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短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制



全 文 :分子植物育种,2015年,第 13卷,第 10期,第 2380-2387页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.10, 2380-2387
技术主题
Technology Feature
短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制
盛璐 杨迎杰 季孔庶 *
南京林业大学南方现代林业协同创新中心,南京, 210037
*通讯作者, ksji@njfu.edu.cn
摘 要 本研究在正交设计的基础上,以短柱铁线莲的叶片、叶柄、茎段为外植体,进行愈伤组织培养,并
探讨愈伤组织褐化的抑制。研究结果表明:短柱铁线莲诱导愈伤组织的适宜外植体为茎段,诱导率为
89.8%;合适的愈伤诱导培养基为 1/2MS+0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+10 g/L蔗糖,诱导率为 90%;合适
的增殖培养基为 1/2MS+30 g/L蔗糖+0.2 g/L肌醇+0.2 g/L水解络蛋白(CH)+5 mg/LVc+0.3 mg/L TDZ+0.2 mg/L
NAA,增殖率为 302.3%。适宜不定芽诱导培养基为 1/2MS+30 g/L蔗糖+0.76%琼脂+0.2 g/L肌醇+0.2 g/L
水解络蛋白(CH)+0.3 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA,诱导率达 63.3%。培养基中添加 5 mg/L Vc或 1 g/L活性炭
时,可以能够很好地抑制短柱铁线莲褐化。
关键词 短柱铁线莲,愈伤组织,组织培养,褐化
Callus Induction and Browning Inhibition of Clematis cadmia
Sheng Lu Yang Yingjie Ji Kongshu *
Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding author, ksji@njfu.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002380
Abstract In this research, based on orthogonal experimental design, leaves, petiole and stem of Clematis cadmia
Buch.-Ham. ex Wall were used as explants for callus culture. Results indicate that the optimal explants were stem
of C. cadmia, and callus induction rate was 89.8% ; the optimal callus induction medium for C. cadmia was
1/2MS+10 g/L Sucrose +0.4 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA, and callus induction rate was 90% ; the appropriate
medium for subculture callus of C. cadmia was 1/2MS+30 g/L Sucrose+0.2 g/L Inositol+0.2 g/L CH+5 mg/L Vc+
0.3 mg/L TDZ+ 0.2 mg/L NAA, proliferation rate was 302.3%; the optimal medium for callus adventitious buds
differentiation of C. cadmia was 1/2MS+30 g/L Sucrose+0.76% AGAR+0.2 g/L Inositol+0.2 g/L CH+0.3 mg/L
TDZ+0.1 mg/L NAA, inductive rate was 63.3%. Adding 5 mg/L Vc or 1 g/L Acticarbon in culture medium may
inhibit callus darkening effectively.
