全 文 ：　第 22卷　第 8期 医 学研 究 生学 报 Vol.22　No.8
　2009年 8月 JournalofMedicalPostgraduates Aug.2009
·论　　著·
高效液相色谱指纹图谱在
驱虫斑鸠菊不同提取工艺对比研究中的应用
刘晓东 1 , 　闫　明2 , 　霍仕霞 1 , 　张兰兰 1
(1.石河子大学药学院 ,新疆石河子 832003;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 ,新疆乌鲁
木齐 830049)
摘要:　目的:驱虫斑鸠菊是治疗白癜风的常用药材 ,其化学成分复杂 。文中建立并优化驱虫斑鸠菊高效液相色
谱指纹图谱(HPLC-FP)的色谱条件 ,并在此基础上进行不同提取工艺的对比研究。 　方法:通过保留时间及各共
有峰的相对峰面积建立并优化分析驱虫斑鸠菊组分的高效液相色谱指纹图谱(HPLC-FP), 进行不同提取工艺的
对比研究。 　结果:建立了驱虫斑鸠菊最优的 HPLC-FP分离条件 , 得到 19个指纹图谱共有峰 ,经对比得知驱虫
斑鸠菊 85%乙醇提取物与半仿生提取物的指纹图谱比较相似 , 而与驱虫斑鸠菊水提物指纹图谱差异较大 , 其中
1、4、6、 11、12、14、16 ～ 19峰为驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取物及驱虫斑鸠菊半仿生提取物的高效液相色谱指纹图谱
特有峰 , 而 20 ～ 30峰则为驱虫斑鸠菊水提取物的高效液相色谱指纹图谱特有峰。 　结论:实验为驱虫斑鸠菊入
血成分 、制剂工艺及药效学研究提供实验依据。
关键词:　驱虫斑鸠菊;　高效液相色谱;　指纹图谱;　工艺对比
中图分类号:　R-331　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1008-8199(2009)08-0794-05＊
Highperformanceliquidchromatographyappliedtothecomparativestudy
ofthefingerprintsfordifferentextractsofVernoniaanthelmintica(L.)Wild
LIUXiao-dong1 , YANMing2 , HUOShi-xia1 , ZHANGLan-lan1
(1.PharmacyColegeofShiheziUniversity, Shihezi832003, Xinjiang, China;2.XinjiangInstituteof
TraditionalUighurMedicine, Urumqi830049, Xinjiang, China)
Abstract:　Objective:Vernoniaanthelmintica, withcomplicatedcomponents, isacommonmedicinefor
thetreatmentofvitiligo.Thepurposeofthisstudywastoestablishandoptimizetheseparationconditions
ofhighperformanceliquidchromatographyfingerprints(HPLC-FPs)forVernoniaanthelmintica(L.)
Wild.　Methods:WeinvestigatedtheHPLC-FPsofdiferentextractionsamplesbytheretentiontimes
andrelativeareasofcommonpeaksinthefingerprints.　Results:Weestablishedtheoptimumseparation
conditionsofHPLC-FPsforVernoniaanthelmintica(L.)Wild, andobtained19 commonpeaksinthe
fingerprints.TheHPLC-FPsofthe85% ethanolextractwerequitesimilartothoseofthesemi-bionicex-
tract(SBE)butverydiferentfromthoseofthewaterextractofVernoniaanthelmintica(L.)Wild.The
No.1, 4, 6, 11, 12, 14and16-19peaksweretheendemiconesoftheHPLC-FPsofthe85%ethanol
extractandSBEofVernoniaanthelmintica(L.)Wild, whileNo.20-30 weretheendemicpeaksofthe
HPLC-FPsofthewaterextract.　Conclusion:Theresultsofourstudyhasprovidedexperimentalevi-
denceforfurtherinvestigationintotheconstituentsabsorbedintoblood, pharmaceuticaltechnologyand
pharmacodynamicsofVernoniaanthelmintica(L.)Wild.
