全 文 ：山苦茶 （Mallotus furetianus）又名鹧鸪茶 ， 毛
茶， 禾茶。 系大戟科野桐属植物， 主要分布于我国
海南岛、 中印半岛和苏门答腊岛。 山苦茶遍布于海
南各地， 主产万宁东山岭。 其为野生的乔木树叶晾
制而成， 未经传统炒茶工艺， 因而泡出来的茶水清
香中夹着一种植物特有的味道， 是一种奇特的野生
茶叶。 因其香味浓郁， 又有清热解毒， 利胆消食之
功能， 所以人们常泡山苦茶作为解油腻、 帮助消化
的保健饮料 [1-2]。 研究者们对山苦茶侧重于其提取
物的药理和临床方面的研究， 如对其抗菌， 抗毒性
作用[3]， 利胆作用 [4]和镇痛作用 [5]等研究。 而对山苦
茶多糖等生物活性成分及其活性作用的研究尚属空
白， 有待深入开展。
茶多糖（Tea polysaccharides， 简称 TPS）是茶叶
中一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋
白。 近年来相关文献报道， 茶多糖具有降血糖、 降
血压、 耐缺氧及增加冠状动脉血流量、 增强机体免
疫功能、 抗癌、 抗氧化等多方面的生物学功能 [6-7]。
为深入探讨山苦茶提取液中的活性成分， 本文探讨
从海南特产山苦茶中分离提取山苦茶多糖， 采用紫
外可见分光光度法测定多糖含量， 为山苦茶资源的
综合开发和质量评价提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂 山苦茶[Mallotus oblongifolius
（Miq.）Muell. Arg.]， 大戟科（Euphorbiaceae）野桐属
（Mallotus）购于海口农贸市场， 经鉴定为夏季七月
热带作物学报 2012， 33（3）： 567-571
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-12-02 修回日期： 2012-02-06
基金项目： 海南省自然科学基金项目（No. 310076）。
作者简介： 苏冰霞（1981 年—）， 女， 硕士， 助理研究员。 研究方向： 食品科学。
山苦茶多糖的分离和含量测定
苏冰霞， 谢 轶， 吴学进， 葛会林
中国热带农业科学院分析测试中心， 海南海口 571101
摘 要 用石油醚和 95％乙醇分别浸提山苦茶叶， 以去除其中脂溶性成分和单糖、 低聚糖、 苷类等杂质， 再用
水提醇沉法提取分离山苦茶多糖， 最后采用 Sevag 试剂法和蛋白酶酶解法去除茶多糖中的蛋白质。 以葡萄糖为
标准， 蒽酮-硫酸比色法测定山苦茶多糖含量。 考察了乙醇浓度对山苦茶多糖沉淀量的影响。 结果表明， 采用
Sevag 试剂法和蛋白酶酶解法相结合去除蛋白质效果较好。 采用 80％乙醇浓度沉淀山苦茶多糖效果最佳， 测定
波长为 604 nm， 山苦茶中多糖含量为 1.012％， 方法回收率 96.7％， RSD 为 2.45％， 多糖提取液 4 h 内显色稳
定。 该试验方法测定茶多糖准确快速， 显色稳定且精密度好。
关键词 山苦茶； 水提醇沉法； 含量测定
中图分类号 O629.12 文献标识码 A
Extraction and Content Determination of Tea
Polysaccharides in Mallotus furetianus Tea
SU Bingxia, XIE Yi, WU Xuejin, GE Huilin
Center of Analysis and Testing, Academy of Chinese Tropic Agricultural Science, Haikou, Hainan, 571101, China
Abstract Mallotus furetianus Tea was extracted using petroleum ether and 95% ethanol respectively to have fat
soluble components, monosaccharide, oligosaccharides, and glycosides removed. And then the tea polysaccharides
were extracted from Mallotus furetianus by water extraction and ethanol deposition method. The Sevag reagent and
protein enzyme were used to get rid of the protein in the tea polysaccharides. Glucose was used as the standard
and the amount of tea polysaccharides was determined by anthrone -H2SO4 colorimetric method. The effect of
ethanol concentration on tea polysaccharides deposition was also examined. The results showed that the better
method on dispositing protein was combining Sevag reagent with protein enzyme. 80% ethanol concentration
presented the best effect on polysaccharides deposition. The content of tea polysacchrides in Mallotus furetianus
Tea was 1.012% when the determined wavelength was 604 nm, and the recovery rate was 96.7%, and the relative
standard deviation RSD 2.45%, the liquid was steady in 4 hours. This tea polysaccharides determination method is
rapid, accurate and reproducible.
