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收稿日期：2010-02-09
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划(No.2006BAD08B02)，国家“863”计划资助项目(No.2006AA10A208)
作者简介：甘邱锋，男，生于1983年，在读硕士研究生，研究方向：生物制药。E-mail: alex_gan2010@126.com。
*通讯作者：E-mail: zxl@chinagrain.org
文章编号：1001-8689(2011)01-0018-07
刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化
甘邱锋1,2 张晓琳2,* 王洁颖2,3 汪洋2 黄必旺1 关雄1
(1 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002；2 国家粮食局科学研究院，北京 100037；
3 天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 300457)
摘要：目的 研究多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)原生质体制备与再生的最佳条件。方法 利
用数理统计的方法研究了不同制备培养基、菌龄、甘氨酸浓度、溶菌酶处理条件以及再生培养基对原生质体制备和再生的影
响，并考察了原生质体的适宜保藏温度。结果 菌体在添加0.3%甘氨酸的EHC培养基中培养72h，用2mg/mL溶菌酶32℃酶解
40min后，涂布在再生培养基R6上再生，原生质体制备率超过99%，再生数可达到107cfu/mL。刺糖多孢菌原生质体可置于4℃
短期保存72h，长期保存需要放置于-80℃条件下。结论 优化的结果为刺糖多孢菌原生质体融合育种和遗传转化体系建立奠定
了基础。
关键词：刺糖多孢菌；原生质体； 制备与再生
中图分类号：Q932 文献标识码：A
Protoplast formation and regeneration for Saccharopolyspora spinosa
Gan Qiu-Feng1, 2, Zhang Xiao-Lin2, Wang Jie-Ying2,3, Wang Yang2, Huang Bi-Wang1 and Guan Xiong1
(1 Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou
350002; 2 Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037; 3 Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of
Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457)
Abstract Objective The optimal conditions for the formation, regeneration and preservation of protoplasts
were established in Saccharopolyspora spinosa N-15-50-4B, a spinosad-producing strain. Methods Several crucial
factors were tested on protoplast formation and regeneration including the preparation medium, spawn age, glycine
concentration, regeneration medium and the treatment conditions of lysozyme. Results The results presented that
the protoplast could be effi ciently formed and regenerated under a certain condition. When the collected mycelia from S.
spinosa N-15-50-4B grown in EHC medium with 0.3% glycine for 72h and were treated by 2mg/mL lysozyme at 32℃
for 40min, then plated on the R6 medium, the rate of protoplasts formation could reach more than 99% and the number
of regeneration protoplast was up to 107cfu/mL. We also studied the effects of temperature on protoplast preservation.
Short-term storage for protoplasts was 4℃ for 72h, and long-term storage needed -80℃. Conclusion These studies
enable to improve spinosad-producing strains though protoplast fusion and to establish genetic transformation system