·794·
＊ 收稿日期:　2008-11-13;　修订日期:　2009-01-22
基金项目:　国家科技支撑计划基金资助项目(批准号:2007BAI30B01, 2007BAI48B06)
作者简介:　刘晓东(1980-),男 ,河南商丘人 ,医学硕士研究生 ,从事药学研究专业。
通讯作者:　闫　明(1959-),男 ,山西原平人 ,研究员 ,医学硕士 ,从事药学专业。 E-mail:yanming21cn@sohu.com
DOI :10.16571/j.cnki.1008-8199.2009.08.004
Keywords:　Vernoniaanthelmintica(L.)Wild;　Highperformanceliquidchromatography;　Fin-
gerprint;　Processcomparison
0　引　　言
　　驱虫斑鸠菊 [ Vernoniaanthelmintica(L.)Wild]
为菊科斑鸠菊属一年生草本植物。别名印度山茴香
(《中国植物志》)、艾特日拉力(维吾尔语)。始载于
《中国植物志》, 《维吾尔药材标准》和《维吾尔药志》
(上册)亦有记载。新疆和田 、阿克苏 ,云南西部有栽
培 ,印度 、巴基斯坦等国亦有种植 ,为新疆维吾尔医治
疗白癜风的常用药材 [ 1] ,具有激活酪氨酸酶活性作
用 ,增加皮肤光敏 ,改善白癜风病灶部位皮肤微循环 ,
并具有免疫调节及补充微量元素等功能。还可清除
异常粘液质 ,具有驱虫 、消肿 、散寒止痛等作用。常用
于治疗湿寒性胃痛 、肝病 、白癜风等病症 ,治疗白癜风
有突出的疗效。现代药理学研究表明 ,其对白癜风的
治疗可能经多途径 、多靶点发挥作用。
　　驱虫斑鸠菊的化学成分复杂 ,性质各异 ,有报道
从驱虫斑鸠菊中分离得到 3个黄酮类化合物 ,分别
为 2 , 3, 4, 4 -tetrahydroxychalcone, 5, 6, 7, 4 -tetra-
hydroxyflavone和紫铆素 ,药效学研究显示有很好的
抗白癜风的活性 [ 2] 。黄酮类成分可能是其发挥药
理作用的活性成分 ,但许多其他成分是否具有抗白
癜风的活性尚不明确 。因此 ,本研究以驱虫斑鸠菊
为对象 ,建立并优化分析驱虫斑鸠菊组分的高效液
相色谱指纹图谱(highperformanceliquidchromatog-
raphyfingerprint, HPLC-FP)的实验条件 ,得到尽可能
多的指纹峰 ,并在此基础上进行不同提取工艺的对
比研究 ,以考察驱虫斑鸠菊不同提取部位的高效液
相色谱指纹图谱的异同 ,补充文献报道之不足 ,并为
以后驱虫斑鸠菊制剂工艺及药效学研究提供实验依
据 。
1　材料和方法
1.1　仪器与试剂　美国 Waters1525二元泵高效液
相色谱仪 , Waters2996二极管阵列检测器 , Empower
数据采集系统;Mili-Q超纯水纯化系统(18 MΨ,
Milipore公司);SGT7200HBT型超声清洗器 (上海
冠特超声仪器有限公司);BS110S电子天平(北京
赛多利斯有限公司);TGL-16B型离心机(上海安亭
科学仪器厂)。
　　驱虫斑鸠菊购于新疆维吾尔自治区维吾尔医医
院制剂室 ,经新疆维吾尔自治区药物研究所张彦福
研究员鉴定为菊科植物驱虫斑鸠菊的干燥成熟果
实。甲醇(色谱纯 ,美国 Fisher公司),乙腈 (色谱
纯 ,美国 Fisher公司),超纯水(18 MΨ, Milipore公
司),磷酸(分析纯 ,天津市化学试剂三厂)。
1.2　色谱条件　Shim-packVP-ODSC18柱(150mm×
4.6mmi.d., 5μm),柱温为 30℃,流动相:A液为乙
腈 , B液为 0.5%磷酸水溶液。梯度程序:0min, 10%
A;70min, 32%A。流速:1ml/min,检测波长为 220
nm,进样量为 10μl。
1.3　方法　根据药材所含成分性质选择二元流动
相的溶剂组成 、检测波长。比较不同提取方法的色
谱分离效果。利用梯度洗脱程序对色谱分离不佳的
