全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2011 年
第 50 卷第 14 期
2011年 7 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.14
Jul．，2011
收稿日期：2011－04－28
作者简介：钟方丽（1970－），女，山东安丘人，教授，博士，主要从事天然产物化学成分及其生物活性的研究，（电话）13843226291（电子信箱）
fanglizhong＠sina．com；通讯作者，王晓林（1969－），男，副教授，硕士，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺研究，
（电话）18943241239（电子信箱）wangxiaolin69＠eyou．com。
东北铁线莲（Clematis mandshurica Rupr．）为毛
茛科铁线莲属植物，主要分布于东北及内蒙北部地
区，一般根部入药，嫩叶、地上茎可食用，东北铁线
莲中含有丰富的生物活性物质，主要用于治疗风湿
痹痛、关节不利等症状，现代药理研究表明具有多
种药理作用，如解痉、镇痛抗炎、抗肿瘤、利胆和降
血压等功效［1－3］。
总黄酮作为一类重要的天然有机化合物，因其
具有众多药理作用如抗癌抗肿瘤、 抗心脑血管疾
病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老而越来越
受到人们的关注 ［4］，木犀草素是一种重要黄酮化合
物，在自然界分布广泛，具有良好抗氧化性［5］和抗菌
性［6］，具有降低血脂和胆固醇，降压及免疫双向调节
药理作用 ［7］，可作为食品天然抗氧化剂和防腐剂开
发，具有广阔开发与应用前景。
目前关于东北铁线莲中总黄酮和木犀草素的
含量测定尚未见报道，该文建立了东北铁线莲中总
黄酮和木犀草素的含量测定方法，为东北铁线莲的
综合利用提供科学的理论依据。
东北铁线莲中木犀草素及总黄酮含量的测定
钟方丽，王晓林，黄爱珍
（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）
摘要：选用木犀草素和芦丁为对照品，采用高效液相色谱法和分光光度法分别测定了东北铁线莲中木犀
草素及总黄酮的含量，色谱柱为 Diamonsil C18（250 mm×4．6 mm，5 μm），以甲醇－0．4％磷酸溶液（30∶70，
V/V） 为流动相，流速为 1．0mL ／ min，梯度洗脱，木犀草素的检测波长为 350 nm，进样量为 20 μL，柱温 40
℃，总黄酮的检测波长为 510 nm。 结果表明，木犀草素进样浓度在 0．5~20．0 μg ／ mL 范围内线性关系良好
（r＝0．999 4），平均回收率为 99．21％，RSD 值为 2．72％；芦丁进样浓度在 8．04～48．24 μg ／ mL 范围内线性关
系良好（r＝0．999 9），平均回收率为 99．34％，RSD 值为 1．97％。 采用高效液相色谱法和分光光度法测定东
北铁线莲中木犀草素及总黄酮的含量，方法简便、准确，可以用于东北铁线莲的质量控制。
关键词：东北铁线莲；木犀草素；芦丁；高效液相色谱法；分光光度法
中图分类号：TQ244．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）14－2958-04
Determination of Luteolin and Total Flavonoids in Clematis mandshurica Rupr．
ZHONG Fang－li，WANG Xiao－lin，HUANG Ai－zhen
（School of Pharmaceutical Engineering and Chemistry， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022， Jilin，China）
Abstract： The content of luteolin and total flavonoids in Clematis mandshurica Rupr. was determined by HPLC and UV
spectrophotometry． The gradient elution mobile phase system was CH3OH－0．4％ H3PO4（30∶70，V/V） with Diamonsil C18（250mm×
4．6mm， 5 μm） column． The 20 μL sample was separated at 40 ℃ at the rate of 1．0 mL ／ min and detected at 350 nm and
