全 文 ：2.2　酚类化合物对 DNA提取的影响
在进行梨叶片 DNA 提取时 , 在其它处理条件不变的情况
下 ,分别对研磨时加入 PVP , 研磨后的粗样液中加入 PVP 及不
加入 PVP 进行了对比 , 发现不加入 PVP 时 , OD260 OD280 为
1.3215;研磨时加入 PVP , OD260 OD280为 1.5467;研磨后的粗样
液中加入 PVP, OD260 OD280为 1.7514。
实验过程中 ,在不加入 PVP的情况下 , 对加入 β -巯基乙
醇的量也进行了一个对比 , 发现加入的 β-巯基乙醇为 5%时
的效果最好 , OD260 OD280为 1.7653 , 但是最后得到的 DNA 的浓
度只有 20ng左右 , 和加入 PVP 和 2%的 β -巯基乙醇相比 , 所
得到的 DNA 浓度低了数倍。
2.3　样品用量对 DNA提取的影响
在使用 1.5ml的 CTAB 缓冲液时 , 分别采用 0.1g 、0.3g 和
0.5g植物材料进行了 DNA提取 , 三种样品量虽然都提取出了
DNA , 但是以 0.3g 材料所得到 DNA 的浓度和纯度最好 , OD260
OD280值在 1.7-1.8 之间 , 浓度达到了 100ng以上。 0.1g 样品
量虽然有利于操作 ,但是纯化后大多品种的 DNA 浓度在 10ng
左右 , 0.5g 样品量提取的 DNA 纯度和浓度都较低 , OD260 OD280
值在 1.4-2.0之间 , 浓度多在 20ng 左右。
2.4　基因组 DNA的电脉检测
图 1中泳道 1～ 11 为采用 CTAB 法提取的梨总 DNA 电泳
图谱。从电泳图谱可看出 , 所提取的总 DNA 在凝胶上呈较整
齐的一条线 ,无严重的拖带现象 , 说明该方法提取的 DNA降解
现象较轻 ,完整性较好。
图 1　11个梨品种的基因组DNA电脉图
1.西子绿;2.绿宝石;3.马蹄黄;4.雪芬;5.新雅;6.懋功;7.翠绿;8.馨
香;9.大果水晶;10.黄金;11.宝珠
2.5　双酶切检测
图 2为 11 个梨品种基因组 DNA的 EcoRI和 MseI双酶切
图谱。 EcoRI 和 MseI 能够切割 11 个品种的基因组 DNA。说
明用该法所提取的 DNA 所含的杂质较少 , 所提取的 DNA 双酶
切效果较好。
3　讨论
梨叶片中含有多糖 、酚类化合物和蛋白质等杂质 ,根据对
实验过程的观察 , 可以将 11个品种分为2 类 , 一类蛋白质含量
多而多糖 、酚类物质含量少 , 对于这类材料 , 适当增加 24:1 的
处理次数能够使蛋白质沉淀下来;另一类材料蛋白质含量少
而多糖 、酚类物质含量多 , 对于这些品种 , 因为老的组织较幼
嫩的组织含有较多的多糖 , 选材上应该选用幼嫩的组织 , 另
外 ,用 5mol L的 NaCl处理(CTAB 裂解后的上清液中加入 5mol
L的 NaCl)和 3mol L 的 NaAc 等处理能够有效的降低多糖含
量。
图 2　11个梨品种的基因组 DNA 双酶切效果图
1.西子绿;2.绿宝石;3.马蹄黄;4.雪芬;5.新雅;6.懋功;7.翠绿;8.馨
香;9.大果水晶;10.黄金;11.宝珠
在实验中发现 , 在 CTAB 中加入 3%的 β-巯基乙醇 ,并在
研磨后的粗提液中加入 PVP , 所获得的 DNA 的浓度要明显高
于单独加入 5%的 β -巯基乙醇。这是因为 PVP和 β-巯基乙
醇都可以用来去除酚类化合物 , 但是加入过高的 β -巯基乙醇
会影响 DNA的产率。
在样品量方面 , 太少的样品导致 DNA 的得率低;样品太
多 , CTAB 液较粘稠 , 细胞裂解不充分导致 DNA 没有完全释放 ,
影响 DNA的浓度和纯度。
参考文献:
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杜鹃属基因组 DNA提取及 RAPD的检定
赵喜华1 ,张乐华2 ,王曼莹1＊(1.江西师范大学 亚热带植物资源保护与利用省重点实验室 , 江西 南昌 330022;2.庐山植物园 ,江西 九江 332900)
摘要:以杜鹃花属常绿杜鹃亚属井冈山杜鹃树叶为材料 ,分别采用修改的 CTAB 法 、碱裂解法 、SDS 法提取基因组 DNA。实验
表明 ,三种方法所提的 DNA纯度及产率有差别 , 从综合结果看 ,以 CTAB法最好 ,其所提到的 DNA 大小与λDNA(21kb)相似 ,经检
验该法适合杜鹃花属植物总基因组 DNA的提取 ,所得 DNA不需纯化就可直接用于 RAPD分析。
关键词:井冈山杜鹃;基因组 DNA 提取;RAPD
中图分类号:Q781　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)05-0043-03
Extraction of Genomic DNA from Rhododendron and Its RAPD Examation
ZHAO Xi-hua1 ,ZHANG Le-hua2 ,WANG Man-ying1
(1.Jiangxi Normal University Utilization and Protection of Resources of Subtropical Plant Key Laboratory
of Jiangxi Province , Nangchang 330027;2.Lushan Botanical Garden , Jiujiang 332900 ,China)
第 15卷第 5 期:43
2005 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.5:43
Oct.2005
Abstract:The extraction of high quality genomic DNA was extracted from the evergreen leaves of R .jinggangshanicum Tam by modified CTAB ,
base cleavage and SDS method respectively.The purity and production were different among 3 methods.According to the comprehensive results ,
the method of CTAB was the best and the DNA length was similar toλDNA(21kb).The method was tested to adapt to the extraction of Rhododen-
dron.This isolated DNA could be used directly for RAPD analysis without purification.It was really suitable for great amount samples for RAPD
analysis.