部分进行优化 ,使各组分达到有效分离 ,在同一优化
的色谱条件下对比驱虫斑鸠菊不同提取部位的
异同 。
1.4　供试品溶液的制备
1.4.1　85%乙醇提取物供试品溶液的制备　准确
称取驱虫斑鸠菊药材 4g(过 30目筛),用 40ml体积
分数为 85%的乙醇回流提取共 3次(加提取溶剂的
量依次为药材体积的 10、8和 8倍),合并滤液;用少
许提取溶剂冲洗 , 3次煎煮时间依次为 2、1和 1h,将
各煎煮液过滤 ,合并上清液 ,置于 100ml量瓶中 ,用
提取溶剂定容 ,制得样品溶液(每毫升相当于原药
材 0.04 g)。
1.4.2　水提取物供试品溶液的制备　准确称取驱
虫斑鸠菊药材 4g(过 30目筛),精密称定 ,加水 40
ml,加热回流提取 ,其他操作同上节所述 ,制得样品
溶液(每毫升相当于原药材 0.04 g)。
1.4.3　半仿生提取物(semi-bionicsextraction, SBE)
供试品溶液的制备　准确称取驱虫斑鸠菊药材 4g
(过 30目筛),按照优选的最佳工艺条件 [ 3] ,加 80%
乙醇 40ml,加热回流提取 3次(加提取溶剂的量依
次为药材体积的 10、8和 8倍),三煎提取溶液用
1%HCl或 0.5%NaOH调 pH值依次为:6.0、6.5和
8.0;提取时间依次为:1、0.5和 0.5h,将各煎煮液
过滤 ,合并上清液 ,置 100ml量瓶中 ,提取溶剂定
容 ,制得样品溶液(每毫升相当于原药材 0.04g)。
2　结　　果
2.1　色谱条件的选择
2.1.1　色谱模式及色谱柱的选择　中药成分复杂 ,
含有弱极性 、中等极性和强极性的各类化合物。液
相色谱具有分离模式多样化 、应用面广 、分离效率高
·795·　第 8期　　刘晓东 ,等　高效液相色谱指纹图谱在驱虫斑鸠菊不同提取工艺对比研究中的应用
等优点 。在液相色谱中 ,反相液相色谱以其操作简
单 、数据重现性好而被广泛应用。通常能够采用反
相液相色谱分离的样品应尽量使用反相色谱模
式 [ 4-7] 。黄酮类化合物在 HPLC分析中通常采用的
是 ODS柱 。因此 ,本研究采用反相 HPLC模式和
Shim-packVP-ODSC18柱。
2.1.2　流动相的选择　改变流动相组成既可调节
保留时间 ,也可调节选择性 。采用高效液相色谱法
测定中药及其制剂中黄酮类成分的文献报道较
多 [ 8, 9] 。驱虫斑鸠菊中含有黄酮类成分 ,多酚羟基
或含有羧基。因此 ,驱虫斑鸠菊的主要有效成分多
具有一定的极性和酸性 [ 10] ,易于解离出质子 ,所以
在流动相中要添加适当比例的磷酸抑制其解离以获
得稳定的色谱峰。本研究比较了甲醇-水 、乙腈-水 、
甲醇 -0.5%磷酸水溶液 、乙腈-0.5%磷酸水溶液等
流动相的分离效果。结果表明 ,采用乙腈体系作为
流动相 ,可避免甲醇体系对低波长吸收化合物检测
的影响[ 4] ,同一条件下乙腈较甲醇对驱虫斑鸠菊总
提取物的分离效果较佳。因此 ,选择乙腈和 0.5%
的磷酸水溶液作为基本的流动相单元(图 1)。
图 1　不同流动相系统下最优的 HPLC-FP
Figure1　HPLC-FPsofthesamplesindifferentmobilephases
　　　a:甲醇-水(0～ 80min,甲醇体积:20% ～ 50%;流速:1ml/min);b:乙腈-水(0～ 80min,乙醇体积:10% ～ 40%;流速:1ml/min);c:乙
腈-0.5%磷酸(0～ 70min, 10% ～ 32%;流速:1ml/min)
2.1.3　检测波长的选择　驱虫斑鸠菊中成分的最
大吸收峰在波长 205、220、242、280、289、356nm等
处 。在 205nm处 ,色谱峰漂移较严重 ,在 220nm处
吸收较多 ,且基线较平稳 ,因此选择 220nm为检测
波长。
2.1.4　柱温的选择　在相同条件下观察 20、25、30、
35、40℃柱温对各组分的影响 。结果表明温度较低
则压力较大 ,故以 30℃为最佳 。
2.2　乙醇提取溶剂体积分数的单因素实验设计　