510 nm respectively． The results showed that there was good linear relationship between integral value of peak area and the
content of luteolin in the range of 0．5～20．0 μg ／ mL （R＝0．999 4）． The average recovery of luteolin was 99．21％ with RSD of
2．72％． There was also good linear relationship between integral value of peak area and the content of lutin in the range of
8．04～48．24 μg ／ mL（R＝0．999 9）． The average recovery of lutin was 99．34％ with RSD of 1．97％． In conclusion， the two meth-
ods were convenient and accurate thus could be used for the quality control of C. mandshurica．
Key words： Clematis mandshurica Rupr.； luteolin； total flavonoids； HPLC； UV spectrophotometry
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2011.14.023
第 14 期
图 2 供试品溶液色谱图
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
东北铁线莲购自安徽省亳州市华申药业有限
公司；木犀草素和芦丁对照品均购自中国药品生物
制品检定所（木犀草素批号 111520－200504，供含量
测定用；芦丁批号 100080－200707，供含量测定用）；
甲醇（色谱纯，天津大茂化学试剂公司）；水为二次
蒸馏水；其余所用试剂均为分析纯。
1．2 仪器
LC－10AD 型高效液相色谱仪配备（日本岛津公
司），SPD－10Avp 紫外－可见检测器；752N 紫外可见
分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；超声波
药品处理机（济宁金百特电子有限责任公司 JBT/C－
YCL）；BP211D 型电子天平（Sartorius 公司）；RT－08
手提式高速中药粉碎机（大德乐机械有限公司）。
2 方法与结果
2．1 木犀草素含量测定
2．1．1 色谱条件 参照文献 ［8－11］分别对甲醇－水、甲
醇－0．2％（V ／ V）磷酸溶液和甲醇－0．4％（V ／ V）磷酸溶
液三种流动相进行了选择， 结果表明甲醇－0．4％
（V ／ V）磷酸溶液为流动相时，分离度为 3．158，理论
塔板数为 16 393，保留时间约为 30 min 左右，以梯
度洗脱方式对木犀草素进行洗脱， 洗脱程序为 0
min 到 15 min，40％A 到 60％A；15 min 到 20 min，
60％A到 70％ A；20 min到 30 min，70％A到 80％A；
30 min 到 35 min，80％A 到 95％A；35 min 到 45
min，95％A；45 min 到 55 min，95％A 到 30％A；55
min 到 60 min，30％A～停泵， 其中 A 为甲醇，B 为
0．4％（V ／ V）磷酸溶液。 根据以上试验结果确定色谱
条件：色谱柱 ［12］为 Diamonsil C18（250 mm×4．6 mm，
5 μm）；流动相为甲醇－0．4％磷酸溶液（V ／ V＝30∶70）；
流速： 1．0 mL ／ min，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量 20
μL，检测波长为 350 nm。 分别取对照品溶液，供试
品溶液各 20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件
测定，记录色谱图，结果见图 1、2。
本实验采用紫外分光光度计对木犀草素对照
品溶液进行全波长扫描， 以甲醇作为空白试剂，结
果木犀草素的最大吸收波长为 350 nm 与早期文献
5
4
3
2
1
0
电
压
//m
V
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
时间//min
图 1 木犀草素对照品溶液色谱图
0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02
-0.04
电
压
//m
V
