全 文 ：DNA是基本遗传物质， 是遗传信息的载体。 获
取高质量的DNA是进行酶切、 PCR扩增、 遗传多样
性分析及基因组学等分子生物学研究的基础[1]。 植
物 DNA的提取方法很多， 传统的方法主要是 CTAB
法、 SDS法等[2-3]。 CTAB法和 SDS法都是在裂解植
物细胞的基础上， 多次利用有机溶剂进行抽提， 使
蛋白质等沉淀于有机试剂中， 而核酸保留在水相，
从而达到分离核酸的目的。
落花生(Arachis L.)是一种饲用和地被植物兼
用型豆科牧草 ， 全属约 100种 ， 除一个栽培种
(Arachis Hypogaea)外， 其余均为多年生野生种质，
原产于南美巴西等地， 主要分布在巴西、 阿根廷、
玻利维亚以及乌拉圭等地[4]。 因其具有营养价值
高、 适应性强、 繁殖能力强及观赏价值高等优点，
被广泛应用于牧草及地被等方面。
近年来， 虽然落花生属种质资源较丰富， 但是
优良种质的利用研究较少， 目前的育种手段主要停
留在传统的选择育种上， 育成的品种较少。 随着分
落花生属植物基因组 DNA提取及鉴定①
黄春琼② 刘国道 白昌军
(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/
农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室 海南儋州 571737)
摘 要 以落花生(Arachis L.)嫩叶为材料， 在传统 CTAB法的基础上加以改良， 建立了落花生基因组 DNA的
CTAB提取方法。 结果表明： 所提取的 DNA经核酸蛋白含量测定得 A260/A280处于 1.84～1.95， 经琼脂糖凝胶电泳
检测各样品均具有一条明亮主带且无拖尾现象。 表明改进的 CTAB法提取得到的 DNA完整性好， 纯度高， 可有效
应用于后续的分子标记等研究。
关键词 落花生 ； 改良CTAB法 ； 基因组DNA提取 ； 提取方法
分类号 S54
Extraction and Identification of Genomic DNA from Arachis
HUANG Chunqiong LIU Guodao BAI Changjun
(Tropical Crops Genetic Resources Institute, CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Crop
Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Danzhou, Hainan 571737)
Abstract The extraction of genomic DNA from Arachis L. is a precondition of molecular biological
research. An improved method of extracting genomic DNA from young leaves of Arachis was established.
The obtained DNA was detected by nucleic acid and protein analyzer， which results showed that A260/A280
ranged from 1.84 to 1.95, the extracted products had a bright band without tailing which could be
observed through agarose gel electrophoresis. These results indicated that the genomic DNA being
extracted by improved CTAB method had good integrality and high purity, and it could be used in each
kinds of molecular markers research.
Keywords Arachis L. ; improved CTAB method ; DNA extraction ; extraction method
① 基金项目： 中国热带农业科学院热带农业青年拔尖人才 “热带牧草及草坪草基因资源创新与利用”； 中央级公益性科研
院所基本科研业务费专项资金(No.PZS075)； 现代农业产业技术体系建设专项(No.CARS-35)。
收稿日期： 2013-07-24； 责任编辑/林海妹； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 黄春琼(1982～)， 女， 云南宣威人， 博士， 副研究员， 主要研究方向为热带牧草种质资源与育种；
E-mail: huangchunqiong44@163.com。
Vol．33, No．9
2013年9月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第33卷第9期
Sep． 2013
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黄春琼 等 落花生属植物基因组DNA提取及鉴定
表3 缓冲液B的配方(100 mL， 加ddH2O定容)
试剂 体积 终浓度
1.0mol·L-1Tris-HCl(pH8.0) 10mL 0.2mol·L-1
