全 文 ：H P LC测定 四方篙中总木犀草素普的含量
汪凤梅 ’ · 2 .姚彤炜 ’ , 曾苏’ ( } . 浙 、 l_ 大学药 华院药物 分析研究室 , 浙江_ 杭州 3 !田 3 1 ; 2 浙 ; l _ 大学防学院附属 妇 ,耳礴医院 浙 、时 J: 州
3 1〔XX汤 )
摘要 : 目的 建立 用反相高效液相 色谱 法侧 定四 方篙提取浸膏中主要黄酮 普 (术犀草素 )含量的 方法 方法 以 OD S :(l 、 柱 为
分析柱 , 川! 2 . 0 磷酸缓冲液 一四 氮 口夫喃 一异 丙醉 (7() : 3:0 5 )为流动相 , 检测波长为 3印 fl m 结果 该黄酮 水解后的等元一 一 木犀
草素线性 关系良好 , 在高 、 中 、低浓度的 日 内精密度分别是 2 . 82 % , 3 . 41 铸 , 5 . 17 % ; 日间精密度分别 是 2 . 56 铸 , 5 . 46 % , 6 . 87 件 ;
标准 曲线线性 0 .哟 9 ; 检 测 限为 50 : l g lj ’ , 定量 限 为 ( 2 . 40 土 0 . 13) )华 · 1 一 ’ , 方法 回 收 率为 高 、 中 、 低 分别 是 101 . 2 8 铸 ,
105
.
58 %
,
95
.
56 呢 结论 木犀草素等含量为 ( 3 . 12 土 0 . 】5) 铸 此法操作 简便 , 准确率 、 灵敏度高
关键词 :四方篙 ;木犀草素 ; 高效液相 色谱
中图分类号 : 2H 84 . 2 文献标识码八 文章编号 : ! 0 1 一 24 94 ( 20 5) 08 一既 18 一 03
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12 士 0
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15 ) %
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四方`篙又称 四棱篙 ( Ehls 叻 a 女 bla诫 Ben t h ) , 为
唇形科香莆属多年生草本植物 , 产于云南西南部至
东南部温热地区 、贵州东南部 、广西的西部及四川等
地 资源 十分丰富 , 其叶 、 花或全草均可人药 , 用于
治疗感冒 、 痢疾 、 肝炎等病症 , 哈尼族用于治疗眼疾
病及呼吸道感染 , 其疗效甚佳 。 为了合理开发利用
天然药物资源 ,张蔚玲 ’ 一 2 ;等提取 分离出其花序所
含化学成分 , 主要是木犀草素营类黄酮昔 。 为 J’ 进
一步研究该植物 中这类化学成分 ,指 导新药的开发
研究 , 本实验对四方篙中木犀草素的含量测定方法
进行了研究 , 建立 了准确精密的含量测定方法 , 并用
于指导其提取工艺的优化和浸膏的测定 。
1 仪器和试药
日本岛津高效液相色谱仪 , 包括 1 1) 一 10 A T 双
分别为 0 . 3 63 和 0 . 2醉 一 该方法快速 、 准确 、 无需复
杂的样品预处理 、无污染以及无样品试剂的消耗 ,有
望用于积壳提取液纯化生产过程快速分析 。
参考文献
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(收稿日期 : ZJ 瞬一胎一 24 )
基金项 目 : 浙江省自然科学基金 ( 3 02 6 82)
作者简介 :们几凤梅 , 女 .硕 于_ , 主管药师 朴 l : ( 05 7】)8 7肠 1501 一6 525 E一ma i l : fn l w an g@ e y o u . (、 o n l
61 8
·
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2之及〕5 劫 ilr , 饰1 . 40 、 0 . 习 中国药学杂志 20 5 年 4 月第 4o 卷第 8 期
泵 、SP D一 IO A可见紫外检测器 、 712 5型手动进样阀 、
0 5匹 进样管 ;2 N0 色谱工作站 (浙江大学智能信
息工程研究所 ) ;电热恒温水浴锅 (上海医疗器械五
厂 ) ;80 一 2 离心机 (上海手术仪器厂 ) ;四方篙花序
提取浸膏 ,木犀草素一 3 `一葡萄糖昔对照品 (浙江大学
药学院生药研究 中心 ) , 木犀草素对 照品 (S i g l l a ,
S t
. 助 u is , M O , U SA ) 。
2 实验方法
2
.