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
时间//min
钟方丽等：东北铁线莲中木犀草素及总黄酮含量的测定 2959
湖 北 农 业 科 学 2011 年
报道一致［9，10］，最终确定木犀草素的检测波长为 350
nm。
2．1．2 对照品溶液的制备 取木犀草素对照品适
量，精密称定，加甲醇配制为 80 μg ／ mL对照溶液。
2．1．3 供试品溶液的制备 称取 2．0 g 东北铁线莲
药粉，加入 20 mL 甲醇，摇匀。 超声提取 45 min，静
置，冷却至室温，过滤，用 5 mL 甲醇清洗滤渣一次，
过滤，合并滤液，转移至 25 mL 容量瓶中，并用甲醇
稀释至刻度，摇匀，用 0．45 μm 微孔滤膜过滤，作为
供试品溶液。
2．1．4 方法线性范围考察 精密吸取木犀草素对
照品适量，分别配制成浓度为 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0、
10．0 和 20．0 μg ／ mL的梯度溶液，分别吸取各梯度溶
液 20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以木犀草
素对照品进样浓度 C（μg ／ mL）为横坐标，峰面积积
分值 A 为纵坐标， 绘制标准曲线。 得回归方程 A＝
666．870C＋45．787，r＝0．999 4， 结果表明木犀草素进
样浓度在 0．50～20．00 μg ／ mL 范围内呈良好的线性
关系。
2．1．5 精密度实验 精密吸取线性关系项下浓度
为 10．0 μg/mL 的对照品溶液，连续进样 5 次，测定
木犀草素吸收峰面积积分值，RSD值为 1．70％，表明
本实验精密度良好。 实验结果见表 1。
2．1．6 稳定性实验 取同一供试样品溶液，分别于
配制后 0，2，4，6，8 h 进行测定， 记录木犀草素峰的
峰面积，结果 RSD 值为 1．06％。 结果表明样品溶液
在 8 h内稳定。 实验结果见表 2。
2．1．7 重复性实验 取同一批东北铁线莲药粉，按
“2．1．3”项下的的制备方法制备 5 份供试品溶液，同
条件测定，记录木犀草素峰的峰面积，其 RSD 值为
1．21％。 说明此方法重复性较好。 实验结果见表 3。
2．1．8 加样回收率实验 称取已知含量 （30．013
μg ／ g）的东北铁线莲药粉 2．00 g，共 5 份，分别精密
加入木犀草素对照品溶液 0．75 mL，按“2．1．3”项下
的的制备方法制备 5 份供试品溶液， 按 2．1．1 色谱
条件测定， 结果表明平均回收率为99．21％，RSD 值
为 2．72％。 实验结果见表 4。
2．1．9 样品测定 取 5 份东北铁线莲药粉 ，按
“2．1．3”项下的的制备方法制备供试品溶液，按 2．1．1
色谱条件测定，测得木犀草素的含量分别为29．125、
29．020、30．788、30．348、30．578 μg ／ g， 平均含量为
29．972 μg ／ g，由此可知东北铁线莲中木犀草素的含
量较低。
2．2 总黄酮含量测定
2．2．1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品
0．201 g，加 60％（V ／ V）乙醇稀释到 100 mL，摇匀，即
得浓度为 2．01 mg ／ mL 的对照品溶液。
2．2．2 供试品溶液的制备 称取 2．0 g 东北铁线莲
药粉，精密称定，置 50 mL 容量瓶中，加入 60％（V ／
V）乙醇 20 mL，摇匀，超声提取 30 min，静置，冷却至
室温， 过滤， 滤渣重复上述超声提取过程 1 次，滤
过，滤渣用 5 mL 60％（V ／ V）乙醇清洗 1 次，过滤，合
并 2 次所得滤液，加 60％（V ／ V）乙醇定容至 50 mL，
摇匀，得供试品溶液。
2．2．3 检测波长的选择 吸取芦丁对照品溶液和
供试品溶液各 2 mL 于 25 mL 容量瓶中，加 60％（V ／
表 1 精密度实验数据
序号
1
2
3
4
5
RSD 值
保留时间//min
29.898
30.332
30.065
30.098
30.298
0.59%
峰面积//（μv·s）
6 532.42
6 663.80
6 465.80
6 734.34
6 684.70
1.70%
表 2 稳定性实验数据
测定时间//h
0
2
4
6
8
RSD 值
保留时间//min
30.998
30.532
30.165
30.032
30.132
1.31%
峰面积//（μv·s）
1 621.845
1 616.354
1 601.713
1 595.684
1 579.285
1.06%
表 3 重现性实验数据
序号
1
2
3
4
5
RSD 值
保留时间//min
29.892
30.062
