全 文 ：第 32 卷第 2 期
2009年 6 月 　　　　　 辽宁师范大学学报(自然科学版)Journal of Liaoning Normal Unive rsity(Natural Science Edition)　　　　　
Vo l.32　No.2
Jun.　2009
　　文章编号:1000-1735(2009)02-0239-04
细叶百日草变异植株的组织培养及无性系建立
刘立岩1 , 　王关林2
(1.铁岭师范高等专科学校 ,辽宁 铁岭　112001;2.辽宁师范大学生命科学院 ,辽宁 大连　116029)
　　收稿日期:2008-12-10
作者简介:刘立岩(1973- ),女 ,辽宁铁岭人 ,铁岭师范高等专科学校高级实验师;
王关林(1943- ),男 ,浙江海盐人 ,辽宁师范大学教授 ,博士 ,博士生导师.
摘　要:以变异细叶百日草嫩茎为材料 ,进行了愈伤组织的诱导 、分化 、试管苗生根 、移栽的研究.结果表明:MS+
BA1.0+2 , 4-D1.2为嫩茎愈伤组织诱导培养和继代培养的理想培养基;MS+Ag(NO 3)22.0 +BA0.4是愈伤组织和
不定芽分化培养的理想培养基;1/ 3MS+IAA0.5是生根培养的理想培养基;以炉灰渣为基质移栽的成活率为 94%,
扦插的成活率为 89%;定植成活的试管苗保持了后期生长很旺盛变异性状 ,出现了根系增加 1倍左右的特点.
关键词:细叶百日草;组织培养;无性系
中图分类号:Q813.12　　　文献标识码:A
细叶百日草(Zinnia linearis)属菊科百日草属一年生草本植物 ,原产于墨西哥 ,我国多有栽培[ 1-2] .
细叶百日草枝叶纤细 ,紧密丛生 ,其花期从初夏到霜降始终持续开放 ,是花坛栽培的优良植物 ,尤其适于
作为丛植和镶边之用的地被栽植 ,近年来辽宁大连等地已经批量引种.由于细叶百日草的花期长 ,每年
春天栽培的细叶百日草后期都会出现植株长势衰败 、茎叶杂乱 、下部枯萎 、花径花瓣都很小等现象 ,严重
地影响了观赏效果.但在批量栽培中 ,偶尔也会出现后期生长仍然很旺盛的变异细叶百日草.2007年 ,
我们选择后期生长仍然很旺盛的变异细叶百日草植株 ,进行了组织培养及无性系建立的研究 ,以期获得
大量的优良变异植株的种苗 ,满足人们栽培的需要.目前菊科植物组织培养的研究已多有报道[ 3-6] ,但迄
今未见百日草属植物组织培养研究的报道.
1　材料与方法
1.1　材料及灭菌
将在花坛中发现的后期长势非常旺盛的细叶百日草变异植株嫩茎剪下后 ,放到 250 mL 的磨口广
口瓶中 ,用自来水振荡洗涤 30 min左右 ,再用 0.05 %安利洗涤液振荡洗涤约 20 min ,置于超净工作台
上 ,用 75%的乙醇灭菌 30 s 左右 ,迅速用无菌水振荡洗涤 12 次 ,倒入 0.05% HgCl2 溶液振荡灭菌
14 min ,接着用无菌水振荡洗涤 6次 ,将装有材料的瓶子置于约 20 ℃室温下或恒温箱中放置 12 h ,然后
再用 0.05%HgCl2 灭菌 5 min ,接着用无菌水洗涤 5次 ,即可获得细叶百日草无菌嫩茎.
1.2　培养条件
以MS或 1/3MS为基本培养基 ,附加不同种类不同浓度的 BA 、IAA 、IBA 、NAA和 2 ,4-D.以MS为基
本培养基加蔗糖 30 g/ L ,以 1/3 MS为基本培养基加蔗糖 10 g/ L.培养基胨力强度为 180 g/cm2[ 7] ,pH 为
5.8 ～ 6.培养温度 20 ～ 25 ℃,光照度 2 000 ～ 3 000 lx ,光照 10 ～ 12 h/d.