0.5mol·L-1EDTA-Na2(pH8.0) 4mL 0.02mol·L-1
CTAB 2g 2%(W/V)
NaCl 8.2g 1.4mol.L-1
β-巯基乙醇(使用之前加) 2mL 1%(V/V)
PVP-40(使用之前加) 3g 3%(W/V)
ddH2O 84mL -
子生物学的迅速发展， 落花生的分子生物学研究也
逐步兴起， 并在落花生的育种中发挥着越来越重要
的作用。 目前关于落花生分子生物学的研究极少，
因此， 笔者以落花生嫩叶为材料， 对落花生基因组
DNA进行提取研究， 旨在筛选出一种快速、 简便且
可获得高质量DNA的提取方法， 为进一步深入开展
落花生分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
试验材料盆栽种植于中国热带农业科学院热带
作物品种资源研究所牧草中心试验大棚里。 17份
落花生材料信息见表 1， 包括落花生属的 3个种：
平托落花生(Arachis pintoi)、 蔓花生(Arachis dura-
nensis Krapov & W. Gregory.)和光叶落花生(Arachis
glabrata)。 采集幼嫩叶片， 于4℃冰箱保存备用。
1.1.2试剂
三羟甲基氨基甲烷(Tris)、 乙二胺四乙酸(ED
TA)、 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、 聚乙烯吡咯
烷酮(PVP)、 β-巯基乙醇均购自 BBI公司； 氯仿、
异丙醇、 异戊醇、 盐酸(HCl)、 溴酚蓝、 无水乙醇等
均为国产分析纯； 10 mg/mL RNaseA酶购自 Sigma
公司； 引物由上海英俊公司合成。
1.2方法
1.2.1基因组 DNA的提取
参照 Dolye[2]的方法， 并对其进行改进， 具体
步骤为： (1)取新鲜幼嫩叶片， 加入液氮迅速研磨成
粉末， 转入2mL离心管中， 加入1mL预冷的缓冲液
A(表2)， 冰浴10min， 5000r/min离心5min， 弃
上清； (2)加入 1mL65℃预热的提取缓冲液 B(表
3)， 混匀， 65℃水浴30min， 其间不断轻轻混匀，
4℃， 1000r/min离心5 min； (3)取上清， 加入酚
/氯仿/异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)， 轻轻颠倒
混匀， 4℃， 12000r/min离心5min； (4)取上清，
加入氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)， 轻轻颠倒混匀，
4℃， 12000r/min离心5min； (5)重复步骤(4)一
次； (6)取上清， 加入等体积异丙醇， 轻轻混匀，
置于－20℃沉淀 20min； (7)弃上清， 以70%乙醇
洗涤 2次； (8)风干后加入 100μL TE缓冲液(表
4)溶解沉淀， 同时加入1μL10 mg/mLRNaseA酶，
37℃水浴30min， 4℃保存备用。
与Dolye[2]的方法相比， 改进之处如下： (1)在
用提取缓冲液裂解细胞膜之前 ， 加入 CTAB-free
缓冲液； (2)原方法样品的研磨是先 60℃水浴， 然
表1 17份落花生材料信息
编号 中文名 学名
A01 平托落花生 Arachis pintoi
A02 平托落花生 Arachis pintoi
A03 平托落花生 Arachis pintoi
A04 平托落花生 Arachis pintoi
A05 平托落花生 Arachis pintoi
A06 平托落花生 Arachis pintoi
A07 平托落花生 Arachis pintoi
A08 蔓花生 Arachis duranensis Krapov& W. Gregory.
A09 平托落花生 Arachis pintoi cv.Amarillo
A10 平托落花生 Arachis pintoi CIAT 17434
A11 平托落花生 Arachis pintoi CIAT 18748
A12光叶落花生(广西种) Arachis glabrata (Guangxi)
A13 光叶落花生 Arachis glabrata
A14 平托落花生 Arachis pintoi CIAT 18750
A15 光叶落花生 Arachis glabrata CPI 93483
A16 平托落花生 Arachis pintoi CIAT 18744
A17 平托落花生 Arachis pintoi CIAT 22160
表2 缓冲液A的配方(100 mL， 加ddH2O定容)
试剂 体积 终浓度
1.0mol·L-1Tris-HCl(pH8.0) 20mL 0.2mol·L-1
0.5mol·L-1EDTA-Na2(pH8.0) 10mL 0.05mol·L-1
NaCl 1.5g 0.25mol·L-1
β-巯基乙醇(使用之前加) 1mL 1%(V/V)
PVP-40(使用之前加) 2g 2%(W/V)
ddH2O 69mL —
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2013年9月 第33卷第9期热带农业科学
表5 落花生基因组DNA的纯度及浓度
编号 A260/A280 编号 A260/A280
浓度
/(ng·μl-1)
A01 1.91 A10 1.87 463
A02 1.92 A11 1.89 712
A03 1.86 A12 1.91 554
A04 1.87 A13 1.89 320
A05 1.93 A14 1.95 144