of S. spinosa.
Key words Saccharopolyspora spinosa; Protoplast; Preparation and regeneration
遗传育种与生物合成
中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期
DOI:10.13461/j.cnki.cja.004708
. 19 .刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化 甘邱锋等
刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)是1982
年Eli Lilly公司的化学家在加勒比海地区一个废弃
的糖蜜酒厂附近土壤中分离得到的，在对其发酵
液进行抗蚊虫幼虫活性实验时发现了一系列生物
活性物质，其中两个活性最高的组分为spinosyn A
和spinosyn D，它们的混合物被命名为多杀菌素
(Spinosad)[1]。多杀菌素是刺糖多孢菌胞内次级代谢
产物，对鳞翅目害虫具有摄食和触杀毒性，作用机
理独特，与目前使用的各类杀虫剂没有交互抗性，
杀虫谱广，选择性强，对非靶标生物的毒性很低，
对人和其他哺乳动物非常安全[2]，并因此获得美国
“总统绿色化学品挑战奖”，被认为是当前国际上
最具发展前景的生物杀虫剂。
目前，有关多杀菌素合成的生化及遗传学基础
的研究已取得了较大进展。多杀菌素的生物合成途
径已基本阐明，有关的基因簇已被克隆，多数基因
的功能已确定。与其他大环内酯类抗生素相似，多
杀菌素的生物合成采用聚酮合成途径，共涉及到23
个基因，这些基因大部分组织成簇，排列在长约
80kb的基因簇中[3]。然而这些基因的全局调控机制还
不明朗，刺糖多孢菌的全基因组序列也尚未完成，
这使得在分子水平上进行基因修饰和定向改造相对
困难。目前，国外的研究热点主要集中在多杀菌素
结构类似物及衍生物的发现上[4]。国内对于多杀菌素
的研究起步较晚，还多停留在传统的随机诱变育种
上，筛选工作量大，进展缓慢，多杀菌素的产量仍
低于2g/L，达不到工业化生产的要求[5]。
微生物原生质体技术是近几十年迅速发展起
来的一类细胞生物工程育种技术。自从1 9 7 4年
Okanishi[6]等获得链霉菌原生质体并研究了将其再生
为细胞的条件，Kao[7]发现聚乙二醇能有效诱导细
胞融合后，这一技术很快地被应用于微生物菌种选
育。经过30多年的发展，随着研究方法的不断改进,
围绕着原生质体已经形成了包括原生质体诱变、融
合、转化和基因组重排等一系列技术。利用这些技
术可以提高抗生素的产量，改变抗生素的组分和获
得新的抗生素[8]，而原生质体的制备与再生则是各
项技术得以应用的基础。国内外针对刺糖多孢菌原
生质体制备与再生的研究报道很少，内容缺乏系统
性，侧重研究溶菌酶处理条件，对机理分析较少，
获得的制备率也不高[20]。本文对实验室选育的多杀
菌素高产菌株S. spinosa N-15-50-4B的原生质体制备
与再生条件进行了系统优化，获得的原生质体制备
率超过99%，再生数可达107cfu/mL，并研究了原生
质体的适宜保藏温度，为下一步利用原生质体技术
选育优良性状的多杀菌素产生菌奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)N-15-50-
4B为国家粮食局科学研究院通过氮离子注入获得的
多杀菌素高产突变株。
1.2 培养基
刺糖多孢菌固体产孢培养基为ISP2[9]。原生质
体制备培养基分别为CSM[10]、TSB[11]、EHC[12]、
HU(g/L)和KR(g/L)。HU(g/L)：酪蛋白胨17，大豆蛋
白胨3，葡萄糖2.5，氯化钠5，K2HPO4 2.5，pH7.3；
KR(g/L)：蛋白胨25，酵母提取物3，葡萄糖5，玉米
浆10，可溶性淀粉3，麦芽糖4，硫酸镁2，pH7.2；
YD培养基(g/L)：酵母提取物10，葡萄糖10，琼脂
18，pH7.0。再生培养基分别为R5、R6、RM14[11]和
M-G(改良的高氏培养基)[13]。
1.3 溶液
P缓冲液(P10 buffer，Kieser T et al, 2000)：K2SO4
0.25g，蔗糖 103g，MgCl2·6H2O 2.02g，微量元素溶
液2mL；加蒸馏水至800mL，115℃灭菌20min。使
用前每80mL上述溶液加入：KH2PO4(0.5%) 1mL，
CaCl2·2H2O(3.68%) 8mL，MES(0.1M，pH6.5)
10mL，P缓冲液用于洗涤、悬浮和保藏原生质体[14]。
溶菌酶溶液：采用活力单位为20000U/mg溶菌
酶，P缓冲液配制，现配现用。
1.4 原生质体制备
取新鲜且成熟的S. spinosa N-15-50-4B斜面，用
0.02%无菌葡萄糖溶液冲洗斜面，收集孢子悬液。
按照4%接种量吸取孢子悬液接种于原生质体制备培
养基中(装量为25mL/250mL三角瓶)，同时添加不同
浓度的甘氨酸，29℃摇床培养3d(转速160r/min，偏
心距4cm)。在4℃条件下，3400r/min离心10min收集
菌丝体，用预冷的P缓冲液洗涤菌丝体3次，将离心
收集的菌丝体悬浮于经过滤除菌的溶菌酶溶液(2mg/
mL)中，混合均匀后32℃水浴保温，作用过程中轻微
摇晃，使菌体充分悬浮在酶液中，并每隔一段时间
进行1次镜检。酶解完毕的菌丝用装有脱脂棉的过滤
试管进行过滤，3000r/min 4℃离心8min，弃上清，
原生质体沉淀用P缓冲液洗涤1次后，悬浮于一定量
的P缓冲液中，用血球计数板计数，将原生质体数目
用A表示，4℃或-80℃保存备用。
. 20 .