1.3　方法
1.3.1　愈伤组织的诱导及继代培养　将无菌嫩茎用解剖刀切成长 0.1 ～ 0.2 cm 的茎段 ,接种于含有不
同浓度 2 ,4-D和BA的 MS 培养基上后置于暗培养 20 d ,然后放到光照下培养30 d观察统计.试验重复
了 3次 ,每个处理接种 20个材料.把在附加 BA 1.0 mg/L(单位下同略)+2 , 4-D1.2的 MS 培养基上诱
导培养的愈伤组织 ,接种到相同的培养基上进行愈伤组织的继代培养.
1.3.2　愈伤组织的分化及不定芽的继代培养　把上述培养的愈伤组织分成颗粒状 ,接种于附加 BA 、
NAA 、IAA 和 IBA 不同激素浓度的 MS+A g(NO3)22.0 培养基上 ,进行愈伤组织的分化培养;试验重
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复了 4次 ,每次接种 100个愈伤组织颗粒.把分化培养的不定芽从基部剪下 ,接种到相同的培养基上 ,进
行不定芽的继代分化增殖培养.进行了 8次继代培养.
1.3.3　试管苗的生根培养和继代培养　将上述诱导分化培养的高于 0.5 cm的不定芽 ,从基部剪下后 ,
接种到附加不同浓度 NAA(0.1 、0.5 、1.0 mg/ L)、IAA(0.1 、0.5 、1.0 mg/ L)的 1/3 MS 培养基上进行
生根培养.每个处理接种 50个外植体.试验重复 4次.观察生根培养情况.
1.3.4　试管苗的移栽与扦插　选择生根试管苗生长旺盛的培养瓶 ,将瓶塞打开 ,放到 4 000 ～ 5 000 lx
左右的光照下炼苗 3 ～ 4 d后 ,将试管苗从培养瓶中取出 ,立刻用净水洗去基部的培养基 ,然后移栽到上
面铺有 5 ～ 7 cm 厚珍珠岩 、草炭土 、炉灰渣或肥沃园土 4种不同基质的温室苗床上.在保持温度 20 ～
28 ℃、湿度90%以上 、没有直射光照的条件下 ,25 d时观察统计.把经过炼苗的生根苗 ,剪成长 2 cm 左
右 、至少具有 2个生长点的顶芽或茎段后 ,把下部切口浸在 90 mg/ L 的 IAA 溶液中处理 3 min ,再插入
事先已经浇透水 、打上深约 1 cm 小孔 、与上述 4种移栽基质相同的温室苗床中.在保持与移栽相同的环
境条件 ,25 d时观察统计.移栽和扦插进行了 4次重复试验.
2　结果
2.1　嫩茎愈伤组织的诱导及继代培养
表 1　培养基中不同浓度激素对愈伤组织诱导的影响
激素深度/(mg · L-1)
BA 2 , 4-D
外植
体数
愈伤组
织数
愈伤组织
诱导率/ %
愈伤组织
长势
0. 0 20 0 0
0.1 0 20 0 0
1.0 0 20 0 0
2.0 0 20 0 0
3.0 0 20 0 0 0
0.1 0.1 20 2 10 +
1.0 1.2 20 19 95 ++
2.0 1.8 20 19 95 ++
3.0 2.4 20 8 40 +
　　注:++为长势好;+为长势一般.
观察表明 ,接种后 20 d左右 ,在有的培
养基上开始形成愈伤组织 ,转移到光照下培
养后 ,愈伤组织迅速生长变绿.由表 1可见 ,
在只含不同浓度 BA ,不含 2 , 4-D 的培养基
上 ,不能诱导形成愈伤组织;在同时含不同浓
度 BA 和 2 ,4-D的培养基上都能诱导形成愈
伤组织.其中在 BA1.0+2 ,4-D1.2和BA2.0
+2 ,4-D1.8两种培养基上的愈伤组织诱导
率均为 95%.但是 ,从愈伤组织的形态和长
势看 ,在附加 BA1.0+2 ,4-D1.2 这一培养基
上诱导的愈伤组织好于附加 BA2.0 +2 ,
4-D1.8的培养.前者诱导的愈伤组织为绿色
的颗粒状 ,这样的愈伤组织为具有分化能力愈伤组织[ 8-9] (见图 1).重复试验所获得的结果基本保持
不变.