30.665
29.998
30.841
1.42%
峰面积//（μv·s）
1 589.023
1 607.538
1 624.349
1 594.368
1 635.01
1.21%
表 4 加样回收率实验结果
取样量
g
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
样品含量
mg
60.026
60.026
60.026
60.026
60.026
对照品加入量
mg
60.0
60.0
60.0
60.0
60.0
测得总量
mg
117.425
118.765
121.400
120.900
119.250
回收率
%
95.67
97.90
102.29
101.46
98.71
平均回收率
%
99.21
RSD 值
%
2.72
2960
第 14 期
V）乙醇 4 mL，摇匀，静置 6 min，加 5％（m ／ V）NaNO2
0．4 mL，摇匀 ，静置 6 min，加 10％ （m ／ V）Al （NO3）3
0．4 mL，摇匀，静置 6 min，再加入 4％（m ／ V）NaOH 4
mL，摇匀，用 60％（V ／ V）乙醇定容到刻度，放置 15
min，同时作空白对照，在 400～600 nm 范围内进行
波长扫描 ［13］， 结果对照品溶液和供试品溶液均在
510 nm有最大吸收，由此确定检测波长为 510 nm。
2．2．4 方法线性范围考察 分别精密移取 0．1、0．2、
0．3、0．4、0．5、0．6 mL 芦丁对照品溶液于 25 mL 容量
瓶中，加 60％（V ／ V）乙醇 4 mL，摇匀，静置 6 min，加
5％（m ／ V）NaNO2 0．4 mL，摇匀，静置 6 min，加 10％
（m ／ V）Al （NO3）3 0．4 mL，摇匀 ，静置 6 min，加 4％
（m ／ V）NaOH 4 mL，摇匀，用 60％（V ／ V）乙醇定容到
刻度，放置 15 min，同时作空白对照，分别在 510 nm
波长处测定吸光度，以对照品浓度 C（mg ／ mL）为横
坐标，吸光度 A为纵坐标，绘制标准曲线。 求得回归
方程 A＝11．748C＋0．003，r＝0．999 9，结果表明芦丁进
样浓度在 0．008 04～0．048 24 mg ／ mL 范围内呈良好
的线性关系。
2．2．5 精密度实验 吸取标准曲线项下浓度为
0．016 08 mg ／ mL 的芦丁对照品溶液 2 mL，按“2．2．4”
项下方法连续测定 5 次吸光度， 记录数据， 结果
RSD值为 0．95％，精密度良好。
2．2．6 稳定性实验 称取 2．0 g东北铁线莲药粉，精
密称定，置 50 mL 容量瓶中，按“2．2．2”项下方法配
制供试品溶液，按“2．2．4”项下方法，分别于配制后
0、30、60、90 和 120 min 测定吸光度，RSD 值计算结
果为 1．62％，表明供试品溶液在实验条件下 120 min
内基本稳定，可满足测定要求。
2．2．7 重复性实验 取同一批东北铁线莲药粉，按
“2．2．2”项下的制备方法制备 5 份供试品溶液，依法
测定吸光度，结果 RSD值为 1．39％，重复性较好。
2．2．8 加样回收率实验 称取已知含量（4．425 mg/g）
的东北铁线莲药粉约 2 g，共 5份，精密称定，分别精
密加入芦丁对照品溶液 2．0 mL，按“2．2．2”项下的制
备方法制备 5 份供试品溶液，按“2．2．4”项下方法测
定吸光度， 结果表明平均回收率为 99．34％，RSD 值
为 1．97％。 实验结果见表 5。
2．2．9 样品测定 取 5 份东北铁线莲药粉 ，按
“2．2．2”项下的的制备方法制备 5 份供试品溶液，按
“2．2．4”项下方法测定吸光度，结果测得总黄酮的含
量分别为 4．437、4．424、4．406、4．397、4．437 mg/g。
3 讨论
3．1 高效液相色谱法检测波长的选择
文献报道，采用高效液相色谱法测定木犀草素
含量时，一般分别在 350 nm［9，10］，254 nm［11］的检测波
长条件下进行了研究，本实验采用紫外分光光度计
对木犀草素对照品溶液进行全波长扫描，以甲醇作
为空白试剂， 结果木犀草素的最大吸收波长为 350
nm， 根据实验结果和参考文献确定 350 nm 为本实
验的检测波长。
3．2 高效液相色谱法分离柱的选择
根据参考文献［12］，选择的色谱柱为 Diamonsil C18
（250 mm× 4．6 mm，5 μm，）。
3．3 高效液相色谱法供试品溶液制备方法的选择
根据所查阅的文献［8］，本实验以甲醇为溶剂，分
别对热回流法、索氏提取以及超声提取 3 种提取方
式进行选择。 结果热回流法木犀草素峰面积、拖尾
因子分别为 720．906、2．071，索氏提取法木犀草素峰
面积、拖尾因子分别为 637．400、2．179，超声提取法