1.5 原生质体再生
原生质体经P缓冲液适当稀释后分别涂布在已
吹干的再生培养基和YD培养基上，29℃恒温培养
10d。在YD培养基上生长的菌落为酶解不完全的菌
丝体片段[15]，将菌落计数结果用B表示。在再生培养
基上生长的菌落是原生质体与菌丝体片段的总和，
将菌落计数结果用C表示。
原生质体形成数=A-B，原生质体再生数=C-B，
原生质体制备率=(C-B)/C，原生质体再生率=(C-B)/
(A-B)。
1.6 菌体生物量测定
菌体生物量的测定采用干重法 [16]，每12h收集
10mL菌液，共收集10次，测定结果绘制成生长曲
线，并利用改进的Gompertz模型进行拟合：

式中：X为生物量的浓度(g/L)；A为渐进值，即
生物量可达到的最大值(g/L)；t为细胞培养时间(h)；
λ为细胞生长延迟时间(h)；Um为细胞最大比生长速
率(g/h)，e为常数(2.71828)[17]。
1.7 试验数据处理
每个试验分别设置对照，重复3次，试验结果采
用SPSS软件进行方差分析与Duncans多范围检验，
显著水平α=0.05。
2 结果与分析
2.1 原生质体制备培养基的选择
获得生长代谢旺盛、分散性能良好的菌丝体是
原生质体制备和再生的前提条件。实验分别考察了
5种不同原生质体制备培养基对刺糖多孢菌生长的
影响，结果见表1。其中，CSM培养基最适宜菌株S.
spinosa N-15-50-4B的生长，其生物量高于其他培养
基，但差异显著性分析结果显示CSM与EHC两种培
养基之间生物量差异不显著。在进行原生质体制备
的实验过程中发现CSM培养基培养的菌丝体在酶解
过程中会产生大量的絮状沉淀，菌体分散性能差，
而相比之下，使用EHC培养基则菌丝体的分散性比
较好。分别对采用这两种培养基制备的原生质体数
进行比较也发现EHC培养基要优于CSM培养基，因
此，我们选择EHC培养基作为刺糖多孢菌的原生质
体制备培养基。
2.2 菌龄对原生质体制备与再生的影响
放线菌细胞壁的成分和结构在细胞生长的各个
时期有所不同。对数生长期时，菌体的细胞壁中肽
聚糖含量最低，对溶菌酶的作用最敏感，但是对数
生长早期的菌体相对较为脆弱，酶的过度作用会影
响原生质体的再生，所以多采用对数生长中后期的
菌体制备原生质体[18]。
微生物的生长是一个随时间变化的连续过程，
一般由延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期组
成，总体呈现S型[19]。有多个方程可以用来描述生
物种群的S型增殖曲线，如：Gompertz, Richards,
Stannard和Schnute模型等。其中，Gompertz模型求解
容易，应用也较广。本实验即通过Gompertz模型模
拟N-15-50-4B的生长趋势，分别在0~120h测定菌体
干重，绘制生长曲线，求得其进入对数生长期的时
间、最大生物量、比生长速率3个基本参数，以便准
确选取合适菌龄的菌丝体进行原生质体制备，结果
见图1及表2。Gompertz方程对菌株N-15-50-4B的生
长曲线方程进行回归，其相关系数R2为0.907，表明
该模型回归效果较好，可应用该模型对N-15-50-4B
的生长进行描述。表2显示N-15-50-4B的延滞期长达
26h，即在26h后进入对数生长期，72h后趋于平稳进
入稳定期。
培养基 生物量(g/L)
TSB 4.6375±0.0125a
CSM 6.3875±0.8250b
EHC 5.8375±0.8875b
HU 1.7500±0.3500c
KR 3.7750±0.1125a
表1 S. spinosa N-15-50-4B在不同培养基中的生物量
Tab. 1 Biomass of S. spinosa N-15-50-4B in different mediums
注：均值±标准差 表格同一列中带有不同字母上标(a,b,c)的数值
表示在5%显著水平下，根据邓肯氏多范围检验结果，数值间存在显
著差异。
图1 S. spinosa N-15-50-4B实测生长曲线与Gompertz
模型拟合曲线
Fig. 1 Actual growing curve and predicted curve of
S. spinosa N-15-50-4B
中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期
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根据生长曲线拟合结果，分别选取培养48h，