Key words Mallotus Furetianus Tea; Extracting by water and alcohol deposition; Determination
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.03.032
第 33 卷热 带 作 物 学 报
铜鼓岭采摘的新鲜绿叶（叶片经清蒸—晾晒—干燥
包装成山苦茶叶）。
蒽酮、 硫酸、 葡萄糖、 石油醚（沸程 60~90℃）、
无水乙醇、 95％乙醇、 复合蛋白酶（诺维信公司）、
三氯甲烷、 正丁醇、 透析袋（相对分子质量 10 000）。
所用试剂均为分析纯。 实验用水均为双蒸水。
1.1.2 仪器 植物粉碎机、 电热板等； AE200 型
电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生
产）； UV-3900 紫外可见分光光度计（日本岛津公
司生产）； 电热恒温水浴锅， 回流装置一套； 真空
旋转蒸发仪； 离心机（上海安亭科学仪器厂生产）；
振荡器； 电热真空干燥箱。
1.2 方法
1.2.1 山苦茶多糖含量的测定 多糖测定原理：
由于糖类物质与浓硫酸起反应， 脱水生成羟甲基呋
喃甲醛（羟甲基糖醛）， 再与蒽酮缩合成蓝色化合
物， 溶液颜色稳定， 且反应过程中浓硫酸与水剧烈
反应， 放出热量使溶液温度升高。 其色深浅与溶液
中糖浓度成正比， 所以可利用此反应间接测定溶液
中糖含量[8]。
（1）标准曲线的绘制 精密称取 105 ℃干燥至
恒重的葡萄糖标准品 0.500 0 g， 用蒸馏水溶解后定
容于 100 mL 容量瓶中制成葡萄糖标准溶液。 准确
称取 0.33 g 蒽酮， 缓慢加入 100 mL 浓硫酸， 边加
边搅拌， 直至溶解后呈黄色透明溶液（现配现用）
即为蒽酮试剂。
标准曲线的绘制 ： 分别吸取 0.5、 1.0、 2.0、
4.0、 5.0 mL 葡萄糖标准溶液于 100 mL 容量瓶中，
用蒸馏水定容至刻度， 可得 25、 50、 100、 200、
250 mg/L 的葡萄糖系列浓度溶液。 吸取各系列标
准葡萄糖液 1.0 mL 和蒸馏水 1.0 mL（空白对照），
各加入蒽酮试剂 5.0 mL， 混匀。 放置 20 min 后测
定吸光值。 在 400~900 nm 的波长范围扫描， 以确
定最大吸收波长。 以浓度 c 为横坐标， 吸收度 A
为纵坐标绘制标准曲线。
（2）测定波长的确定 将显色后的标准液（浓度
100 mg/L）和多糖提取液在 400~900 nm 波长范围扫
描， 由最大吸光度确定最大测定波长。
（3）换算因子的确定 称取山苦茶多糖 20 mg，
加水溶解定容于 50 mL 容量瓶中。 精密吸取定容后
溶液 1 mL于具塞试管中， 标准曲线绘制的方法测定
吸光度， 根据回归方程计算多糖溶液中葡萄糖的浓
度， 按下式计算出多糖溶液对葡萄糖的换算因子f。
f=W/C·D。 式中 W 为多糖质量（mg）， C 为多
糖浓度（mg/mL）， D为稀释因素[9]。
（4）样品溶液测定 精密称取精制山苦茶多糖
0.100 8 g， 用蒸馏水溶解后定容于 100 mL 容量瓶
中。 吸取精制多糖提取液 1.0 mL， 加入蒽酮试剂
5.0 mL， 混匀。 放置 20 min后测定吸光值。
1.2.2 山苦茶多糖提取和分离 （1）山苦茶多糖提
取及沉降条件试验。 茶多糖提取和沉降试验依据条
件： 茶多糖是水溶性复合多糖， 其外观呈灰白色、
浅黄色至灰褐色， 冷水中溶解度较小， 热水中溶解
度约 76％， 不溶于高浓度的乙醇、 丙酮、 乙酸乙
酯、 正丁醇等有机溶剂[10-11]。
称取 2份干燥的山苦茶 50.00g， 分别于 1000 mL