Key words:extraction of genomic DNA;R.jinggangshanicum Tam;RAPD
收稿日期:2005-03-22;修回日期:2005-07-28
攻关项目:江西省重大农业科技攻关顶目资助(200465)
作者简介:赵喜华(1977-),男 ,江西玉山人 ,硕士研究生 , 从事分子生
物学研究;＊通讯作者:王曼莹(1944-),女 , 江西南昌人 ,教授, 博士
生导师 ,从事生物化学和分子生物学教学与科研。
　　根据不同的物种 , 采取不同的方法[ 1-9] , 获得高质量的
DNA样品是 PCR扩增的首要步骤。而用于 PCR分析 , DNA 提
取步骤越少越好 , 多步骤 、多种试剂容易引起交叉污染 , 影响
PCR的准确性。本实验选用 3 种有代表性的 DNA 提取方法 ,
对其中一种方法加以改进 ,对杜鹃花总 DNA 提取进行比较研
究 ,以便从中筛选出快速 、简便且可获得高质量 DNA分子的方
法。其标准是:DNA 长度完整 、数量足 、纯度高。本文所提到
的 DNA 量高 、质量好 , 将为下一步的研究打下坚实的基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
井冈山杜鹃(R.jinggangshanicum Tam)和其它十个品种(庐
山植物园提供 , 在二月份采集 , 为绿叶非嫩叶), 用液氮研磨 ,
放在-70℃保存。
1.1.2　试剂
琼脂糖(Bio Basic 公司);CTAB(Bio Basic 公司);EDTA(永
大化学试剂开发中心);Tris(Bio Basic公司);10×Taq酶配套缓
冲液(大连宝生工);dNTP(Sangon 公司);MgCl2(大连宝生工);
Taq酶(大连宝生工);引物(大连宝生工);β -巯基乙醇(Bio
Basic公司)等。
1.1.3　仪器
台式酸度计(瑞士梅特勒);凝胶成像系统(美国 UVP 公
司);紫外分光光度计 4300(Amersham 公司);移液器(芬兰);三
恒多用电泳仪(北京六一仪器);琼脂糖水平电泳槽(北京六一
仪器);超速冷冻离心机(美国科峻公司);PCR仪(日本博日);
超低温冰箱(日本三洋)等。
1.2　基因组 DNA提取方法
1.2.1　碱裂解法[5]
称取 45mg研磨的井冈山杜鹃叶于 1.5ml的离心管中 , 加
入65℃0.5mol L的 NaOH 600μl ,微微振荡 , 于 4℃10000r min 离
心 5min , 有上清液 500μl , 取 30μl上清液至另一离心管 , 加入
100mmol L的 Tris-HCl(pH8.0)450μl ,置于 4℃冰箱备用。
1.2.2　SDS 法[ 6 ,7]
称取 45mg研磨的井冈山杜鹃叶于 1.5ml的离心管中 , 加
入 600μl的提取液[ Tris-HCl(pH8.0)100mmol L, EDTA(pH8.0)
100mmol L, NaCl 250mmol L, SDS1.5%(W V), 2-β -巯基乙醇
2%(V V)(用前加入)] 。在 65℃的水浴中保温 30min , 取出后
10000r min离心 10min , 上清液转入另一干净离心管 , 加等体积
的氯仿:异戊醇(24∶1)抽提 3 次后 , 加 0.7 体积的异丙醇沉淀
DNA , 14000r·min -1离心10min ,弃上清液 , 沉淀用70%的酒精洗
涤 2次 , 除去酒精稍稍离心 , 并用吸管吸出多余的酒精溶液。
用30μl TE(10mmol L Tris-HCl , pH8.0;1mmol L EDTA , pH8)溶
解 DNA。
1.2.3　CTAB法[ 8 ,9]
分别称取研磨的杜鹃花 15mg、25mg、35mg 、45mg、55mg 于
1.5ml的离心管中 , 加入-20℃160μl丙酮振荡 , 静置 15min , 以
3000r·min -1离心 10min ,弃上清 , 再重复1 次 ,弃上清 , 在沉淀中
加 65℃预热的 600μl的提取液[ Tris-HCl(pH8.0)100mmol L ,
EDTA(pH8.0)20mmol L , NaCl 1.4mol L , 2-β-巯基乙醇 2%
(V V)(用前加入), 2%CTAB(W V)] 65℃水浴 4h(通过 1h 、2h、
3h、4h、5h 、6h 、7h、8h 时间的优化 , 得到最佳的时间为 4h), 不时
轻轻颠倒 , 取出加入 600μl氯仿 异戊醇(24∶1), 颠倒成乳浊状 ,
10000r·min-1离心 10min , 取上清 , 再抽提 1 次 , 取上清 , 加入体