60h和72h的菌丝体进行原生质体制备，采用R6培养
基考察原生质体再生情况，结果如图2。随着培养
时间的延长，生物量增加，制备的原生质体数与再
生的原生质体数均呈现递增趋势，但是再生率却逐
步递减，48h再生率最大，60h迅速降至0.4%以下，
72h略有所回升。结果表明对数生长中期的原生质体
再生能力最强，但是该时期制备的原生质体浓度太
低，综合考虑原生质体形成数与再生能力，选择菌
龄72h制备原生质体。
2.3 甘氨酸浓度对菌体生长的影响
在培养基中添加一定浓度的甘氨酸，可有效促
进菌丝体细胞壁形成对溶菌酶敏感的结构，大幅度
提高原生质体释放，且制备的原生质体质量高，但
过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到
足够的菌丝体。在EHC培养基中添加甘氨酸至终浓
度分别为0.1%，0.3%，0.5%，0.7%和1% ，考察甘
氨酸对N-15-50-4B菌体生长的影响。镜检结果表明
(见图3)，培养基中添加甘氨酸后，菌丝体断裂分支
增多，当添加量大于0.5%时，菌液明显变得稀薄。
生物量测定结果表明(见表3)，随着甘氨酸添加量的
增加，菌体生物量递减，说明N-15-50-4B对甘氨酸
较为敏感，Duncans显著性检验结果显示甘氨酸添加
量在0.1%~0.3%之间，对菌体生长没有显著影响，所
以选择添加0.3%甘氨酸制备原生质体。
2.4 原生质体再生培养基的选择
考察了4种不同的原生质体再生培养基，结果
如表4及图4。不同培养基上菌落形态会发生分化，
再生率也有很大差异。在R5培养基上，再生菌落
呈馒头状隆起，产孢丰富，体积较大，菌落直径
0.2~0.8mm；在R6培养基上，菌落呈扁平放射状，产
孢较少，菌落直径0.1~0.3mm；在RM14培养基上，
再生菌落隆起呈山峰状，产孢很少，体积较大，菌
落直径0.2~0.6mm。在M-G(改良的高氏培养基)上，
菌落扁平，多不规则凹陷，产孢丰富，菌落直径
0.1~0.3mm。
从原生质体再生数量上来看，R6培养基再生数
量要显著大于其他培养基，其配方也比较简单，所
以采用R6作为刺糖多孢菌的原生质体再生培养基。
有文献报道，链霉菌原生质体再生率会随着培
养基中琼脂浓度增加而降低[12]。分别在R6再生培养
基中，添加不同浓度的琼脂(1.2%，1.5%，1.8%，
2%，2.2%)，考察其对N-15-50-4B再生效果的影响，
菌株
Am最大生物
量/(g/L)
Um最大比生长
速率/(g/h)
tg生长延滞
期/h
相关系数
R2
S. spinosa
N-15-50-4B
4.471 0.095 26.321 0.907
表2 Gompertz模型用于描述生长曲线的参数估值
Tab. 2 The calculated parameter values from the modifi ed
Gompertz model
图2 菌龄对S. spinosa N-15-50-4B原生质体制备与再生的影响
Fig. 2 Effects of spawn age on protoplast formation and
regeneration of S. spinosa N-15-50-4B
甘氨酸添加量/% 生物量/(g/L)
0 7.51±0.82a
0.1 6.31±1.25ab
0.3 6.36±0.20ab
0.5 5.42±0.46bc
0.7 3.82±0.49cd
1 3.17±0.76d
表3 甘氨酸浓度对S. spinosa N-15-50-4B菌体生长的影响
Tab. 3 Effect of glycine concentration on growth of S. spinosa
N-15-50-4B
注：均值±标准差 表格同一列中带有不同字母上标(a,ab,bc,cd,d)的
数值表示在5%显著水平下，根据邓肯氏多范围检验结果，数值间存
在显著差异。
A：菌丝体在不含甘氨酸的EHC培养基中培养72h
B：菌丝体在含0.5%甘氨酸的EHC培养基中培养72h
图3 甘氨酸浓度对S. spinosa N-15-50-4B菌体生长
的影响(×400)
Fig. 3 Effect of glycine concentration on growth of S. spinosa
N-15-50-4B(×400)
刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化 甘邱锋等
. 22 .