木犀草素峰面积 、 拖尾因子分别为 1 552．300、
1．572，根据木犀草素的峰面积、拖尾因子确定超声
提取为较佳的提取方法，并在此基础上进行了超声
次数、超声时间进行了探索。
3．3．1 超声次数的选择 本实验考察了超声次数
对提取效果的影响， 精密称取 2．0 g 东北铁线莲粉
末，提取 2 次，每次加入 20 mL 甲醇，每次超声提取
45 min，过滤，分别收集 1、2 次提取液，将各次提取
液分别置于 25 mL 容量瓶中， 加甲醇定容至刻度，
摇匀。 用微孔滤膜（0．45 μm）过滤，取滤液作为供试
品溶液，按正文色谱条件进行含量测定，第 1 次提
取液测得的木犀草素峰面积 1 698．056，第 2 次提取
液在相应的保留时间处没有吸收峰， 由此可见第 2
次的提取量已经很小，故将提取次数确定为 1次。
3．3．2 超声时间的选择 在超声次数对提取效果
的影响实验的基础上，进一步考察了超声时间对提
取效果的影响， 精密称取 2．0 g东北铁线莲粉末，加
入 20 mL 甲醇提取 1 次，分别超声 30、35、40、45、50
min，过滤，分别收集提取液，将各提取液分别置于
25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔
滤膜（0．45 μm）过滤，取滤液作为供试品溶液，按上
述色谱条件进行含量测定，木犀草素峰面积分别为
573．905、786．923、 1 230．563、 1 635．158、 1 642．330，由
表 5 回收率实验结果
取样量
g
2.00
1.98
2.00
2.01
2.02
样品含量
mg
8.85
8.76
8.85
8.89
8.94
对照品加入量
mg
4.02
4.02
4.02
4.02
4.02
测得总量
mg
12.745
12.692
12.851
12.957
13.010
回收率
%
96.89
97.81
99.53
101.17
101.24
平均回收率
%
99.34
RSD 值
%
1.97
钟方丽等：东北铁线莲中木犀草素及总黄酮含量的测定 2961
湖 北 农 业 科 学 2011 年
剂用量对高吸水性树脂吸液倍率的影响。 分别取
1．00 g ／ L N，N′－亚甲基双丙烯酰胺溶液 2、3、4、5 和
6 mL，所制得的纤维素基高吸水性树脂对去离子水
和生理盐水的吸液倍率结果如图 3所示。 当交联剂
的用量为 3 mL 时， 对去离子水和生理盐水的吸液
倍率分别为 477．8和 69．5 g ／ g。这是因为在交联的初
期， 纤维素逐渐与单体接枝共聚形成网络空间，网
络间 Na＋的浓度处于动态的增大过程， 与环境中的
Na＋形成浓度梯度而产生渗透压，正是渗透压的作用
使水分子由 Na＋浓度低的水体中进入 Na＋浓度高的
网络空间中，所以吸液倍率逐渐增大。 当网络内外
的渗透压为零时，吸液倍率达到最大。 随交联剂用
量的进一步增大，网络间电荷密度增大，电荷间的
相互排斥作用也使水分子很难进入，所以吸液倍率
反而降低。
3 结论
微波法合成纤维素基高吸水性树脂的较优工
艺条件为羧甲基纤维素钠 1．00 g，pH 值为 6．5 的丙
烯酸 6 mL， 去离子水 10 mL，1．00 g ／ L N，N－亚甲基
双丙烯酰胺溶液 3 mL，硝酸铈铵 0．25 g，微波低火加
热 5 min。 所合成的高吸水性树脂对去离子水和生
理盐水的吸液倍率最高分别可达 478.2 和 69．5 g ／ g。
试验采用了微波自由基溶液聚合法，聚合时间只需
5 min，与文献［1］报道的 1～3 h 相比，大大缩短了生
产周期，是一种值得推广的高吸水性树脂的合成方
法。
参考文献：
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［3］ 何天白． 功能高分子与新技术 ［M］． 北京： 化学工业出版社，
2001．523－555．
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图 3 交联剂用量对高吸水性树脂吸液倍率的影响
600
500
400
300
200
100
0
吸
液
倍
率
//g
/g
对去离子水的吸液倍率
对生理盐水的吸液倍率
2 3 4 5 6
交联剂用量//mL
（责任编辑 郑 威）
（上接第 2949页）
（责任编辑 周有祥）
结果可知木犀草素的峰面积随着提取时间的增加
而增加，但是当时间增加到 45 min 时，峰面积变化
很小，故将超声提取时间确定为 45 min。
本实验建立的总黄酮和木犀草素含量测定方
法操作简便，方法精密度高，重复性及线性关系良
好，回收率较好，对于评价东北铁线莲的内在质量
具有一定的参考意义。
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