全 文 ：高良姜与混淆品大高良姜的 rDNA ITS区序列分析
牛宪立， 姬可平， 唐立波， 刘 星， 吕国庆, 吴 群
（遵义医学院珠海校区生化教研室，广东 珠海 519041）
摘 要： 利用改良的 CTAB 法提取药材的基因组 DNA， 运用通用引物对高良姜及混淆品大高良姜 rDNA ITS 区进行
PCR 扩增，对产物进行直接测序并对测序结果进行聚类分析。结果表明，经 Clustal X 软件序列比对后发现二者 ITS 的长度
范围在 568~576 bp，有 32 处变异位点，主要集中在 ITS1 区和 ITS2 区，聚类分析表明高良姜与大高良姜各聚为一支，表明
高良姜与大高良姜两种植物碱基序列有较大的差异。
关键词：高良姜； rDNA ； ITS 区序列
中图分类号：Q755 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2010）03-0199-04
Preliminary studies on identification of Alpinia officinarum Hance
and adulterants by the PCR product of rDNA ITS sequencing
NIU Xian-li， JI Ke-ping， TANG Li-bo, LIU Xing，LV Guo-qing, Wu Qun
(Zhuhai Campus Biochemistry Teaching and Reserach,Zunyi Medical College, Zhuhai 519041, China)
Abstract:The genomic DNA of Alpinia officinarum Hance was extracted from yong leaves by an improved CTAB method,
the ITS sequence was amplified by PCR with universal primers of ITS and PCR products were direct sequenced and the
sequencing results were clustered. The Results showed that after amplifited and searched with Blast metheds,the results showed
that eight kinds of plants with a total length ITS sequence for 568～576 bp,had 32 variable sites,mainly concentrated in the ITS1
and ITS2 area.The results of phylogenetic tree indicated the tested materials clould be grouped into two classes.
Key words:Alpinia officinarum Hance； rDNA； ITS sequence
高良姜 (Alpinia officinarum Hance)是姜科山姜属
植物，别名小良姜、良姜，又名徐闻良姜，是一种热带
多年生长的食药兼用的植物资源。 主要分布于广东、
海南、台湾、福建、云南和广西等地。 其中广东徐闻县
种植面积 44 700 hm2，产量占全国 90%以上，反龙塘镇
一镇种植面积就多达 26 700 hm2，有“高良姜之乡”之
称。 龙塘镇因其出产的高良姜干粉多，品质优良，其产
出的高良姜是中国高良姜生产品质的标准，其高良姜
干品畅销全国及海外，在海外享有“中国龙塘良姜”之
美誉。 高良姜干燥的根茎是著名的十大广药之一，有
1 000多年药用历史，高良姜始载于《名医别录》。 其味
辛、性温，有温胃散寒、行气、消食止痛之功效，主治脘
腹寒痛、胃寒吐泻、消积食滞、消化不良等症。 最新研
究表明高良姜还具有化学防护、抗氧化、抗病毒、抗菌
作用，以及抗血栓、抗癌、止痉等作用，此外，高良姜在
香料生产和水果保鲜上也有应用[1-4]。
近年来发现市场上有以大高良姜[Alpinia galanga
(L.)Swartz]根茎冒充高良姜销售，虽然二者性状差异不
大，且文献亦有记载大高良姜在云南等地做高良姜药
用，但其所含挥发油较少，香气较淡，药材质量较差。
高良姜和大高良姜都是姜科植物，是中药中重要的配
伍成分，但二者具有不尽相同的功效，故不能混用。 在
商品市场上及药用处方的配制中，常发生将二者混淆
的情况，这不利于对它们的充分、合理利用，甚至可能
会延误了对疾病的及时治疗，因此有必要对其鉴别而
区别用之。
我国药用植物种类繁多，药材来源复杂，由于缺乏
系统的整理和归类，在药材使用上存在相互混淆、相互
代替、以假乱真、以次充好以及同名异物、同物异名现
象，从而影响了用药的安全性和有效性。 rDNA ITS 序
收稿日期：2009-10-25
基金项目：遵义医学院珠海校区科研启动基金（KY200612）
作者简介：牛宪立（1975-），男，在读硕士生，E-mail:nxl2008
gd@163.com
通讯作者：姬可平（1956--），男，教授， E-mail: jlhjxj@sina.