圆底烧瓶中， 加入石油醚（沸程60~90 ℃）300 mL 于
70℃回流脱脂 1.0 h。 倾去石油醚， 剩余物挥发干溶
剂后， 用 95％乙醇 300 mL 于 70℃水浴回流 1.0 h，
将乙醇液倾出， 布氏漏斗过滤。 滤渣中加蒸馏水
500 mL 浸泡过夜后， 于 80 ℃水温浸提 1.0 h， 过
滤， 用蒸馏水 500 mL 于 80 ℃重复温浸提取 1.0 h，
过滤， 合并滤液， 减压浓缩至 200 mL[8-9]。
沉降条件试验： 按单因子 5水平进行设计， 采
用乙醇沉降， 乙醇浓度水平分别为 50％、 60％、
70％、 80％、 90％乙醇溶液沉淀其中多糖， 沉淀物
即为粗多糖， 干燥后称重。
（2） 山苦茶多糖与蛋白质分离方法筛选。 茶多
糖是与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白
的总称， 因而粗多糖中含有大量蛋白质， 去除多糖
中蛋白质常用的方法有 Sevag 法、 三氟三氯乙烷
法、 三氯醋酸法等， 其原理是利用蛋白质在有机溶
剂中变性的特点， 使多糖不沉淀而蛋白质沉淀。 其
中 Sevag 法是经典的脱蛋白方法， 是用氯仿： 正戊
醇或正丁醇按照 4 ∶ 1 比例混合加到样品中振摇，
使其中蛋白质变性成不溶状态后介于提取液与
Sevag 试剂交界处， 用离心法除去。 其优点是操作
条件温和， 可避免多糖变性降解， 缺点是 1次只能
脱去少量蛋白， 即使重复多次， 也难将蛋白除尽[12]。
蛋白酶可酶解蛋白质， 粗多糖经蛋白酶酶解后， 再
采用 Seveg 法去除蛋白质可提高蛋白质去除率。 本
研究采用 4 种方法分离蛋白试验： A. 不去除蛋白
质； B. 加入0.125 g 蛋白酶（相当于样品质量1.0％）
于50℃酶解5.0 h，而后加热至90℃灭酶。 冷却至室
温，离心。 C.加入Sevag试剂（V三氯甲烷 ∶ V正丁醇= 4 ∶ 1）
振荡30 min后静置分层， 取上清液， 重复3次脱蛋
白， 取上层清液； D. 加入0.125 g 蛋白酶于50 ℃酶
解5.0 h，而后加热至90 ℃灭酶。 冷却至室温， 离心
后加入Sevag试剂（同C）振荡30 min后静置分层， 重
复3次脱蛋白， 取上层清液。 上层清液置于透析袋
568- -
第 3 期 苏冰霞等： 山苦茶多糖的分离和含量测定
重复次数 1 2 3 4 5
吸光度 0.922 0.929 0.938 0.950 0.956
浓度/（mg/L） 143.720 144.880 146.380 148.380 149.380
稀释因素(D) 50.00 50.000 50.000 50.000 50.000
换算因子， f
- 2.783 2.761 2.733 2.696 2.678
平均值， f
- 2.730
表 1 茶多糖对葡萄糖的换算因子
标准溶液 1 2 3 4 5
浓度/（mg/L） 25.000 50.000 100.000 200.000 250.000
吸光度 0.190 0.369 0.684 1.278 1.558
表 2 葡萄糖标准溶液系列浓度
（相对分子质量 10 000）用流动自来水透析 48 h，
蒸馏水透析 24 h 后将透析液浓缩， 加入 95％乙醇
使乙醇含量达 1.2.1（2）试验所得最佳乙醇浓度， 静
置过夜， 离心（4 500 r/min, 10 min）， 所得沉淀依次
用无水乙醇、 丙酮、 乙醚 2次洗涤， 干燥， 即得精
制山苦茶多糖。
2 结果与分析
2.1 测定波长的选择
将显色后的标准液（浓度100 mg/L）和多糖提取
液在 400 ~900 nm 波长范围扫描， 得到葡萄糖的
可见吸收光谱（图1）与多糖提取液的可见吸收光谱
（图2）。
从图 1可以看出， 葡萄糖标准液最大吸光度在