Keywords Clematis cadmia, Callus, Induction Browning
基金项目:本研究由江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)和南方现代林业协同创新项目共同资助
短柱铁线莲(Clematis cadmia Buch.-Ham. exWall)
属于毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis L.)欧
洲铁线莲亚属(subgen. Clematis)多年生草本植物,花
色为淡紫色或淡白色,主要分布于江西北部、安徽南
部、浙江北部以及江苏南部等地区。短柱铁线莲喜阴
湿环境,具有较高的观赏价值,可以广泛的应用于园
林绿化中(王文采和李良千, 2005)。铁线莲属的许多
植物存在结实率低、种子萌发时间较长、发芽率不高
等多种问题,而组织培养不受季节限制,培养周期短,能
短时间大量繁殖,是铁线莲属植物繁殖的新途径。
短柱铁线莲具有耐水湿、抗逆性强、观赏周期
长,且是铁线莲属中少有的香花植物,具有很高的开
发利用潜力,但其种子及扦插繁殖率都较低,因而利
用组织培养技术提高短柱铁线莲的繁殖速度及规模
具有重要的现实意义。另外,短柱铁线莲不仅可以作
为良好的垂直绿化材料广泛应用于城市绿化建设
中,且能够对研究铁线莲资源的保护及开发利用提
供一定的基础材料。目前,有多种铁线莲属植物进行
图 1不同材料诱导愈伤情况
注: A:叶柄诱导愈伤; B:茎段诱导愈伤; C:叶片诱导愈伤
Figure 1 Callus induction with different materials
Note: A: Callus induction with petiole; B: Callus induction with
stem; C: Callus induction with leaf
了组织培养。在野生种方面,东北铁线莲、褐毛铁线
莲、重瓣铁线莲、天台铁线莲、毛蕊铁线莲等都建立
的组织培养体系(成璐, 2014;张鸽香和武珊珊, 2010),
观赏园艺种方面,铁线莲‘Multi-Blue’、铁线莲‘茱莉
亚’、铁线莲‘Gipsy Queen’等都建立组织培养体系
(张启香等, 2010;吴荣等, 2014),短柱铁线莲仅王辉
利用带芽茎段和莲尖诱导不定芽并建立起离体再生
体系,但未见其愈伤组织方面的研究报道(王辉, 2012)。
本研究在正交试验设计的基础上,以短柱铁线
莲叶片、叶柄、茎段为材料,对不同条件对愈伤组织
诱导和不定芽分化的影响以及在增殖培养中的褐化
抑制进行了探讨,旨在为铁线莲属植物的快繁提供
一定的技术支持。
1结果与分析
1.1外植体、灭菌时间及基本培养基的筛选
短柱铁线莲的叶片、叶柄、茎段在不同培养基上
都可以产生愈伤组织。3种外植体相比,茎段在不同
的处理中,诱导率最高,愈伤产生快,乳白色,为颗粒
状(图 1B)。而叶片,叶柄诱导的愈伤,表面质地较坚
硬,为淡黄色(图 1A;图 1C)。外植体的灭菌时间越
长,虽然污染率降低,但褐化严重,死亡率较高。当灭
菌时间为 7 min时,3种外植体的枯死率都较高,以
叶片为外植体的枯死率高达 90.2% (表 1处理 7)。叶
柄和茎段的灭菌时间为 5 min比较适宜,而叶片由于
较鲜嫩,灭菌 3 min最为适宜。诱导率较高的分别为
处理 3和处理 6,均为茎段的诱导。因此,短柱铁线莲
的茎段为愈伤组织诱导的合适外植体,合理灭菌时
间为 5 min,适宜愈伤组织诱导基本培养基为 1/2MS,
诱导率为 89.8% (表 1处理 6)。
1.2 不同浓度激素及蔗糖配比对短柱铁线莲愈伤诱
导培养的影响
将茎段作为外植体接种于添加不同浓度激素及
蔗糖的培养基上。4~8 d后,切口及两端开始膨大,经
过一段时间,形成黄色愈伤组织。培养 30 d,统计诱
导情况。结果发现当 TDZ和 NAA浓度都比较低的
时候,诱导率为 0 (表 2处理 1,处理 2)。TDZ浓度升
高,愈伤化明显,诱导率也明显提高,TDZ浓度超过
0.4 mg/L时,所形成的愈伤变得表面干燥较硬、致密,
并且褐化率也显著增高,诱导率也降低。同时,诱导
率也随着 NAA浓度的增大而先升高,当 NAA浓度
超过一定程度,愈伤褐化严重。当 TDZ为 0.4 mg/L,
NAA为 0.2mg/L时(表 2处理 11),诱导率最高为 90%。
外植体愈伤化比较完全,愈伤组织质地较软,表面较
湿润,稍显透明,且体积较大,生长较快,为淡黄色或
乳白色。而处理 12,TDZ为 0.4mg/L,NAA为 0.4mg/L
时,诱导率为 80%,外植体愈伤生长也较快,量也较