com
广东农业科学 2010 年第 3 期 199
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2010.03.055
图 1 高良姜的 ITS 全序列 PCR 产物电泳图谱
列分子标记技术可不受环境条件、 样品形态和材料来
源的影响， 用来鉴定药用植物种类可克服传统方法的
不足，因而在药用植物的分类与鉴定、道地性和正伪品
等方面已得到了广泛的应用。 本研究通过 rDNA ITS
分子标记技术建立高良姜的 rDNA 指纹图谱， 进行高
良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可
为中药高良姜的分子鉴定和质量控制， 以及高良姜种
质资源保护和开发提供科学依据。 现将研究结果报道
如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试高良姜分别采自广东徐闻、广西南宁、广东高
州，分别编号为 GL-1、GL-2、GL-3；供试大高良姜分别
采自福建南靖、海南万宁，分别编号为 GL-4、GL-5。
试验使用的主要试剂有 CTAB （上海生工）、Tris
（上海生工）、EDTA （天津大茂化学试剂厂）, RNase
NaCl, NaAc， 酚、氯仿、异戊醇（3∶2∶1）（成都科龙化工
试剂厂）。
试验使用的主要仪器为 Eppendorf 高速低温离心
机 （德国 Eppendorf 公司）、WFH-202B 紫外透射分析
仪 （上海精科实业有限公司）、UV-2550 紫外-可见分
光光度计（日本岛津公司）、电泳仪（北京六一仪器厂）、
PCR 仪 （珠海黑马医学仪器有限公司），PRIAM 3730
自动测序仪（美国 ABI 公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取 取各样本幼嫩叶片 3~5 g， 液氮研
磨成粉末状， 装入 15 mL离心管中用于提取 DNA，总
DNA用改良的 CTAB法[5]提取。
1.2.2 DNA 纯度检测 用 48 μLTE 缓冲液稀释 2
μL基因组 DNA，取 DNA10 μL再加 3 mL双蒸水于石
英杯中，以 TE缓冲液作空白对照。 用紫外分光光度计
法检测 OD260/OD280比值。
1.2.3 PCR 扩增 rRNA ITS 区的通用引物为：P1(5′-
CGT AAC AAG GTT TTC GTA GGT GAA C-3′)，位
于 18S 上，P2(5′-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCA
GCG GG-3′)，位于 28S 上，以扩增 rRNA ITS 区全序
列（引物由上海生工合成）。 PCR扩增反应在 50 μL的
反应体系中进行， 其中含 10×PCR buffer 5 μL，MgCl2
(25 mmol/L)2 μL，dNTP mix (2 mmol/L)5 μL，primer1
(10 pmol/μL)1 μL，primer2(10 pmol/μL)1 μL，DNA 聚
合酶(5 U/μL)5 μL，模板 DNA80～150 ng，补双蒸水至
50 μL。 反应条件为 94℃预变性 4 min，94℃变性 1
min，54℃复性 45 s，72℃延伸 2 min，共 30 个循环，完
成后 72℃延伸 10 min。
1.2.4 凝胶电泳检测 PCR 产物在浓度为 1.5％的琼
脂糖凝胶上电泳，取 8 μL PCR产物样品与溴酚蓝混匀
点样，0.5倍 TBE缓冲液，80 V直流电压电泳 40 min,于
WFH-202B紫外透射分析仪中检测。
1.2.5 rDNA ITS 序列的测定 PCR 产物分别采用直
接测序，大连宝生物公司测序。
2 结果与分析
2.1 DNA纯度检测
提取所得紫外分光光度计检测 OD260/OD280 比值
DNA为 1.8～2.0，符合 PCR的模板 DNA的要求。
2.2 rDNA ITS的 PCR扩增
扩增出的高良姜 rDNA ITS 全序列条带清晰，凝
胶电泳检测结果见图 1。 从图 1 可以看出， 高良姜
rDNA ITS序列（含 5.8S编码区）在 500~700 bp。
2.3 rDNA ITS序列数据分析
2.3.1 rDNA ITS 的碱基差异 对供试高良姜及大高
良姜的 ITS 区全序列分别进行直接测序和克隆测序。
测得序列已登录于 GeneBank（广东徐闻高良姜编号为
GU097441、广西南宁高良姜编号为 GU097439、广东高
州高良姜编号为 GU097442、福建南靖大高良姜编号为
GU097440、海南万宁大高良姜编号为 GU097443）。
参照 GenBank 中已报道的山姜属序列资料来确
定高良姜和大高良姜 rDNA ITS 序列的起始端和终
端，获得 Alpinia officinarum 和 Alpinia galanga 的 ITS
序列，登录号为 AF478718（美国）、EU909424 （广州）
和 EU909429（广州），分别编号为 GL-8、GL-7、GL-6，
应用 Clustal X 软件对本实验序列和相应的已登录序
列对比。各变异位点、ITS序列长度、碱基含量等见图 2
和表 1。
研究结果表明， 高良姜各居群完整 ITS 的长度范
围在 568~576 bp，长度变异较小，仅差 8 bp。 ITS1 区
相差 1 个碱基，ITS2 区相差 7 个碱基，5.8S 区均为 164
200
G+C 含量(%)
56.2