604 nm 左右。 图 2 中多糖提取液（组分中除葡萄糖
外还含有其他糖类、 蛋白质等杂质） 比标准液复杂
使最大吸光度蓝移， 其显色较标准溶液深， 本实验
以葡萄糖标准液最大测定波长为 604 nm 为测定波
长。 根据换算因子校正多糖提取液浓度。
2.2 换算因子确定
根据 1.2.1 的方法得出茶多糖对葡萄糖的换算
因子， 见表 1， f=2.73。
2.3 工作曲线的绘制
根据 1.2.1 的方法得到葡萄糖标准溶液的浓度
系列见表 2， 标准工作曲线见图 3。
从图 3可知， 葡萄糖含量在 25.00~250.00 mg/L
与显色吸光度有着良好的线性关系， 回归方程为:
y=0.006A+0.059 7， 相关系数 r=0.999 6。
2.4 乙醇浓度对多糖沉淀量的影响
依据 1.2.2 的方法， 将多糖提取液分为 5 份，
每份 50 mL， 分别加入 50％、 60％、 70％、 80％、
90％乙醇沉淀多糖， 将沉淀所得多糖称重， 结果见
图 4。
大分子多糖分散于水中形成溶胶， 易引起聚
沉， 加入较高浓度的乙醇时乙醇可迅速脱除多糖分
子表面的水分， 破坏胶粒水化膜， 使多糖沉出 [13]，
为了准确测定多糖的含量， 就必须使用足够量的乙
醇把山苦茶中的多糖尽可能的完全沉淀出来。 由图
4 可看出， 随着乙醇浓度由 50％增至 90％， 多糖
沉淀量也递增， 说明乙醇浓度大小对多糖得率影响
较大。 80％~90％乙醇浓度多糖沉淀量变化不大，
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
400 500 600 700 800 900
波长/nm
图 1 葡萄糖溶液（100 mg/L）可见吸收光谱
吸
光
值
400 500 600 700 800 900
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
图 2 多糖提取液可见吸收光谱
吸
光
值
波长/nm
569- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
编号 取样量/g 定容体积/mL 吸光度/A 多糖浓度/（mg/L） 多糖占样品含量/％ 多糖平均含量/％ RSD/％
1 0.102 2 25 0.901 140.22 0.957 1.012 4.52
2 0.102 8 25 0.928 144.72 0.988
3 0.098 4 25 0.947 147.88 1.010
4 0.098 6 25 1.002 157.05 1.072
5 0.099 5 25 1.003 157.22 1.074
6 0.100 6 25 0.914 142.38 0.972
表 4 山苦茶多糖含量测定结果
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 50 100 150 200 250 300
y=0.06 x+0.059 7
R2=0.999 2
葡萄糖浓度（mg/L）
图 3 葡萄糖标准工作曲线
吸
光
度
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
50 60 70 80 90 100
乙醇浓度/％
图 4 乙醇浓度对多糖沉淀影响
多
糖
沉
淀
重
量
/g
除蛋白质方法 序号
沉淀多
糖量/g
称取多
糖量/g
定容体
积/mL
吸光
度/A
葡萄糖浓
度/(mg/L)
多糖含量（占沉淀多糖
百分比， 乘以换算因子f）/％
多糖含量（占样
品百分比）/％
不去除蛋白质 A 1.503 0 0.102 2 25 0.941 146.90 9.809 0.667