都多,但出现愈伤组织表面干燥,颗粒状较明显,颜
色发黄,愈伤质地较差。对 TDZ、NAA和蔗糖浓度对
愈伤诱导的影响进行方差分析发现(表 3),不同浓度
的 TDZ对愈伤组织诱导的影响是极显著的,同时发
现不同浓度水平 TDZ、NAA对短柱铁线莲增殖有显
著影响,而蔗糖的影响不大。综上所述,适合短柱铁
线莲愈伤诱导培养基为 1/2MS+10 g/L蔗糖+0.4 mg/L
TDZ+0.2 mg/L NAA。
1.3不同浓度激素组合对短柱铁线莲增殖培养的影响
选择生长良好的愈伤进行增殖培养。当 TDZ和
NAA浓度升高时,短柱铁线莲愈伤组织增殖率增加,
最高为 324.7% (表 4处理 6),但同时发现 TDZ浓度
过高时,愈伤组织发生严重的褐化。方差分析表明
(表5),影响愈伤组织增殖的最大影响因子为 TDZ。同
时 TDZ和 NAA都对愈伤组织增殖影响都达到了极
显著水平。因此,适宜的增殖培养基为 1/2MS培养
基+30 g/L 蔗糖+0.2 g/L 肌醇+0.2 g/L 水解络蛋白
(CH)+5 mg/L Vc+0.3 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA,增
殖率为 302.3%。
1.4 不同植物生长调节剂对短柱铁线莲不定芽诱导
的影响
短柱铁线莲愈伤组织在添加不同激素的培养基
中不定芽诱导率存在差异。TDZ和 NAA浓度增加
时,不定芽的诱导率也相应增加,当 TDZ和 NAA的
浓度分别为 0.3 mg/L和 0.1 mg/L时,不定芽诱导率
短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制
Callus Induction and Browning Inhibition of Clematis cadmia 2381
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1外植体、灭菌时间及基本培养基的筛选
Table 1 Screening explant, sterilization time and minimal medium
培养基编号
No. of medium
1
2
3
4
5
6
7
8
9
灭菌时间(min)
Disinfection (min)
3
3
3
5
5
5
7
7
7
外植体
Explant
叶片
Leaf
叶柄
Petiole
茎段
Stem
叶片
Leaf
叶柄
Petiole
茎段
Stem
叶片
Leaf
叶柄
Petiole
茎段
Stem
培养基
Medium
改良 1/2MS
Reformed 1/2MS
1/2MS
MS
MS
改良 1/2MS
Reformed 1/2MS
1/2MS
1/2MS
MS
改良 1/2MS
Reformed 1/2MS
污染率(%)
Contaminations rate (%)
10.2
24
33.3
5.4
6.7
4.5
0
1.3
0
枯死率(%)
Dead rate (%)
13.3
11.2
5.6
30
50.7
18.3
90.2
76.7
66.4
诱导率(%)
Callus induction rate (%)
56.3
66.2
86.7
35.6
18.7
89.8
6.7
23.3
56.5
注:污染率(%)=被污染的外植体数/接种的外植体总数×100%;枯死率(%)=枯死的外植体数/接种的外植体总数×100%;诱导率(%)=
产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%
Note: Contaminations rate (%)=Explant contaminated/Total explant number×100%; Dead rate (%)=Explant dead/Total explant number×
100%; Callus inductionrate (%)=Explant appeared calli/Total explant number×100%
因子
Factor
表 2 TDZ、NAA、蔗糖不同浓度组合对愈伤诱导的影响
Table 2 The influence of TDZ, NAA, sucrose on embryo callus induction
培养基编号
No. of mediums
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TDZ (mg/L)
0.05
0.05
0.05
0.05
0.20
0.20
0.20
0.20