培养基 原生质体再生数(×106cfu/mL) 再生率/%
R5 0.65±0.22a 0.10
R6 2.71±0.5b 0.45
RM14 1.31±0.47a 0.22
M-G 1.01±0.19a 0.17
表4 不同再生培养基对S. spinosa N-15-50-4B原生质体
再生的影响
Tab. 4 Effects of different regeneration mediums on protoplast
regeneration of S. spinosa N-15-50-4B
注：均值±标准差 表格同一列中带有不同字母上标(a,b)的数值表
示在5%显著水平下，根据邓肯氏多范围检验结果，数值间存在显著
差异。
图4 不同再生培养基上S. spinosa N-15-50-4B再生菌落形
态Fig. 4 Colony morphology of S. spinosa N-15-50-4B on
different regeneration mediums
结果见表5。琼脂浓度对N-15-50-4B的原生质体再生
没有显著的影响，随着琼脂浓度的加大，再生率有
所上升，最佳浓度为2%。
琼脂浓度/% 原生质体再生数(×106cfu/mL) 再生率/%
1.2 1.08±0.46a 0.2
1.5 1.70±0.33a 0.32
1.8 1.49±0.64a 0.27
2 2.25±0.62a 0.42
2.2 1.98±0.83a 0.37
表5 琼脂浓度对S. spinosa N-15-50-4B再生的影响
Tab. 5 Effects of agar concentration on protoplast regeneration
of S. spinosa N-15-50-4B
注：均值±标准差 表格同一列中带有不同字母上标(a,b)的数值表
示在5%显著水平下，根据邓肯氏多范围检验结果，数值间存在显著
差异。
2.5 溶菌酶处理条件对原生质体制备与再生的影响
由于各种微生物细胞壁成分和结构存在差异，
溶菌酶处理条件对不同菌株有着很大的区别。其
中，溶菌酶的浓度、作用时间以及温度都是影响原
生质体制备的关键因素。首先对溶菌酶的浓度进行
了优化，在相同酶解温度及作用时间下，研究了不
同酶浓度对原生质体形成的影响，结果如图5。溶菌
酶的最适浓度为2mg/mL，继续加大溶菌酶浓度，原
生质体形成数反而有所下降。
在溶菌酶浓度为2mg/mL的条件下，考察酶解时
间对原生质体释放和再生的影响，结果如图6。随着
酶解时间的延长，释放的原生质体数量不断增加，
最高可达109CFU/mL，但是对应的原生质体再生率却
随着酶解时间的延长而持续降低。本研究选择酶解
时间40min，此时原生质体的再生数可达107cfu/mL。
图5 溶菌酶浓度对S. spinosa N-15-50-4B原生质体制备的影响
Fig. 5 Effects of lysozyme concentration on protoplast formation
of S. spinosa N-15-50-4B
图6 酶解时间对S. spinosa N-15-50-4B原生质体制备与
再生的影响
Fig. 6 Effects of lysozyme operating time on protoplast
formation and regeneration of S. spinosa N-15-50-4B
在溶菌酶浓度为2mg/mL，酶解40min的条件
下，考察酶解温度对原生质体制备与再生的影响，
结果如图7。随着酶解温度上升，原生质体形成数逐
渐增加，但是当温度上升到32℃后，原生质体再生
率却急剧下降，因此酶解温度选择32℃。
2.6 不同保藏温度对原生质体再生的影响
原生质体的制备过程操作繁琐，费时费力，因
此我们希望在不影响其再生的前提下，能将制备好
的原生质体根据实验需要保藏一定时间。将制备
好的原生质体用P缓冲液稀释后，分别置于29℃、
4℃、-20℃、-80℃条件下，定期取样涂布再生平
板，以新鲜制备的原生质体再生数作对照，考察保
藏温度对原生质体再生的影响，结果如图8。
原生质体在29℃条件下放置7d后涂布再生平
板，R6培养基和YD培养基上均长满菌落，从平板
中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期
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图7 酶解温度对S. spinosa N-15-50-4B原生质体制备与
再生的影响
Fig. 7 Effects of operational temperatures of lysozyme on