Sevag 法除蛋白质 B 1.261 1 0.095 3 25 0.963 150.55 10.78 0.815
蛋白酶法除蛋白质 C 1.267 6 0.098 9 25 1.114 175.72 12.12 0.946
Sevag 法和蛋白酶法除蛋白质 D 0.999 5 0.100 4 25 1.001 156.88 10.66 1.070
表 3 样品多糖测定结果
因此综合考虑经济因素， 以 80％乙醇沉淀提取多
糖可得最佳沉淀效果。
2.5 Sevag 法和蛋白酶法去蛋白对山苦茶多糖含量
的影响
Sevag 法和蛋白酶法去除蛋白质， 得精制多糖，
测定多糖含量， 结果见表 3。
从表 3 可以看出， Seveg 法和蛋白酶法均可除
去粗茶中的部分蛋白质， Seveg 法主要是由于混合
化学试剂与多糖中蛋白质形成凝胶， 离心后形成沉
淀而除去。 蛋白酶可降解蛋白质， 粗多糖经过蛋白
酶水解后， 再采用 Seveg 法去除蛋白质的效果明显
提高[14]， 多糖含量最高。
2.6 山苦茶多糖测定结果
称取 1.2.2（D）方法所得山苦茶多糖 6 份， 每份
0.1 g 左右， 用蒸馏水溶解， 定容于 25 mL 容量瓶，
测定多糖含量， 结果见表 4。 结果重复性较好， 多
糖平均含量为 1.012％ ， 相对标准偏差 RSD 为
4.52％。
2.7 稳定性试验
将 90％乙醇沉淀的多糖溶液在放置 0.5、 1.0、 2.0、
3.0、 4.0 h 时测定多糖浓度， 观察吸光度 A， 结果
见图 5， 其测定结果随时间较稳定（1.0~4.0 h）。
2.8 加标回收实验
称取 1.2.2（D）方法所得山苦茶多糖 0.1 g 各 3
份， 用蒸馏水溶解， 定容于 25 mL 容量瓶， 精确加
入 100 mg/L糖液 1.0 mL， 测定多糖含量并计算回收
率， 结果见表 5， 可见回收率为 93.70％~99.49％。
1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0 1 2 3 4 5
吸
光
度
/A
多糖显色稳定性
时间/h
图 5 稳定性试验
570- -
第 3 期
样品号 取样量/g 样品多糖浓度/（mg/L） 加标量/mg 测定多糖浓度/（mg/L） 回收率/％ 平均回收率/％ RSD/％
1 0.100 0 148.22 0.1 151.46 99.49 96.7 2.45
2 0.100 0 148.22 0.1 142.89 93.70
3 0.100 0 148.22 0.1 147.70 96.95
表 5 回收率试验
3 讨论与结论
山苦茶是海南植物资源中一种具有经济开发价
值的野生茶树， 目前对山苦茶有效成分及其活性作
用尚缺乏一定的理论研究， 因此有必要研究山苦茶
叶活性成分。 茶叶多糖是目前研究的热点， 本研究
提取分离山苦茶叶中的多糖， 得到纯度较高的多糖
产物。 为山苦茶多糖的活性作用较深入研究做好基
础工作。
本研究测定山苦茶多糖含量时先用石油醚和
80％乙醇提取， 以除去脂溶性成分和单糖、 低聚
糖、 苷类及其它干扰性成分， 再用水提醇沉法分离
多糖 [8-9]。 实验确定得最大吸收波长为 604 nm， 考
察不同浓度的乙醇溶液沉淀多糖。 结果表明， 80％
乙醇对多糖沉淀效果最佳。 采用 Sevag 试剂和蛋白
酶脱蛋白， 并经透析除去部分蛋白质和小分子糖类
后测得多糖含量为 1.012％， 该方法回收率 96.7％，
RSD 为 2.45％。 通过实验表明， 该方法测定简便
可行， 供试液在 4 h 内稳定， 重现性良好， 测定结
果准确。
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责任编辑： 高 静
苏冰霞等： 山苦茶多糖的分离和含量测定 571- -