1 色谱条件
色谱柱为 Y琪毛 1C 8 一OD S 柱 ( 6 ~ x Zo ~
,
5
拜m ;) 流动相 由磷酸缓冲液 ( p H = 2 ) 一四氢吠喃 一异丙
醇 ( 70 : 30 : 5) 组成 , 流速 : 0 . 70 fnL
·
m i n
一 ’ , 灵敏度 :
0
.
0 1 0 AU F’S ,紫外检测波长 360 nl ,柱温 : 25 ℃ 。 在
此色谱条件下木犀草素一 3 ` 一葡萄糖昔的保留时间为
6
.
4 m in
,木犀草素的保留时间为 17 . 9 m in ,见图 1。
比足比
10 1 5 2 0 2 5
I 】1 1m
, 尸 r ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ . , e
. .甲 . . . . , , . . . .一 甲~ ~ ,~ ~ ,一 , ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ ,一 ` . , . 尸. . . . 尸 . . . . , , . . , . . 甲一一 , ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ , 尸3 0 0 5 10 1 5 2 0 2 5 30 0 5 10 】5 2 0 2 5 刃 0 5 10 1 乡 2 0 2 5 3C
l / m m t / m 川 I z m m
上三
20
,
40
,
10
,
2 0
,
4以〕 滩 · nrL 一 ’ 不 同浓度的溶液 , 按
,’2 . 2 . 3” 方法进行水解后进样得色谱图 , 以昔的浓度
( X )作为横坐标 , 其昔元的峰面积 ( 州作为纵坐标进
行线性 回 归 。 结 果 回归 方 程 为 : Y = 17 仪珍X +
l 以 3 . 7( : = 0 . 9 9 9 ) 。 结果表明 , 木犀草素一 3 ` 一葡萄
糖昔在 2 一 4以〕 z唱 · nrL 一 ’ 内线性关系良好 。
3
.
2 检测限与定量限
制备木犀草素对照品液 , 逐步稀释进样 。 当信
噪比为 :3 1 时 ,木犀草素的最低检测浓度为 50 gn ·
m L
一 ’ 。 定 量 限 为 ( 2 . 40 士 0 . 13 ) 拌g · m L 一 ’ , RS D 二
5
.
4 2%
, n 二 5 。
.3 3 精密度实验
配制高 、 中 、低 3 个浓度 ( 5 , 80 , 3 17 拼g · mL 一 ’ )木
犀草素一 3 ` 一葡萄糖昔对照品溶液各 5 份 ,并与标准曲
线同时进行水解测定 , 所测结果代人标准曲线 , l d
内测定 5 次 ,计算 日内精密度 ,连续测定 s d ,计算日
间精密度 ,结果显示精密度较好 。 见表 1。
表 1 四方篙中木犀草素测定的精密度实验 . n 二 5
T a b 1 1
〕渊 {i s io n fo r as as y of lut eo li n in E BB E . n = 5
图 1 木犀草素色谱图
A 一 木犀草素一 3 ,一葡萄糖昔对照品 : B 一 木犀草素对照品 ; C 一 四方篙浸膏色谱
图 ; D 一 四方篙浸膏水解后色谱图 ;卜 木犀草素一 3 , 一葡萄糖昔 ; 2 一 木犀草素
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l 一 lu et n石n 一 3 ’ 一日~ 。 ide ; 2一 l u l(” ii n
2
.
2 测定方法
2
.
2
.
1 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素一 3 ` -
葡萄糖昔对照品适量 ,用甲醇溶解 、 定量稀释成浓度
为 1 . g mg · mL 一 ’ ,待用 。
2
.
2
.
2 供试品溶液的制备 称取浸膏 85 . 4 m g , 用
25 %盐酸和 95 % 乙醇混合液 ( 1 : 1 ) 12 mL 溶解 ,作为
供试品溶液 。
2
.
2
.