protoplast formation and regeneration of S. spinosa N-15-50-4B
上无法估计再生情况。推测原因可能是残留的菌丝
体片段在29℃条件下大量繁殖，致使原生质体的百
分比含量急剧下降，所以该条件不适宜原生质体的
保藏。4℃条件下，适宜原生质体短期保藏，72h内
再生数变化不大，但随着时间的延长再生数急剧减
少；-20℃条件下，24h后原生质体再生数就下降了
65%；-80℃条件下，适宜原生质体长期保藏，再生
数下降得较为缓慢，30d后仍维持在50%以上。
3 讨论
在原生质体制备和再生的过程中，应该综合考
虑各个影响因素，以获得较高的原生质体数和再生
率。本文对S. spinosa N-15-50-4B原生质体的酶解条
件研究发现：溶菌酶浓度在2mg/mL比较适宜，过
高或过低都不利于原生质体的形成和再生，可能是
由于溶菌酶对细胞有一定的毒害作用，随着浓度增
加这种作用也逐渐明显。随着酶解时间的延长，原
生质体的形成数有较大幅度提升，而再生率却持续
下降，推测其原因可能是酶解超过某一临界值后，
图8 不同保藏温度对S. spinosa N-15-50-4B原生质体再生
的影响
Fig. 8 Effects of operational temperatures of lysozyme on
protoplast formation and regeneration of S. spinosa N-15-50-4B
细胞壁消化过于充分使细胞破裂或失去再生能力，
从而导致再生率的降低。酶的活力是与作用温度相
关的，试验中发现溶菌酶的酶解能力随着温度的升
高不断增强，但是超过32℃再生率急剧下降，原因
可能与酶解作用太充分有关，也可能因为温度超过
S. spinosa的培养温度29℃，影响了细胞内酶系统的
活性，从而引起再生率的下降，所以综合考虑了
不同溶菌酶处理条件对原生质体制备与再生的影
响，选择酶浓度2mg/mL，酶解温度32℃，作用时间
40min来制备S. spinosa N-15-50-4B原生质体。
再生培养基的组分也是影响原生质体再生的一
个重要因素。本文选取了四种常用的放线菌再生培
养基考察N-15-50-4B原生质体的再生情况，结果表
明在R6培养基中N-15-50-4B原生质体的再生率最
高。再生培养基的配制基本上是在菌体正常生长的
培养基中，再添加两类物质，一类属渗透压稳定
剂，另一类属营养物质。渗透压稳定剂主要包括蔗
糖，Mg2+，Ca2+等金属离子，营养物质根据功能又可
分为两类：一类是适合于作为细胞壁合成的前体物
质(如各种氨基酸、水解酪蛋白等易于用来合成放线
菌细胞壁短肽聚糖中的短肽链)；一类是通过代谢转
化成细胞壁前体物质或促进代谢，加速细胞壁合成
的营养因子(如含有大量维生素的酵母膏，各种血清
蛋白、糖及原生质体扩张剂等)[18]。R6培养基主要在
碳氮源的组成上区别于其他几种培养基，碳源使用
糊精而不是葡萄糖或者淀粉，氮源除了酪蛋白氨基
酸外还添加了谷氨酸钠，可能是N-15-50-4B对这两
种营养成分利用较好，有利于提高再生率。该研究
结果对菌株的发酵培养基优化也有借鉴意义。
原生质体制备的步骤繁琐，费时费力，一次制
备的原生质体如果可以在较长时间内保持较高的再
生率，节省实验成本同时也保证了实验的可重复
性。原生质体的保藏时间随着菌种和保藏条件的不
同而异，在4℃冰箱中，小小链霉菌和抗生链霉菌保
存12h后，再生能力就损失99%；同样条件下卡那链
霉菌的原生质体在0~24h内再生率变化不明显，而
48h后大多数的原生质体丧失了再生能力[21]。本文研
究结果表明，S. spinosa N-15-50-4B原生质体在4℃条
件下保存72h，再生率基本保持不变，所以该条件适
宜少量制备，短期保藏。长期保藏需置于-80℃或更
低的温度条件下，才能保证其再生率。
本文全面考察了S. spinosa N-15-50-4B原生质体
制备与再生过程中的相关影响因素，并获得了较高
刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化 甘邱锋等
. 24 .
的原生质体再生数(107cfu/mL)，可以满足细胞融合
和遗传转化的要求，为进一步利用原生质体技术和
基因工程手段改良刺糖多孢菌奠定了基础。
参 考 文 献
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中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期