全 文 ：　ＪＯ
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２０１１
中
药
研
究
湖州铁线莲多糖的分离纯化及体外抗肿瘤活
性研究
赵伟春　李　莉　沈贵芳　郭　伟
浙江中医药大学生物工程学院　杭州　３１００５３
摘要：［目的］分离纯化湖州铁线莲粗多糖（ＣＨＴＰ）并测定其体外抗肿瘤活性。［方法］采用ＤＥＡＥ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换层析和
Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶过滤层析分离纯化ＣＨＴＰ；采用 ＭＴＴ法测定ＣＨＴＰ及经纯化后多糖（ＣＨＴＰＩＩ－１）对体外培养的人肝癌细
胞 ＨｅｐＧ２、人胃癌细胞 ＭＧＣ８－０３和人白血病细胞Ｋ５６２等三种肿瘤细胞的抑制作用。［结果］经分离纯化获得多糖组分ＣＨＴ－
ＰＩＩ－１；在ＣＨＴＰ浓度为２５０～１０００ｍｇ·Ｌ－１或ＣＨＴＰＩＩ－１浓度为１２５～５００ｍｇ·Ｌ－１的检测范围内，ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对 ＨｅｐＧ２、
ＭＧＣ８－０３和Ｋ５６２三种细胞的抑制率均随着多糖浓度的增大而增大。除了 ＭＧＣ８－０３细胞６２．５ｍｇ·Ｌ－１　ＣＨＴＰＩＩ－１处理组和
Ｋ５６２细胞１２５ｍｇ·Ｌ－１　ＣＨＴＰ处理组的 ＭＴＴ检测ＯＤ值与阴性对照组间无显著差异外，其余各组的 ＭＴＴ检测ＯＤ值均显著或
极显著低于阴性对照组。［结论］ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对 ＨｅｐＧ２、ＭＧＣ８－０３和Ｋ５６２等三种肿瘤细胞均有较强的抑制作用，且其
抑制率与多糖浓度呈良好的量效关系。
关键词：湖州铁线莲；分离纯化；多糖；体外抗肿瘤
中图分类号：Ｒ２８２．７１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５－５５０９（２０１１）０２－０２４０－０４
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｃｌｅｍａｔｉｓ　Ｈｕｃｈｏｕｅｎｓｉｓ
Ｔａｍｕｒａ　Ｚｈａｏ　Ｗｅｉｃｈｕｎ，Ｌｉ　Ｌｉ，Ｓｈｅｎ　Ｇｕｉｆａｎｇ，ｅｔ　ａｌ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ（３１００５３），Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｃ．ｈｕｃｈｏｕｅｎｓｉｓ　Ｔａｍｕｒａ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅｉｒ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉ－
ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍＣ．ｈｕｃｈｏｕｅｎｓｉｓ，ｎａｍｅｄ　ＣＨＴＰ，ｗａｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２
ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ　ａｎｄ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００ｇｅｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＣＨＴＰ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．Ｔｈｒｅｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＨｅｐＧ２，ＭＧＣ８－０３ａｎｄ　Ｋ５６２ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
ｅｆｆｅｃｔ．［Ｒｅｓｕｌｔｓ］Ａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ，ｎａｍｅｄ　ＣＨＴＰＩＩ－１，ｗａｓ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＨＴＰ　ｗａｓ
２５０～１０００ｍｇ·Ｌ－１　ｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＨＴＰＩＩ－１ｗａｓ　１２５～５００ｍｇ·Ｌ－１，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＣＨＴＰ　ｏｒ　ＣＨＴＰＩＩ－１ｏｎ
ＨｅｐＧ２，ＭＧＣ８－０３ａｎｄ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＯＤ　ｖａｌｕｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｘｃｅｐｔ　ｆｏｒ　ＭＧＣ８－０３ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　６２．５ｍｇ·
Ｌ－１　ＣＨＴＰＩＩ－１ｏｒ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１２５ｍｇ·Ｌ－１　ＣＨＴＰ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｂｏｔｈ　ＣＨＴＰ　ａｎｄ　ＣＨＴＰＩＩ－１ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ
ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ
ｔｅｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｈｕｃｈｏｕｅｎｓｉｓ　Ｔａｍｕｒａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　　基金项目：浙江省中医药科技计划项目（Ｎｏ：２００８ＹＢ００１）；浙江中医药大学科研项目（Ｎｏ：２００７０６）