A06 1.88 A15 1.84 258
A07 1.90 A16 1.90 777
A08 1.89 A17 1.87 479
A09 1.87
浓度
/(ng·μl-1)
311
190
428
391
154
418
499
646
292
后在裂解液中研磨， 而该方法是直接加
液氮研磨样品 ； (3)原水浴的温度是
60℃， 该方法水浴温度调整为 65℃；
(4)增加了酚/氯仿/异戊醇(V∶V∶V＝
25∶24∶1)抽提这一步； (5)原方法加
2/3体积异丙醇沉淀， 该方法是加等体
积的异丙醇沉淀； (6)原方法是常规溶
解DNA， 该方法则以37℃水浴溶解DNA30min。
1.2.2基因组 DNA质量鉴定
1.2.2.1琼脂糖凝胶电泳检测
制备 1.0%的琼脂糖凝胶， 分别取 5μLDNA和
2μL上样缓冲液混合， 用 0.5×TBE缓冲液， 以
140V的电压电泳 30min， 并用凝胶图像分析系统
检测， 观察并拍照。
1.2.2.2核酸蛋白测定仪检测
取 1μL DNA原液 ， 用核酸蛋白测定仪测其
A260/A280及DNA的浓度。
1.2.2.3SRAP-PCR检测
以提取的落花生基因组 DNA为模板。 反应体
系： 总体积10μL， 其中2×EcoTaqPCRSuperMix5
μL， 引物(Me2： 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′， Em8：
5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′)各0.5μL(10μmol/L)，
DNA1μL(20ng/μL)， ddH2O3μL。
SRAP-PCR扩增程序： 94℃预变性 4min， 94℃
变性1min， 35℃复性1min， 72℃延伸30s， 共5个循
环； 94℃变性1min， 52℃退火1min， 72℃延伸1min，
共 35个循环； 72℃延伸 10 min； 4℃
停止反应。 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝
胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1DNA电泳检测分析
本研究应用改良的 CTAB法对落花
生基因组DNA进行提取， 所得DNA呈乳
白色， 风干后呈无色透明， 经琼脂糖凝胶电泳检
测， 结果见图 1。 17份落花生电泳点样孔无杂质，
条带清晰， 无拖尾现象， 说明所获得的DNA完整性
好， 无降解， 具有较高的浓度和较好的纯度。
2.2DNA纯度和浓度检测分析
从核酸蛋白测定结果(表 5)可知 ， DNA的
A260/A280值处于1.84～1.95， 表明所提DNA纯度高。
DNA样品浓度在 190～777 ng/μL， 能满足分子标
记、 DNA条形码等研究所需DNA的要求。
2.3SRAP-PCR检测分析
以提取的基因组 DNA为模板， 以 SRAP引物
Me2Em8进行 PCR扩增， 结果见图 2。 从图中可以
(下转第40页)
表4 TE缓冲液的配方(100mL， 加ddH2O定容)
试剂 体积 终浓度
1.0mol·L-1Tris-HCl(pH8.0) 1mL 0.01mol·L-1
0.5mol·L-1EDTA-Na2(pH8.0) 0.2mL 0.001mol·L-1
ddH2O 98.8mL—
图1 落花生基因组DNA的电泳图
M A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
图2 17份落花生DNA的SRAP引物Me2Em8扩增结果
M A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
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2013年9月 第33卷第9期热带农业科学
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(上接第36页)
看出， 17份落花生的 DNA经引物 Me2Em8扩增后，
产 生 清 晰 稳 定 且 呈 多 态 性 的 条 带 ， 可 用 于
SRAP-PCR等分子标记研究。
3 讨论
植物基因组DNA的提取方法很多， 但不同的植
物具有不同的特性， 在实践中需不断加以改进才能
得到理想的结果。 虽然不同植物材料的DNA提取方
法各异， 但总体思路都是先用去污剂将细胞膜及核
膜破裂， 然后用化学药剂将蛋白质及多糖沉淀去
除， 最后沉淀纯化 DNA[5]。 本文所用的提取方法是
在多次实验中探索， 并对前人的方法加以改进而总
结出来的， 所得 DNA质量好， 浓度高， 重复性好，
是一种快速、 简便而有效的基因组DNA小量分离方
法， 为开展分子标记、 DNA条形码等研究奠定基础。
用分光光度计检测DNA的纯度， 高纯度DNA的
A260/A280应在 1.8～2.0。 当 A260/A280小于 1.8时，
DNA样品中可能存在蛋白质污染； 当 A260/A280大于
2.0时， DNA样品中 RNA的含量较高[6]。 本研究所
得 DNA的 A260/A280处于 1.84～1.95， 表明 DNA纯
度较高， 酚类物质、 多糖、 色素、 RNA等去除比较
完全， 提取时残留的氯仿、 异戊醇、 乙醇等小分子
成分也较少。
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