56.1
55.8
54.0
53.7
54.3
56.4
56.8
总长度
568
568
568
576
576
576
568
568
ITS1
177
177
177
178
178
178
177
177
G
31.1
30.6
31.7
31.1
30.9
30.8
31.3
31.8
A
20.7
22.1
21.2
21.5
21.3
20.9
20.4
19.9
C
25.1
25.5
24.0
22.9
22.8
23.5
25.0
25.0
T
23.1
24.7
23.0
24.5
25.0
24.8
23.3
23.3
ITS2
227
227
227
234
234
234
227
227
5.8S
164
164
164
164
164
164
164
164
表 1 高良姜及其混淆品 ITS 序列长度和 G+C 的含量
居群序号
GL-1
GL-2
GL-3
GL-4
GL-5
GL-6
GL-7
GL-8
含量（%） 长度（dp）
图 2 高良姜与混淆品 ITS 序列对比
GL-1 ----C-----GAGA-GC AC-C-----C---C--GAT--A--CT-C- ----------------C-----------
GL-2 -----------G----GGCAA-------------------------T- ----------------C-----------
GL-3 ----C------G----GGCAG-------------------------T-- ---------------C------------
GL-4 -------------T- CTAAG-T-----T---T--A-G--G--TG-T-- ---------------T-----------
GL-5 -------------T--CTGGG-T-----T---T--A-G--G--TG-T-- ---------------T-----------
GL-6 -------------T--CTGGG-T-----T---T--A-G--G--TG-T-- ---------------T-----------
GL-7 ----------------GC AC-------------------------T-- ---------------C-----------
GL-8 ----------------GCAGC-------------------------T-- ---------------C-----------
ITS2 3′
GL-1 -- ------A----A----C---TG---------A-------A---------G----A---T---A---A---C--T---
GL-2 -- -----------A--------TG---------A-------G---------G----A--- -------T------A---
GL-3 -- -----------C--------TG---------A-------G---------G-------- --------------G---
GL-4 --TTG-------------------- ---------G-------G---------A ----T------C-------T------
GL-5 --TTG-----------C----G--- ---------G-------G---------A -----------C-------T------
GL-6 --TTG-------------------- ---------G-------G---------A -----------C-------T------
GL-7 -- -------T---C--------TG---------G-------G---------G---------------------------
GL-8 -- --------------------TG---------A-------G---------G---------------------------
ITS1 5.8S
5′
个碱基。 高良姜居群的 G+C含量平均为 56.26%，稍高
于混淆种的 54%。
在 5 个高良姜居群和 3 个混淆品大高良姜的
rDNA ITS序列中，5.8S 编码区的序列都很保守， 仅有
一个变异位点。 而在 ITS1 、ITS2区存在一定的居群差
异和种间差异，存在 32 个变异位点（含 5.8S 区），且多
为 A-G 间的颠换； 其中在 ITS1 区第 112~116 位点间
有 5 个碱基存在显著的个体差异； 在 ITS1 区大约 51
bp 处，GL-1、GL-3（均为广东高良姜）有 1 个碱基 C 的
插入；在大约 200 bp 处大高良姜（GL-4、GL-5、GL-6）
有 1个碱基 G的插入位点。 ITS2区有 2处插入和 1处
缺失位点，5处 T-C间的碱基颠换。 由此可见，ITS1 区
提供了更多的信息位点。
2.3.2 不同居群间的遗传差异及聚类分析 利用
MEGA2.0 的 Kimura-2 参数计算遗传距离（表 2）可知，
各居群间的遗传距离为 0.000～0.320，高良姜各居群间
的遗传距离在 0.000～0.231，总体平均值为 0.115，混淆
品大高良姜遗传距离在 0.003～0.320。 根据测序结果，