0.40
0.40
0.40
0.40
0.60
0.60
0.60
0.60
NAA (mg/L)
0.03
0.08
0.20
0.40
0.03
0.08
0.20
0.40
0.03
0.08
0.20
0.40
0.03
0.08
0.20
0.40
蔗糖(g/L)
Sucrose (g/L)
10
20
30
40
20
10
40
30
30
40
10
20
40
30
20
10
接种数
No. of induction
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
诱导率(%)
Induction rate (%)
0
0
16.70
23.33
23.30
36.70
46.70
56.70
66.70
66.70
90.00
80.00
66.70
66.70
83.30
86.70
因子种类
Factor
2382
短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制
Callus Induction and Browning Inhibition of Clematis cadmia
表 3 TDZ、NAA和蔗糖浓度对愈伤诱导的影响方差分析
Table 3 Variance analysis of TDZ, NAA and sucrose to embryo callus induction
变异来源
Source of variation
TDZ
NAA
蔗糖
Sucrose
误差
Error
平方和
Squares
12 071.729
1 568.330
97.740
92.738
自由度
Degree of freedom
3
3
3
6
均方
Mean squares
4 023.910
522.777
32.580
15.456
F
260.340
33.823
2.108
Sig
0
0
0.201
表 4 TDZ、NAA对短柱铁线莲愈伤增殖的影响
Table 4 The influence of TDZ, NAA on embryo callus induction of C. cadmia Buch
处理
Treatment
1
2
3
4
5
6
TDZ
0.2
0.3
0.6
0.2
0.3
0.6
NAA
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
0.2
接种鲜重(g)
Inoculation fresh weight (g)
4.75
4.63
5.01
4.82
4.68
4.74
收获鲜重(g)
Harvest fresh weight (g)
7.25
8.98
13.98
9.07
14.15
15.4
增殖率(%)
Proliferation rate (%)
152.6
193.5
279
188.2
302.3
324.7
激素
Hormone
表 5 TDZ、NAA对短柱铁线莲愈伤增殖方差分析
Table 5 Variance analysis of TDZ, NAA on embryo callus induction of C. cadmia Buch
变异来源
Source of variation
TDZ
NAA
TDZ*NAA
误差
Error
平方和
Squares
51 846.408
188.612
62.752
21.928
自由度
Degree of freedom
2
1
2
12
均方
Mean squares
257.519
62.871
20.717
7.309
F
35.233
8.601
2.834
Sig
0.004
0.043
0.082
表 6不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导不定芽的影响
Table 6 The effect of different plant growth regulators on inducing adventitious buds from the callus
处理
Treatment
1
2
3
4
TDZ (mg/L)
0.1
0.1
0.3
0.5
NAA (mg/L)
0.05
0.1
0.1
0.2
外植体个数
Browning
30
30
30
30
诱导率(%)
Induction (%)
20
30
63.3
56.7
生长状况
Growth status
+
++
++++
+++
激素
Hormone
最高为 63.3% (表 6处理 3)。TDZ的浓度过大时,诱
导出来的不定芽会出现畸形芽。同时发现,愈伤组织