3 测定样品 分别取上述供试品溶液各 Z mL
于 5 支试管 , 再配制 5 , 20 , 40 , 80 , 160 咫 · m L 一 `的木
犀草素 一3 ` 一葡萄糖昔对照品系列浓度 , 一起在 85 ℃
水浴中水解 l h ,用微孔滤膜 ( 0 . 45 脚 )滤过 ,取续滤
液用流动相定量稀释后取 20 拜L 进样 ,色谱图见图
1
,由标准曲线算得浸膏中木犀草素昔的含量为
( 3
.
12 土 0
.
15 ) %
, n = 5
。
3 方法学考察
3
.
1 线性关系
分别精密吸取一定量木犀草素一 3 ` 一葡萄糖昔 对
照品溶液 ,用 9 5% 乙醇和 2 5% H C I( l : l )稀释成 2 , 5 ,
中国药学杂志 2田 5 年 4 月第 40 卷第 8 期
浓度
/ 子侣 · 间 一 I
口内平均值
/滩 · ml 一 !
口内 E S I )
/ %
日间平均值
/滩 · mI 一 l
日间 RS D
/ %
票
4
.
72 5
.
17 4
.
67 6
.
87
79
.
% 3
.
41 75
.呢 5 .奶
328
. 田 2 . 82 3 14 2 2 . 56
.3 4 加样 回收实验
在一定量的已知浓度的木犀草素一 3 ` 一葡萄糖昔
浸膏溶液 中添加 3 个浓度水平的木犀草素一 3 ` 一葡萄
糖昔对照液 , 同时制作标准曲线 ,按 “ 2 . 2 . 3 ” 方法水
解进样 , 由标准曲线求出总昔浓度 , 计算木犀草素-
3
’ 一葡萄糖昔的加样回收率 ,结果见表 2 。
表 2 木犀草素一 3气葡萄糖普的加样回收率 . n = 5
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u teol i
n 一
3
’ 一
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n
E B B E
.
n = 5
浸膏浓度
/滩 · mL 一
添加量
/滩 · inI 厂 .
测得量
/滩 . m】一 1
平均值
/滩 · mI 一 」
13
.
5 1 士 0
一
68
平均回收率
/ %
DRS%/一501
14
.服
13
.
48
13
.
52
! 2
.
42
14
.
13
136
.
8
134
.
3
14 1
.
3
巧 1 . 7
138
.
9
283
.
8
28 3 4
25 5
.
0
274
.
3
283
.
6
l4() 士 7 4
.
7 8 105
,
58
286
土 13 4
.
37 101
.
28
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n 了, 2仪万 月那口 , 脚 . 40 oN , 8
红花水溶性多糖的分离 、 纯化及初步研究
霍贤 , 梁忠岩 ` , 张雅君 , 张旭 , 张丽霞 (东北师范大学生命科学院 , 吉林 长春 1302 4
摘要 : 目的 从红 花中提取水溶性粗多糖 , 进一步纯化 ,得到均一的 多糖 CrP , 并研究其组成和性质 方法 粗多糖经反复冻
融 、 , 份罗 法脱蛋白 、超滤 、柱色谱等方法分离纯化得到 c ll〕 _ 经 比 旋光度测定 、 HIP￡ 等方法检验其均一性 结果 c PT 为 均
一组分 , C C 分析其单糖组成为 ;(I 。 和 (;al , 摩 尔比为 6 . 08 : 1 _ 结论 CTP 为中性杂多糖 , 相对分子质量 4 侧减) 一 5 《X减)
关键词 :红花 ; 多糖 ; 分离 ; 组成
中图分类号 : Q5 39 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 24 94 ( 20 5) 08 一肠20 一 03
旋p a ar it o n , p u ir if ca 6 on an d i in t ia l r侧张级 r c h of aw et 卜 sol ub le pol y as c c h a ir de C T P fr o m 〔 h角俪明us 功忿c ot ir us
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A B S T R A〔了 : O B J E C r I V E ` n , 、 ,! ) r a in a h`) n :卿 , l e ( ,、 ,、 详 )ly 、 a 。、 、 h a ir d e Cl ,P ( a w at e -r 、 o lu b ]e 即 ly as 。。 h a ir d e f(r )m aC rt ha m o t i侧 `, ir ,。 1 . )
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e t io n a r e 〔1 by ul t r a l; l tar t io n a n d 罗 1 e hor m at o g l l l沙y , th e 耐 e -r 、 ) lhu le 即 ly s a ( 、 ( h a石d e C f F〕 w a s ` , I, t a in e d . hT e h o m o g o n o i t 、 w邵
p or v e d b y
s伴 e iif c 《 ) p t i (、 a l or t a t io n m e a s 、一er m e 一I t a n ( { H IP C m e thed . 侧路 t LJ I S C l 、 P ~ hom g
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m o la r ar t io 、 ,f 6
.