利用软件 DNAStar，采用 NJ 法构建系统发育树，见图
3。 不同居群的高良姜聚为 1 类，3 种混淆品大高良姜
GL-8GL-7
0
GL-6
0.06
0.08
GL-5
0.003
0.081
0.087
GL-4
0.006
0.002
0.081
0.086
GL-3
0.166
0.171
0.221
0.132
0.075
GL-2
0.148
0.172
0.168
0.32
0.231
0.084
GL-1
0.086
0.084
0.091
0.088
0.086
0.006
0.009
居群
序号
GL-1
GL-2
GL-3
GL-4
GL-5
GL-6
GL-7
GL-8
表 2 高良姜及其混淆品的遗传距离
201
聚为 1类。 其中广东高州、广西南宁、广东徐闻的高良
姜 ITS序列碱基数目相同，G+C含量几乎无差别，相对
遗传距离仅为 0.084～0.148，类群间变异较小；同属的
混淆品大高良姜聚为 1支， 其中 4号和 6号聚为 1 分
支， 海南的 5号聚为另 1类。 系统发育树显示高良姜
与混淆品大高良姜有着稳定的差异性， 这种差异性体
现在 ITS碱基序列的变异性。
3 结论与讨论
本研究通过对高良姜及其混淆品大高良姜的
rDNA ITS 序列比较分析发现，高良姜的 rDNA ITS 序
列与大高良姜的 rDNA ITS 序列明显不同， 高良姜
rDNA ITS序列总长为 568 bp,而大高良姜序列总长为
576 bp，二者存在 32个变异位点，同源性占 94.4%。除
了部分碱基替换外， 大高良姜碱基序列中还存在较多
的片段插入或缺失。 此外，二者碱基 G+C 百分含量也
有一定的差别。 说明高良姜与大高良姜有一定的亲缘
关系，但又不属于同一种植物类群，系统发育分析也表
明高良姜与大高良姜各属于不同的分支。 因此有些地
方把大高良姜当作高良姜来出售或者使用， 或者按形
态特征把它们分为大、中、小高良姜的作法都是不正确
的。
高良姜与大高良姜不但在形态上已演化成两个不
同的类群，也有研究表明二者在药理作用、化学成分也
不尽相同 [6-7]。 广东徐闻良姜以品质优良闻名天下，云
南、广西良姜不能与之相比，系统树分析也表明徐闻良
姜与其它类群高良姜有遗传差异， 同时也有可能与当
地的地理环境和气候有一定的关系， 这还有待于作进
一步的研究。
本研究通过对不同产地的高良姜及其两种混淆品
大高良姜的 rDNAITS 序列比较和分析，在分子水平上
找到了高良姜和混淆品大高良姜序列变异位点， 这些
位点不仅可以作为鉴别高良姜道地品种和混淆品的分
子标记，而且为以后的 DNA条形码的建立提供初步的
数据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会 ．中国药典（I 部）[M]．北京：化学工业出版
社，2005：202.
[2] 陈湖海，王鹏．高良姜的化学成分及药理活性研究进展[J]．药
学实践杂志，2004，22(6)：327.
[3] 高海生，李春华，蔡金星，等．天然果蔬保鲜剂研究进展[J]．中
国食品学报，2003，3(1)：86.
[4] 谢小梅，龙凯，钟裔荣，等 ．高良姜、草果防霉作用的实验研
究[J]．药物研究，2002，11(5)：45.
[5] 牛宪立，姬可平，吕国庆．白木香 rDNA ITS 序列测序鉴定的
初步研究[J]．广东农业科学，2010（2）：167-169.
[6] 詹若挺，黄海波，潘超美，等．高良姜种植基地不同栽培类型
的品种调查和形态比较研究[J]．现代中医研究与实践，2007,
22（2）：3-6.
[7] 吕玮，蒋伶活．高良姜的化学成分及药理作用[J].药学专论，
2006，15（3）：19-21.
GL-2-GRS7854＿P2
GL-3-06060453xian
GL-1-GRS7855T-
GL-8-#1333
GL-7-#1222
GL-4-GRS8216Sep
GL-6-Sep#1111
GL-5-GRS7856T-9＿
图 3 基于 rDNAITS 序列的高良姜及其混淆品的系统发育树
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“一种清除土壤铝毒害的植物修复方法”获国家发明专利
近日，由华南植物园夏汉平研究员等完成的“一种清除土
壤铝毒害的植物修复方法”获得国家发明专利授权(专利号: ZL
200710035750.2)。
在我国广大的南方红壤地区，由于高温多雨导致的酸性淋
溶，使得土壤中活性铝含量明显偏高，结果对森林生态系统和
农作物都产生很大毒害。 近些年，随着工业的发展和农业化肥
的大量使用，以及酸雨的日趋增加，土壤的酸化程度随之加重，
土壤中铝离子的溶量也大幅增加，特别是在我国大面积的酸性
土壤中，铝离子的溶出量更大，结果导致了植物铝毒害的加剧。
但目前国内外尚未见到有关清除土壤铝毒害的技术或有效方
法。
该发明涉及土壤污染修复，即一种清除土壤铝毒害的植物
修复方法，其特征在于，选择对土壤活性铝具有强吸收能力的
百喜草 (Paspalum notatum Flugge)，种子或种苗均可，以种苗为
佳。
该发明的优点是：一是百喜草对土壤 Al 的吸收能力强，当
土壤中的活性铝浓度为 1~2g/kg 左右时，百喜草根、茎、叶中的
Al 含量分别高达 7~13、2~6、3~4g/kg 左右， 呈现明显的富集趋
势；二是百喜草目前在我国南方多个省区广泛引种栽培，用于
水土保持和用作牧草，种源易得，而且其生物量大，易种植，易
成活，易管理，因此是一种非常理想的可用于清除土壤铝毒害
的植物。
202