的培养时间长短,影响不定芽的诱导率(图 2),培养
60 d的愈伤组织诱导的不定芽数是培养 30 d的愈伤
组织的 3倍。适宜不定芽诱导培养基为 1/2MS+30 g/L
蔗糖+0.76%琼脂+0.2 g/L肌醇+0.2 g/L水解络蛋白
(CH)+0.3 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。
1.5 Vc和活性炭对短柱铁线莲愈伤褐化的影响
在铁线莲进行组培时,特别是铁线莲增殖培养
过程中,会出现比较严重的褐化现象,影响铁线莲的
正常的生长和分化,甚至出现死亡。采用一定的抗氧
2383
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 3G),不仅褐化率,褐变度低,而且生长较快。当活
性炭浓度再增加时,愈伤生长变的缓慢,也易出现畸
形。因此,当 Vc浓度为 5 mg/L或活性炭浓度为 1 g/L
时,不仅能够很好地抑制褐化,且愈伤生长较快,质
量也较好。
2讨论
一般认为,外植体细胞分裂能力最强的部位愈
伤诱导得较好,如种子、下胚轴及幼嫩的子叶、茎尖
很容易诱导出愈伤组织,这与外植体的遗传因素、本
身的生理状态有关。材料的基因型对愈伤组织器官
分化起决定作用,不同物种的外植体诱导的愈伤组
织分化能力明显不同,甚至发现同属的不同种或同
一种不同品种间的愈伤组织分化能力也不相同(王辉,
2012;伊书亮等, 2013)。短柱铁线莲愈伤组织诱导研
究中发现,叶柄、叶片和茎段、都能发现产生了愈伤
组织,但愈伤形成的时间、愈伤的褐化程度、以及愈
伤生长量却不尽相同。叶片和叶柄产生愈伤的时间
远长与茎段,且茎段产生的愈伤不仅量大,状态也较
好。叶片诱导率低,出愈时间长,可能因为叶片表面
积大,消毒剂对叶片伤害较大;另一方面叶片比茎段
较为分化,不利于愈伤诱导。李琰等(2008)在雷公藤
愈伤组织诱导中发现,幼嫩茎段易诱导出愈伤。对于
藤本植物铁线莲来说,当年生幼嫩茎段是诱导愈伤
组织较为适合的外植体。在植物组织培养中,同一植
图 2愈伤组织不定芽的分化
Figure 2 Adventitiou buds from callus
表 7 Vc、活性炭对短柱铁线莲愈伤增殖褐化的影响
Table 7 The influence of callus browning of C. cadmia Buch with Vc and activated carbon
处理
Treatmeant
CK
Vc (2 mg/L)
Vc (5 mg/L)
Vc (8 mg/L)
Vc (10 mg/L)
活性炭(0.5 g/L)
Activated carbon (0.5 g/L)
活性炭(1 g/L)
Activated carbon (1 g/L)
活性炭(2 g/L)
Activated carbon (2 g/L)
接种数
Explants
30
30
30
30
30
30
30
30
褐化率(%)
Browning rate (%)
60.0
45.0
30.0
20.0
10.0
35.0
15.0
10.0
褐变度
Degree of browning
++++
++
+
+
+
++
+
+
生长状况
Growth status
褐化严重,生长慢
Browning seriously, growing slowly
褐化减轻
Mitigation of browning
生长较快
Growing fast
较好
Growing well
部分畸形
Partial deformity
较好
Growing well
生长快
Growing fast
生长慢
Growing slowly
化剂是防止褐化的有效措施。基本培养基为前文筛
选出的最适诱导培养基,以铁线莲的当年生茎段为
外植体,探讨不同浓度的 2种抗氧化剂对短柱铁线
莲褐化抑制效果。
随着 Vc和活性炭浓度的增加,褐化程度减少,
当 Vc达到 5 mg/L (表 7;图 3C),不仅生长较快,褐
变程度较低,褐化率为 30%与 CK (60%)相比,降低
了 50%。当 Vc浓度再在增加时,褐化率较低,但愈伤
生长变得缓慢。活性炭与之相同,当浓度为 1 g/L (表 7;
2384
图 3不同添加物对愈伤褐化的影响
注: A: CK; B: Vc (2 mg/L); C: Vc (5 mg/L); D: Vc (8 mg/L); E:
Vc (10 mg/L); F:活性炭(0.5 g/L); G:活性炭(1 g/L); H:活性炭
(2 g/L)
Figure 3 Influence of different additives to callus browning