积分数为 0.7 异丙醇 , 置-20℃冰箱 30min , 14000r·min-1离心
10min ,弃上清液 , 取沉淀 ,用 70%的酒精洗涤2 次 ,以后步骤同
1.2.2处理 。
1.3　DNA样品的检测方法
对于所提取的 DNA样品 , 可用 2种方法检测 , 即紫外分光
光度计检测及凝胶电泳检测。
1.3.1　紫外分光光度计检测法
使用 Amersham公司 4300紫外分光光度计 , 通过 260nm 的
吸光值来计算 DNA样品浓度 , 即浓度=50ng μl×A260×稀释倍
数 , 通过A260与A280的比值计算纯度。
1.3.2　琼脂糖凝胶水平电泳检测法
取 1μl 总基因组 DNA 样品 , 加入 1μl 上样缓冲液 , 若是
PCR产物取 7.5μl , 加入 1.5μl上样缓冲液 , 混匀注入胶孔内 ,
输出电压 6v cm。
1.4　PCR反应条件
反应体积 20μl ,含 10×Taq 酶配套缓冲液 2μl;1U Taq 酶;
模板 DNA 10ng;13.32pmol引物;1.75mmol·L-1MgCl2;dATP、
dCTP、dGTP 和 dTTP各 0.15mmol·L-1 。经过摸索 ,反应程序为:
94℃预变性 5min , 94℃变性 1min , 37℃退火 1min , 72℃延伸
2min ,共 40 个循环 , 72℃最后延伸 7min。
2　结果与讨论
CTAB法所提的 DNA 沉淀为白色 , 由表 1 可知 , A260 A280值
在 1.75-1.82 之间 , 当质量在 45mg时所提到的 DNA 的 A260
A280和浓度均最大 ,即用 CTAB法时在 45mg 时有最佳值。碱裂
解法所提取的 DNA沉淀为红褐色 , SDS 法所提取的 DNA 沉淀
为淡黄色 , DNA的 A260 A280值都在 1-1.1 之间 , 纯度过低 , 表
明 DNA中含有酚 、蛋白质 、多糖等有机物;CTAB 法与 45mg 质
量相同的其它两种方法相比较 , 表明所提 DNA 较纯 , 浓度较
高。由于碱裂解法所提到的总基因组 DNA 非常不纯 , 含杂质
多 , 故产率(碱裂解法的计算方法:产率=C×500 30 45 , SDS 法
和 CTAB 法的计算方法:产率=C×30×10-6 45)最高;CTAB 法
纯度最大 , 就 DNA 而言 ,浓度也最大。
表 1　不同提取方法的比较
Table 1　The contrast of different extraction
方法 编号 A260 A280 A260 A 280 C(ng μl)产率(%)
碱裂解法 1 1.028 0.943 1.100
(稀释 4倍) 2 1.183 1.115 1.024
3 1.182 1.159 1.020
平均 1.131 1.079 1.048 769.17 4.020
SDS法 1 1.134 1.101 1.030
(稀释 8倍) 2 1.178 1.149 1.025
3 1.199 1.195 0.999
平均 1.170 1.056 1.018 468.00 0.031
CTAB法 1 1.921 1.096 1.753
(稀释 10倍) 2 1.936 1.095 1.768
3 1.969 1.086 1.813
平均 1.942 1.092 1.778 971.00 0.065
44　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 15 卷第 5期
　　用 RAPD(S31)引物对不同的提取方法井冈山杜鹃总基因
组检定 ,由图 1 可知 ,碱裂解法没有条带呈现 , SDS 法所呈现的
条带较弱 , CTAB 法所提 DNA的条带较亮也即量较多 , 这与紫
外分分光度检测方法相吻合。但碱裂解法紫外分光度法所检
测浓度有最大 ,这就恰恰显示所提的 DNA中含有大量的酚 、多
糖 、蛋白质 、单宁 、色素 , 所提产物不含 DNA 或含量非常少。如
图 2所示 , CTAB法提取的井冈山杜鹃 DNA 纯度高 、浓度高 , 11
种杜鹃花 DNA 分子量在 21kb 以上 , 确定是基因组 DNA。用
CTAB 法大规模提取 11 种不同杜鹃花的总 DNA , 且不需纯化
RAPD就能扩增到产物。如图 3 所示 , CTAB 法抽提的 DNA 不
需纯化 , 不需去除 RNA ,能产生多态性好的图谱 , 这与有关文
献[ 10]报道是一致的。
图 1　井冈山杜鹃总DNA不同提取方法的 RAPD 扩增结果(引物 31)