经过 6次继代培养表明 ,继代培养的愈伤组织外部形态保持不变 ,40 d为一个继代培养周期 ,浅绿
色颗粒状愈伤组织的增殖率为 42.3.上述结果说明 ,MS+BA1+2 ,4-D1.2这一培养基为细叶百日草有
利变异植株嫩茎愈伤组织诱导培养和继代培养的理想培养基.
2.2　愈伤组织的分化及不定芽的分化继代培养
图 1　诱导培养的愈伤组织
接种 30 d左右可见愈伤组织颗粒开始分化出绿色的芽点 , 60 d时观
察统计.由表 2可见 ,在 BA单独使用和不含任何激素的培养基上愈伤组
织可以分化.但从愈伤组织的分化率及分化苗的长势看 , 在 MS +
Ag(NO 3)2 2.0+BA0.4 的培养基上 ,不仅颗粒状愈伤组织分化率达到了
91%,平均每块愈伤组织的分化芽数为 8.7 个 ,而且分化苗长势也较好.
观察还表明 ,在这一培养基上诱导的分化苗 ,呈嫩绿色丛生状 ,株高多在
0.5 cm 以上(图2).不定芽的增殖培养统计证明:每个不定芽经过 40 d的
分化培养 ,平均可增殖 5.8个不定芽 ,并且分化增殖的不定芽叶片伸展 ,叶色深绿 ,长势旺盛.这说明
MS+Ag(NO 3)2 2.0 +BA0.4是细叶百日草变异植株愈伤组织和不定芽分化培养的理想培养基.
第 2 期 刘立岩等:　细叶百日草变异植株的组织培养及无性系建立 241　
表 2　不同浓度激素对愈伤组织分化的影响
BA/
(mg· L-1)
IBA/
(mg· L-1)
IAA/
(mg · L-1)
NAA/
(mg · L-) 分化数
分化率/
%
每块平均
分化芽数
分化苗
长势
0 0 0 0 47 47 2.8 ++
0 0.5 0 0 0 0 0
0 1.0 0 0 0 0 0
0 0 0.5 0 0 0 0
0 0 1.0 0 0 0 0
0 0 0 0.5 0 0 0
0 0 0 1.0 0 0 0
0.4 0 0 0 91 91 8.7 ++
0.4 0.5 0 0 0 0 0
0.4 1.0 0 0 0 0 0
0.4 0 0.5 0 0 0 0
0.4 0 1.0 0 9 0 0
0.4 0 0 0.5 0 0 0
0.4 0 0 1.0 0 0 0
1.2 0 0 0 23 23 5.6 +
1.2 0.5 0 0 0 0 0
1.2 1.0 0 0 0 0 0
1.2 0 0.5 0 0 0 0
1.2 0 1.0 0 0 0 0
1.2 0 0 0.5 0 0 0
1.2 0 0 1.0 0 0 0
　　　　注:++为长势好;+为长势一般.
2.3　试管苗培养及生根继代培养
试验结果表明 ,接种在含 NAA 的培养基上的不定芽不易生根生长为试管苗 ,而接种在含 IAA 的
培养基上的不定芽容易生根.其中接种在 1/3MS+IAA0.5的培养基上的不定芽 ,培养 10 d 左右可形
成根原基 ,随后根系和植株迅速生长.当培养至 30 d 时 ,96%不定苗可以生长为具有 10 ～ 15条根 、高
4 cm 左右 、长势旺盛的试管苗(图 3).将上述培养生长旺盛的生根试管苗剪成至少具有 1个生长点 、长
约 1 cm 的茎段或顶芽 ,接种到生根培养基中 ,进行生根继代培养.进行了 9代生根继代培养证明 ,生根
继代培养的周期为 25 d ,不仅试管苗叶色深绿 、叶片伸展 、茎粗壮 、根系发达 、高 4 ～ 5 cm ,而且所培养的
试管苗没有无效苗 , 25 d的繁殖系数为 3.2.把用于进行生根继代培养的试管苗基部保留 1 ～ 2 个叶片
(实际上也保留了 2 个生长点),再经过 25 d的培养 ,又能生长出 1代生长旺盛的试管苗.采用这种方
法 ,只要控制不被污染 ,接种 1次材料 ,就可培养 3代生长旺盛的试管苗.这说明 1/3MS+IAA0.5 是细
叶百日草试管苗生根培养的理想培养基.