驱虫斑鸠菊药材 4g(过 30目筛)6份 ,精密称定 ,分
别用 40ml体积分数为 60%、70%、75%、80%、85%、
90%的乙醇回流提取 ,其余操作同 1.4.1节 ,制得样
品溶液(每毫升相当于原药材 0.04g)。精密吸取上
述方法制得的样品溶液 5ml,置于 10ml容量瓶中 ,
用提取溶剂定容 。溶液过 0.45μm微孔滤膜 ,对滤
液进行 HPLC分析。考察不同浓度乙醇提取物色谱
峰形 、出峰数目 、分离度及各主要共有峰的峰面积的
大小等优化指标 ,确定进行样品成分分析的乙醇提
取溶剂的体积分数为 85%。
2.3　不同提取物洗脱程序的优化　在所建立的上
述色谱条件基础上 ,以乙醇提取物为标准 ,优化乙醇
提取物高效液相色谱指纹图谱洗脱程序 。由于等度
洗脱很难将驱虫斑鸠菊乙醇提取物中不同极性的组
分都在较佳容量因子的范围内洗脱 ,所以当几个成
分的色谱保留行为差异较大时 ,可采用梯度洗脱方
式以提高分离效果 ,缩短分析时间 [ 11] 。本研究采用
梯度洗脱进行分离。经优化得到以下初始程序:0 ～
120min, 25% ～ 75%A;流速:1ml/min;进样量:10
μl。其色谱峰全都集中在 0 ～ 20min之间 , 分布较
密;而在 20 ～ 120min之间则无色谱峰出现 (图 2a),
说明初始设置的流动相梯度在 0 ～ 20min之间洗脱
溶剂强度过高 。当运行到 20min左右时 , A的体积
分数为 32%,表明 A的体积分数大于 32%时 ,极性
较大的组分未达到基线分离而被快速洗脱出来。因
此 ,要适当的改变初始洗脱溶剂的强度 ,降低第 20
min以前洗脱溶剂的强度 ,适当增加第 20min以前
的梯度 ,使 tR小于 10min的色谱峰顺延 ,从而改善峰
分布。图 2b为上述程序改变为 0 ～ 50min, 10% ～
·796· 医学研究生学报 2009年 8月　第 22卷　
32%A;流速:1ml/min;进样量:10μl的色谱图。从
图 2b可见 ,通过降低前段时间的洗脱强度 ,增加
0 ～ 20min之间的梯度使溶剂洗脱强度变化减缓 ,可
达到改善峰分布的效果 。用上述优化条件 ,色谱峰
分布较均匀 ,但是分离度相对较小。图 2c为在上述
优化程序的基础上仅改变洗脱时间 50min为 70min
的色谱图 ,可见所有的色谱峰都可有效分离 ,分离度
较高 ,并且色谱峰的分布非常均匀。
　　经稳定性 、精密度 、重现性试验分析 ,表明应用上
述程序所得驱虫斑鸠菊乙醇提取物的各峰具有较佳
的稳定性 、精密度 、重现性(数据略)(图 3a、b、c)。
2.4　不同工艺提取物 HPLC-FP的建立　在上述乙
醇提物所优选的色谱条件下 ,分别用 HPLC-FP测定
水提物及半仿生提物 。精密吸取以上实验所制得的
样品溶液 5ml,置于 10ml量瓶中 ,用提取溶剂定容 ,
将溶液过 0.45μm微孔滤膜 ,滤液进行 HPLC分析。
不同提取物在相同色谱条件下的高效液相色谱指纹
图谱见图 3(a、b、c)。结果表明在此条件下水提物
中所有成分及半仿生提物中所有成分均能获得很好
的分离效果 。
2.5　不同提取工艺提取物 HPLC-FP对比研究　图
3a、b、c分别为驱虫斑鸠菊的 85%乙醇提取物 、驱虫
斑鸠菊水提取物和驱虫斑鸠菊半仿生提取物的
HPLC-FP,且 7、 8共有峰及 27峰均可在动物含药
·797·　第 8期　　刘晓东 ,等　高效液相色谱指纹图谱在驱虫斑鸠菊不同提取工艺对比研究中的应用
血清中检测出 ,为主要的共有指纹峰 ,这些组分可能
是驱虫斑鸠菊治疗白癜风体内直接作用的物质基
础 。目前正对其进行结构分子鉴定。药效学的进一
步深入研究将有助于阐明其治疗作用的机制。
　　比较图 3a和 c,可见驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取
物和半仿生提取物的 HPLC-FP比较相似 ,共有 19
个主要的共有峰 ,其中 2、4 ～ 10、13、17峰峰面积较
大 。但两者的指纹图谱各共有峰的峰面积则有很大