1.空白对照;2.碱裂解法;3.CTAB法;4.SDS法;M.Marker(EcoR Ⅰ +λ
-Hind Ⅲ digest)
3　结论
由于实验所采的叶子是在二月份采集的 , 材料质量非常
不好 , 所以有必要对基因组 DNA 提取方法进行摸索 ,通过三种
方法的比较 , 我们认为改良的 CTAB法是效果最好的方法。 这
为不理想材料的基因组 DNA的提取 , 提供了一种的很好方法。
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图 2　CTAB法对不同的杜鹃花DNA电泳结果
1.光枝杜鹃;2.皱叶杜鹃;3.红滩杜鹃;4.耳叶杜鹃;5.马缨杜鹃;6.云锦杜鹃;7.井冈山杜鹃;8.露珠杜鹃;9.桃叶杜鹃;10.马银花杜鹃;11.长蕊杜
鹃;M.Marker(EcoRⅠ +λ-Hind Ⅲ digest).
图 3　不同的杜鹃花 RAPD扩增结果(引物 S10)
1.光枝杜鹃;2.皱叶杜鹃;3.红滩杜鹃;4.耳叶杜鹃;5.马缨杜鹃;6.云锦杜鹃;7.井冈山杜鹃;8.露珠杜鹃;9.桃叶杜鹃;10.马银花杜鹃;11.长蕊杜
鹃;M.Marker(EcoRⅠ +λ-Hind Ⅲ digest).
利用 PCR技术检测致病性腊样芽孢杆菌的研究
王振国 ,刘金华 ,肖成蕊 ,蔡阳 ,罗雁菲 ,刘和平 ,牟峻(吉林出入境检验检疫局技术中心 ,吉林 长春 130062)
摘要:目的:利用 PCR技术对致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)进行检测。方法:对致病性蜡样芽孢杆菌溶血素 hblA 基因
序列进行分析设计一对特异引物 ,通过优化 PCR反应条件 , 来实现对致病蜡样芽孢杆菌的快速检测 , 结果:该方法具有较强的灵
敏性及特异性 ,能够对肠毒素型腊样芽孢杆菌进行有效的检测 ,其最低检出限可达 9CFU ml , 用 PCR技术对食物样品中致病性蜡
样芽孢杆菌的检测取得与普通生化检测方法一致的结果。结论:利用 PCR技术对食品中蜡样芽孢杆菌的检测较常规的生化检测
方法具有省时省力的特点且灵敏性较高 ,具有较强的实际应用价值。
关键词:蜡样芽孢杆菌;溶血素 hblA基因;检验
中图分类号:TS201　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)05-0045-03
Study on Identification of Morbific Bacillus cereus by PCR
WANG Zhen-guo ,LIU Jin-hua ,XIAO Cheng-rui ,CAI Yang ,LUO Yan-fei ,LIU He-ping , MU Jun
(Jilin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau , Changchun 130062 , China)
Abstract:Objective:Study on Identification of Morbific Bacillus cereus by PCR technology in food samples.Methods:a pair of specific primers
was designed base on the hblA gene of Enterotoxic Bacillus cereus , by optimized the PCR reaction parameter ,Morbific Bacillus cereus was detected
successfully in food.Results:a PCR method ofr rapid detection of Bacillus cereus based on hblA gene was developed.Its least detection limit is 9
CFU ml in some food samples.Conclusion:amplification hblA gene by the PCRmethod allows faster detection of Enterotoxic Bacillus cereus;it had
more specific and sensation livel than traditional biochemical methods.
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