图 2　分化的不定芽 图 3　生根试管苗
2.4　试管苗的移栽及扦插
观察统计证明:以炉灰渣为基质移栽的成活率为 94%,扦插的成活率为 89%;除了前期扦插苗植株
较小外 ,移栽和扦插成活的试管苗长势都很旺盛.
把在温室中移栽和扦插成活的试管苗小批量的定植到花坛上 ,定植成活率几近 100%.定植成活的
试管苗不仅长势上保持了后期生长很旺盛的变异性状 ,而且秋末的长势还出现了比变异植株还旺盛 ,根
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系增加 1倍左右的特点.
3　讨论
本研究以细叶百日草有利变异植株的嫩茎为材料 ,进行了愈伤组织诱导 、愈伤组织分化 、不定芽的
分化 、试管苗生根 、移栽的研究 ,成功地建立起细叶百日草变异植株的无性系.该研究不仅可以为细叶百
日草变异植株的人工栽培提供后期生长旺盛 、长势整齐的种苗 ,而且也证明细叶百日草的非分生组织和
细胞也具有全能性 ,同时还为细叶百日草的转基因研究奠定了技术基础.
在愈伤组织的继代培养中 ,40 d的繁殖系数为 42.3.按照这个速度 ,细叶百日草每年可以繁殖出
42.39 个后代.用生根继代的方法进行快速繁殖 ,25 d的繁殖系数为 3.2 ,按照这个速度 ,细叶百日草每
年可以繁殖出 3.214.6个后代.这说明不论采用哪种方法进行快速繁殖 ,其速度都可以满足人们栽培对大
量种苗的需求.从试管苗的长势看 ,生根继代方法不仅培养的试管苗生长非常旺盛 ,没有无效苗 ,而且一
次生根培养可繁殖 2 ～ 3代试管苗.因此 ,生产上应该以生根继代的方法进行快速繁殖.
接种在含有不同浓度 NAA的 1/3M S培养基上的不定芽不易生根的原因是:虽然在生根培养初期
NAA可以诱导形成根原基 ,但由于 NAA 的化学性质稳定 ,在随后培养基中 NAA 的浓度不变 ,较高浓
度的 NAA 必然产生抑制根正常生长的作用.而在浓度为 0.5的 IAA 培养基上 ,培养 10 d左右 IAA 促
进形成根原基后 ,就会迅速分解 ,避免了高浓度生长素对根生长的抑制作用 ,促进了根的正常生长.
将细叶百日草试管苗定植到花坛上后 ,试管苗保持了细叶百日草有利变异植株后期生长非常旺盛
的性状.这说明 ,通过嫩茎组织培养的方法建立起的细叶百日草无性系能够保持该植物的遗传特性.移
植苗在后期生长非常旺盛也与以下原因有关:在生根培养过程中 ,向培养基中加入了浓度为 0.5 mg/L
的 IA A , IAA的后效作用也会促进试管苗形成发达的根系 ,能够吸收更多营养 ,促进了后期的生长.
参考文献:
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Tissue cultivation and establishment of asexual line of Zinnia linearis
LIU Li-yan1 , 　WANG Guan-l in2
(1.Tieling T eachers College , Tieling 112001 , C hina;2.College of Life Sciences , Liaoning Normal Universi ty , Dalian 116029, China)
Abstract:The study on callus induction , different iation , ro oting and transplantation of tube seedling
w as taken by using young stem as material.T he resul ts indicated that the ideal medium for induction
and dif ferentiation of cal lusare were M S+BA1 mg/L +2 ,4-D1.2 mg/L +2 , 4-D0.6 mg/ L and MS+
BA0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L , respectively.The ef fective medium fo r ro oting w as 1/3MS +IAA
0.5 mg/L +IAA0.2 mg/L .The surviving rate of t ransplantation and cut ting w as 94% and 89% re-
spectively by using cinder as matrix.The seedling keeps the exuberant g row th and the number of
roo ts w as doubled.
Key words:Z innia linearis;cultiv ation o f tissue;clone