Note: A: CK; B: Vc (2 mg/L); C: Vc (5 mg/L); D: Vc (8 mg/L);
E: Vc (10 mg/L); F: Activated carbon (0.5 g/L); G: Activated car-
bon (1 g/L); H: Activated carbon (2 g/L)
物,不同的外植体、不同的采样时间等,对组织培养
的影响也不同,因为合适的外植体是组织培养成功
的基础。在本研究中,根据不同外植体产生愈伤组
织的能力及生长状态来判断,铁线莲幼嫩茎椴 >叶
片>叶柄。
在组织培养中,生长素类物质如 2,4-D、NAA等
的显著作用是诱导外植体产生愈伤组织及促进愈伤
组织的延伸生长;细胞分裂素如 6-BA、TDZ、KT的
主要作用是促进细胞的分裂和分化以及延缓组织的
衰老。在愈伤组织诱导及增殖过程中,加入适当浓度
的生长素和细胞分裂素是必需的。研究发现,一般较
高浓度的生长素和较低细胞分裂素更有利于愈伤的
诱导和生长(唐建军等, 2002)。本研究发现诱导铁线
莲茎段产生愈伤时,TDZ对短柱铁线莲愈伤组织诱
导都有极显著的影响。单独使用 TDZ诱导短柱铁线
莲愈伤时,高浓度或低浓度的 TDZ都不适合愈伤诱
导,TDZ浓度太低,诱导不出愈伤或愈伤率很低,浓
度太高,出愈率降低且愈伤松散易褐化,但当 TDZ
与 NAA结合时,短柱铁线莲出愈率及愈伤状态方面
都很好,且有效地缩短了愈伤组织诱导的时间,并提
高了愈伤组织的数量,可能是因为两种激素的协同
作用。而只用 NAA诱导出的愈伤组织颜色较暗,在
继代过程中生长较慢,容易褐化,同时说明了在愈伤
组织的诱导中,细胞分裂素是必不可缺的。对于大部
分植物来说,适当比例的细胞分裂素与生长素是诱
导胚性愈伤发生的关键。
组培过程中的褐变(Browing)主要是由于细胞受
胁迫等引起的死亡,或酚类参与酶促褐化所致。通常
引起褐化的酶有多种,如苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化
酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等。而温度过高使 PPO
的活性提高,从而加速培养的组织褐化。影响褐变的
因素是及其复杂的,植物的种类及其基因型,植物材
料及生理状况,培养基的成分(无机盐,蔗糖浓度,植
物生长调节剂等),培养条件(温度,光照等)都可能对
褐变产生影响(冯代弟等, 2015)。本研究中,添加不同
浓度的 Vc和活性炭均能有效地抑制铁线莲愈伤增
殖过程中的褐化,其中当 Vc浓度达到 5 mg/L时,能
有效地抑制褐化,但随着浓度的增加抑制褐化的效
果开始下降,且部分愈伤生长较慢。与加入 5 mg/L
Vc相比,加入活性炭 1 g/L的培养基中愈伤长势也
好,但愈伤生长速度较快。当活性炭的再增加时,愈
伤出现生长缓慢且长势较差,甚至出现畸形,究其原
因可能由于活性炭吸附一部分培养基内的营养物
质。经过比较,添加不同浓度的 Vc和活性炭与 CK
相比,均能降低褐化。
本研究中,利用短柱铁线莲外植体诱导出的愈
伤组织,成功地通过间接发生的方式从愈伤组织获
得了嫩黄或嫩绿色不定芽。但不定芽的增殖生长还
有待于研究,进一步提高繁殖效率的体胚发生诱导
仍需继续试验,同时还未进行短柱铁线莲的生根诱
导,以及建立完善的短柱铁线莲再生植株体系,这些
均有待进一步的研究。
短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制
Callus Induction and Browning Inhibition of Clematis cadmia 2385
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3材料与方法
3.1材料
试验材料短柱铁线莲(Clematis cadmia)源自江苏
省南京市,种植于南京林业大学生物技术大楼 7楼
温室。以当年生幼嫩叶片、叶柄、茎段作为外植体。
采用当年生植株生长健壮,叶片为新发不久且具有
母本的优良性状的。所需试验器材:高温高压灭菌
锅 (Hirayama)、恒温培养箱 (Binder)、摇床 (IKA KS
4000)、接种器具灭菌器、超净工作台(ESCO)等。蔗
糖、琼脂、6-BA、NAA、TDZ、活性炭等均购自南京博
巧有限公司。
3.2方法
3.2.1外植体消毒
剪取短柱铁线莲当年生,生长健壮,性状优良的
幼嫩叶片、叶柄、茎段,用酒精棉将外植体上的绒毛
擦去,后浸泡于洗洁精中 15 min,用流水冲洗 1~2 h。
在超净工作台中,将外植体置于 75%乙醇溶液中浸