08
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,
C ( ) N ( 工t )5 10 卜 CTP i、 a n e u talr h e t e or 伪 ly sa e c防d e a n d i t s m o le o u la r w e igh t is a肠 : ,t 4 (X兀) 一 5 (X斑) .
KE Y WO RI 粥 : aC rt人口 n 三娜 21耀ot ir 出 L . ; 沪 ly 、 a。 。 h a ir ole ; i s ol a t io n ; f · o mOP s irio n
红花 ( aC 此产及朋 io it 、 ot ir o L . )为菊科红花属 1年
生草本植物的干燥花 其性辛 、温 。 人心 ,肝经 。 活
血通经 、 去痰止痛 一 ’ 」 ; 属卫生部公布的药食同源 中
药 ,可以用于食品和保健食品的开发和利用 [2 「 _ 红
花多糖也是红花的有效成分之一 , 能促进淋巴细胞
转化 ,增加脾细胞对羊红 细胞空斑形成的细胞数 ,
4 讨 论
4
.
1 色谱条件
在测定 中我们曾探索直接测定浸膏中各昔 ,但
由于几个主要昔的结构相近 ,分离很困难 ,而它们水
解后主要是木犀草素 ,我们通过测定总木犀草素来
求总木犀草素昔的含量 。 实验中发现浸膏在没有水
解之前有些具有极少量木犀草素存在 , 但因定量困
难 , 我们忽略不计 。
在流动相配 比 、 进样量等其他条件不变的情况
下 , 采用不同检测波长来测定昔元峰面积 ,结果表明
在 360 nm 处昔 元峰面积最大 , 吸收最好 , 采用 360
lnr 为检测波长 。 比较了不同酸度 , 相同配比的流动
相 ,结果表明浸膏在 p H 2 . 0 浓度 0 . 01 mo l · L 一 ’ 磷酸
氢二钠缓冲液中峰形较好 ,为了减少拖尾 ,我们对流
动相的比例进行了不断调整 , 最后确定为 0 . ol mo 卜
I
一 `磷酸氢二钠缓冲液 (磷酸调 p H 2 . 0) 一四氢吠喃 -
异丙醇 = 70 : 30 : 5
4
.
2 水解条件
4
.
2
.
1 水解酸强度的选择 向 5 管相同体积 、 相同
浓度浸膏溶液中分别加人 2 , 3 , 4 , s m 。一 L 一 ’ 25 %
H CI 各 0 . 5 m L , 水解后比较木犀草素昔元峰面积 , 发
现用 25 % HCI 的昔元峰面积最大 。
.4 2
.
2 水解温度的选择 配置相同浓度和酸度的
5 管溶液 , 分别放人 70 , 75 , 80 , 85 , 90 ℃ 水浴 中加热
水解 。 结果发现 85 ℃时昔水解得彻底 , 温度再高木
犀草素昔元峰面积趋于减少 ,故选这个温度 。
4
.
.2 3 水解时间的影响 配置相 同浓度和酸度的
5 管溶液 ,在 55℃ 水浴分别加热 30 , 60 , 120 , 180 , 30
m in
,观察水解状况 ,发现 60 m in 时木犀草素昔元峰
面积最大 。
参考文献
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(收稿日期 : 2侧只一哄一 30)
作者简介 : 霍贤 , 女 , 在读硕士 通讯作者 : 梁忠岩 , 男 , 教授 eT l : (以 3 1 ) 57 (期 ) 39 E 一~ 卜 Iy4Z 2 @ y曲o
,
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.
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62 0
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,
2伙巧助 irl , Vol . 40 场 . 8 中国药学杂志 2田5 年 4 月第 40 卷第 8 期