
3 100 4 1∶60 4
水平
表 1 正交试验因素水平
图 2 温度对多糖得率的影响
2.5
0.5
1.0
1.5
2.0
0
多
糖
得
率
∥
%
3.0
3.5
80 10070 90
温度∥℃
图 3 时间对多糖得率的影响
2.5
0.5
1.0
1.5
2.0
0
多
糖
得
率
∥
%
3.0
2 543 6
时间∥h
图 1 料液比对多糖得率的影响
2.5
0.5
1.0
1.5
2.0
0
1∶30 1∶701∶601∶501∶40 1∶80
料液比∥g/mL
多
糖
得
率
∥
%
图 4 提取次数对多糖得率的影响
2.5
0.5
1.0
1.5
2.0
0
多
糖
得
率
∥
% 3.0
3.5
4.0
4.5
2 43
次数∥次
1
262
筛选，结果见表 3。可以看出，阴地蕨多糖对 3 种肿瘤细胞都
有细胞毒活性，但是对小鼠结肠癌细胞 CT-26 和人白血病
K562 细胞的毒活性较弱 ，1 mg/mL 时抑制率分别只达到
27.06%和 27.31%，IC50值分别为 2.52、2.13 mg/mL；对小鼠白
血病细胞 WEHI-3 抑制率在多糖浓度为 1 mg/mL 时达到
55.36%，IC50值为 0.85 mg/mL。
3 结论与讨论
通过正交设计得出阴地蕨多糖的最佳工艺条件为提取
温度 100℃，提取时间 4 h，提取次数 3次，料液比 1∶40，在此
条件下多糖得率 5.63%，该优化结果对阴地蕨多糖开发利用
和生产有重要的参考价值。
通过 MTT 试验和形态学观察，以 3 种肿瘤细胞，即人
白血病 K562 细胞、小鼠白血病细胞 WEHI-3 和小鼠结肠癌
细胞 CT-26 为试验材料对阴地蕨多糖活性进行了初步筛
选，检测阴地蕨多糖的细胞毒性及其作用的细胞特异性。由
试验结果可知，该多糖对不同种类癌细胞的细胞毒性存在
差异。从 MTT 试验结果的半数抑制浓度 IC50可以看出：阴地
蕨多糖对 3 种癌细胞均有不同程度的细胞毒作用，细胞增
殖的抑制作用随多糖浓度的加大而增强，呈剂量依赖性，相
比之下，多糖对小鼠白血病细胞 WEHI-3 抑制作用最强，半
数抑制浓度 IC50 为 0.85 mg/mL，远大于对其他 2 种癌细胞
的作用。该研究结果为阴地蕨多糖的抗癌作用研究提供了
一定的参考。有关阴地蕨多糖的抗癌作用还需进一步深入
研究。
4 参考文献
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试验号
提取温度
（A）∥℃
提取时间
（B）∥h
料液比（C）
g/mL
提取次数
（D）∥次
多糖得率
%
1 80 2 1∶40 2 3.31
2 80 3 1∶50 3 3.81
3 80 4 1∶60 4 5.61
4 90 2 1∶50 4 3.85
5 90 3 1∶60 2 3.61
6 90 4 1∶40 3 6.28
7 100 2 1∶60 3 4.34
8 100 3 1∶40 4 4.53
9 100 4 1∶50 2 5.62
K1 12.73 11.50 14.12 12.54
K2 13.69 11.95 13.28 14.43
K3 14.49 17.51 13.56 13.64
R 1.76 6.01 0.84 1.89
表 2 正交试验设计与结果
CT-26 K562 WEHI-3
抑制率
%
IC50
mg/mL
抑制率
%
IC50
mg/mL
抑制率
%
IC50
mg/mL
0.025 7.07 2.52 6.69 2.13 6.15 0.85
0.050 12.00 9.76 8.83
0.100 14.02 14.19 12.35
0.200 16.68 17.01 14.91
0.400 18.24 19.98 37.54
0.800 21.69 23.60 44.47
1.000 27.02 27.31 55.36
剂量
mg/mL
表 3 阴地蕨多糖的抗肿瘤活性
（上接第 262 页）
∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥
泽、成熟度、新鲜度及病虫害和机械损伤程度等商品性状，
按照一定的标准进行分级。分级的方法有人工分级和机械
分级 2 种，人工分级是产地栗农普遍采用的方法，此法能够
减少机械伤害，但效率低，易受主观因素的影响；机械分级
可以消除人为因素的影响，显著提高工作效率，目前大型板
栗贮藏企业采用此法。
6 预冷处理（散热）
板栗成熟时期正值北方高温高湿的季节，对板栗贮藏
极为不利。为保持栗果的新鲜度、优良品质，延缓其衰老，必
须在采后贮前采取预冷处理，一些发达国家已经将预冷处
理作为果品贮前不可或缺的一项技术措施。方法是将采后
的板栗摊于阴凉通风的室内或凉棚下，使栗子散热冷却，此
过程亦称为“发汗”，一般 2 d 即可，条件允许可将板栗放入
冷库中进行快速降温 [5-6]。
7 入库贮藏
板栗入贮前，对冷库要彻底打扫并用臭氧进行消毒，制
冷设备在入贮前 24 h 开机运行，温度设定为（-1.5±0.5）℃，
湿度设定为 90%~95%；运行 24 h 后，根据冷库容量，板栗
分批入贮，栗果温度控制在（0±0.5）℃。贮藏期间随时监测
库内温湿度变化，及时通风换气，湿度降低时，采用自动加
湿或者人工喷洒的方式，保证湿度控制在 90%左右。贮藏
前期 ，库内温度控制在 （-1.5±0.5）℃ ；元旦前后 ，随着气
温的降低，将温度调整为（0±0.5）℃；次年 3 月中旬，调整为
（-2±0.5）℃。
8 参考文献
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