泡 30 s,取出后用无菌水冲洗 4~5次,再用 0.1%升汞
分别灭菌 3 min、5 min、7 min后无菌水冲洗 5次。后
置于培养皿中,先用无菌滤纸吸取多余水分,切除伤
口。茎段、叶柄剪切成 0.5~1.0 cm长,叶片剪成 1 cm2,
将处理好的外植体接种到不同配方的培养基中。
3.2.2外植体、灭菌时间、基本培养基
试验采用外植体、灭菌时间、培养基进行 L9(34)正
交设计共设 9个处理(表 1)。基本培养基(MS, 1/2MS)均
附加 30 g/L蔗糖,7.6 g/L琼脂,2.0mg/L6-BA,0.1mg/L
NAA。每瓶培养基接种 3个外植体,每种处理接种
10瓶,3次重复。pH值为 5.8,培养温度 25℃左右,培养
15 d后,统计污染率、枯死率和诱导率。
3.2.3愈伤组织诱导培养
将短柱铁线莲的茎段作为外植体,以 1/2MS为
基本培养基,采用 TDZ、NAA和蔗糖进行 L16(45)正交
设计共设 16个处理(表 2)。每个处理共 30瓶,3次重
复。25℃光照下进行诱导愈伤培养基的优化筛选,接
种 30 d后统计数据。
3.2.4愈伤组织增殖培养
将短柱铁线莲生长良好的愈伤组织为材料进行
增殖培养试验,采用 1/2MS培养基,添加 30 g/L蔗
糖、0.2 g/L肌醇、0.2 g/L水解络蛋白(CH)、5 mg/L Vc,
调节至 pH 5.8为本次继代培养的基础培养基。加入
不同溶度的(0.2 mg/L, 0.3 mg/L, 0.6 mg/L) TDZ 和
(0.1, 0.2) NAA,共设 6个处理(表 2)。每个处理 10瓶,3
次重复。25℃光照下,培养 30 d后,统计增殖系数。
3.2.5不定芽诱导
将经2次继代培养以后得到的生长势较好的淡
黄色疏松的愈伤组织接种在分化培养基上诱导不定
芽,不定芽诱导培养基为 1/2MS+30 g/L蔗糖+0.76%
琼脂+0.2 g/L肌醇+0.2 g/L水解络蛋白(CH),pH值为
5.8,添加不同浓度 TDZ (0.1 mg/L, 0.2 mg/L, 0.5 mg/L)、
NAA (0.05 mg/L, 0.1 mg/L, 0.2 mg/L),共设 4个处理。
每个处理 10瓶,3次重复。25℃光照下,培养 30 d后
观察并统计不定芽的诱导情况。
作者贡献
盛璐、杨迎杰和季孔庶是本研究的实验设计和
试验研究的执行人;盛璐和杨迎杰完成数据分析,试
验结果分析和论文初稿写作;季孔庶是本项目的构
思者及负责人,指导实验设计,数据分析,论文写作
与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏高校优势学科建设工程项目
(PAPD)和南方现代林业协同创新项目共同资助。感
谢常州市新北区市政绿化管理所俞良亮在铁线莲资
源收集方面提供的帮助。
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短柱铁线莲愈伤组织培养及褐化抑制
Callus Induction and Browning Inhibition of Clematis cadmia
《基因组学与应用生物学》征订启事
《基因组学与应用生物学》是由广西大学主管和主办,公开发行的月刊科学期刊。《基因组学与应用生物
学》主要刊登现代生物技术的前沿学科和基础学科如基因组学、分子细胞遗传学、生化与分子生物学和应用
生物学等相关的原始研究成果。刊登植物、动物及微生物领域的生物在组织、器官、细胞、染色体、蛋白质、基
因、酶和发酵工程等不同水平上的现代生物技术等基础与应用基础研究的成果。本刊按国际标准编排,题目
摘要、图表和引用文献等均实行中英文对照。
《基因组学与应用生物学》,前身是原《广西农业大学学报》,创刊于 1982年。《基因组学与应用生物学》
(原名《广西农业生物科学》)入编了 2015年版北大图书馆《中文核心期刊要目总览》核心期刊,是中国科学引
文数据“中国期刊方阵”,先后被国际知名检索系统——英国国际农业与生物科学研究中心(CABI)、美国《化
学文摘》(CA: JYYSAZ)、美国《剑桥科学文摘:自然科学》(CSA:NS)、英国《动物学记录》(ZR)和俄罗斯《文摘杂
志》(AJ)等收录。
《基因组学与应用生物学》(Genomics and Applied Biology),ISSN1674-568X,CN45-1369/Q,邮发代号:
48-213;月刊,每月 25日出版,国内定价:¥40.00/期,¥480.00/年;国际定价:$40.00/期,$480.00/年。
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