差异 ,其中驱虫斑鸠菊半仿生提取物的 HPLC-FP中
1 ～ 4、 9、10、 12、 13、 17色谱峰的峰面积相对大于
85%乙醇提取物;而 5、7、15、18、19色谱峰峰面积二
者相当 ,前者略大于后者;6、8、11、14、16色谱峰峰
面积则前者明显小于后者 ,结果见表 1(以驱虫斑鸠
菊 85%乙醇提取物各共有峰为参比峰)。
　　比较图 3a、b、c,还可见驱虫斑鸠菊水提取物
与 85%乙醇提取物及半仿生提取物的 HPLC-FP
有较大差异 ,其中 1、4、6、11、12、14、16 ～ 19峰为
驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取物和半仿生提取物的高
效液相色谱指纹图谱特有峰 ,而 20 ～ 30峰则为驱
虫斑鸠菊水提取物的高效液相色谱指纹图谱特有
峰 。三者之间有 9个共有峰 ,分别为 2、3、 5、7 ～
10、13、15峰 ,面积相对较大的主要共有峰基本上
都存在 ,但水提取物的 9个共有峰中除 5、8峰的峰
面积大于 85%乙醇提取物及半仿生提取物的
HPLC-FP共有峰峰面积外 ,其余各共有色谱峰的
峰面积都明显低于这两者的共有峰的峰面积 , 结
果见表 2(以驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取物各共有
峰为参比峰)。
表 1　驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取物与半仿生提取物的各共有峰相对峰面积比较
Table1　Relativeareasofcommonpeaksinthefingerprintsofthe85% ethanolandsemi-bionicextracts
样本类别 共有峰相对面积
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
85%乙醇提取物 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
半仿生提取物 3.43 1.13 1.27 1.43 0.97 0.73 0.97 0.88 1.12 1.15 0.81 1.36 1.41 0.65 0.99 0.69 1.24 1.04 0.91
表 2　驱虫斑鸠菊不同提取物各共有峰相对峰面积比较
Table2　Relativeareasofcommonpeaksinthefingerprintsof
diferentextracts
样本类别 共有峰相对面积
2 3 5 7 8 9 10 13 15
85%乙醇提取物 1 1 1 1 1 1 1 1 1
半仿生提取物 1.13 1.27 0.97 0.97 0.88 1.12 1.15 1.41 0.99
水提取物 0.85 0.37 1.24 0.24 1.22 0.10 0.08 0.10 0.30
3　讨　　论
　　本研究建立了驱虫斑鸠菊不同提取物的最优
HPLC-FP条件 。在完全相同的色谱条件下 ,驱虫斑
鸠菊水提取物 、85%乙醇提取物及半仿生提取物的
各色谱峰都能非常好地分离开来 ,使得工艺具有可
比性 。
　　通过驱虫斑鸠菊不同提取物高效液相色谱指纹
图谱的对比研究 ,得知驱虫斑鸠菊 85%乙醇提取物与
半仿生提取物的指纹图谱比较相似 ,而与驱虫斑鸠菊
水提物指纹图谱差异较大 ,前两者之间有 19个共有
峰;三者之间则有 9个共有峰 ,分别为 2、3、5、7 ～ 10、
13、15峰比较各共有峰的相对峰面积 ,发现各共有峰
的异同 ,且 7、8共有峰及 27峰为主要共有指纹峰 ,可
能是驱虫斑鸠菊治疗白癜风的体内直接作用物质基
础 ,对其结构进一步研究将有助于阐明其作用机制。
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(责任编辑:齐　名;　英文编辑:罗永合)
·798· 医学研究生学报 2009年 8月　第 22卷