Ｆｕｎｄ　ｐｒｏｊｅｃｔ：Ｉｔｅｍ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　ＴＣＭ　Ｓｃｉ－ｔｅｃｈ　Ｐｌａｎ（Ｎｏ：２００８ＹＢ００１）；ｉｔｅｍ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｓｃｉ－ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｏ：２００７０６）
　　湖州铁线莲（吴兴铁线莲）（Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｈｕｃｈｏｕｅｎ－
ｓｉｓ　Ｔａｍｕｒａ），又名金剪刀，为毛茛科铁线莲属植物，
主产于浙江。味辛、咸、微苦，性温［１］，其具有抗癌、
祛风湿、解毒、消肿止痛等作用。湖州铁线莲具有较
好的民间应用基础，临床治疗肿瘤也有较满意的疗
效［２］。为了探究湖州铁线莲多糖的抗肿瘤活性，本文
在实验室自制湖州铁线莲粗多糖的基础上，进一步进
行离子交换层析和凝胶过滤层析得到精多糖，并对两
种多糖进行了体外抑癌实验，为湖州铁线莲的临床应
用提供科学依据，现报告如下。
１　材料和方法
１．１　材料
１．１．１　多糖　ＣＨＴＰ冻干粉，由本实验室制备。
１．１．２　细胞株　人肝癌细胞 ＨｅｐＧ２、人胃癌细胞
ＭＧＣ－８０３、人白血病细胞Ｋ５６２由浙江中医药大学动
物实验中心惠赠。
１．１．３　主要试剂　ＲＰＭＩ－１６４０培养基（美国 ＧＩＢ－
ＣＯ公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有
限公司）；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；
青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）；二甲基亚
砜（ＤＭＳＯ，无锡海硕生物有限公司）；０．２５％胰蛋白
酶（杭州吉诺生物医药技术公司）；５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ，
上海旭东海普药业有限公司）；预溶胀离子交换纤维
素ＤＥＡＥ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２（Ｗｈａｔｍａｎ进口分装）；葡聚糖
凝胶Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００（Ｐｈａｍａｃｉａｌ进口分装）。
１．１．４　主要仪器　ＭＣ９９－３型自动液相色谱分离层
析仪（上海青浦沪西仪器厂）；ＴＵ１９００型双光束紫外
可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；
ＦＤｕ－２１００型真空冷冻干燥仪（德国ＥＹＥＬＡ公司）；
ＳＷ－Ｃ１－２ＦＤ型超净工作台（上海博讯实业有限公司）；
０４２
浙江中医药大学学报２０１１年３月第３５卷第２期　
DOI:10.16466/j.issn1005-5509.2011.02.038
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Ｔｈｅｒｍｏ３１１１型ＣＯ２细胞培养箱（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；
Ｎｉｋｏｎ／ＴＥ２０００－Ｓ型倒置荧光相差显微镜（日本尼康公
司）；ＢＩＯ－ＲＡＤ／６８０型酶标仪（美国伯乐生命医学产品
有限公司）；Ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ超纯水仪（美国 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司）。
１．２　方法
１．２．１　多糖的ＤＥＡＥ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换层析　
将冷冻干燥的ＣＨＴＰ粉末溶于超纯水中，配成２０ｇ·
ｍＬ－１溶液，漩涡振荡，于５０℃水浴３０ｍｉｎ，使其充分
溶解。然后１５０００ｒ／ｍｉｎ，离心１２ｍｉｎ，取３ｍＬ上清上
样，层析柱（１．６×５０ｃｍ），柱床体积（ＢＶ）为７０ｍＬ。
先用超纯水完全洗脱中性多糖，再用０～０．７ｍｏｌ·Ｌ－１
的ＮａＣｌ溶液以１ｍＬ·ｍｉｎ－１流速线性梯度洗脱，利用
自动部分收集器每５ｍｉｎ收集一管，以苯酚－硫酸法跟
踪检测，绘制洗脱曲线，根据出峰情况，合并各主峰所
对应的洗脱液，浓缩。
１．２．２　多糖的Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶过滤层析　将
处理好的Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶减压抽气，装柱（１．６
×５０ｃｍ），柱床体积（ＢＶ）为７５ｍＬ，用５倍体积的
０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ进行平衡。将离子交换层析所得
组分的浓缩液以１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ，取上清液
２ｍＬ上样，用０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ以０．２５ｍＬ·ｍｉｎ－１
的流速洗脱，每３ｍＬ收集一管，用苯酚－硫酸法检测，
绘制洗脱曲线，合并主峰所对应的洗脱液，浓缩，透
析，冷冻干燥。
１．２．３　多糖的体外抗肿瘤活性研究　将 ＨｅｐＧ２、
ＭＧＣ８－０３、Ｋ５６２细胞分别用含青霉素、链霉素、１０％
新生牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养液制备成６×１０４～１
×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，加入到９６孔细胞培养板
中，每孔１００μＬ。设空白对照组、阴性对照组、阳性
对照组和多糖不同浓度给药组，每组６个复孔，置
ＣＯ２培养箱内培养过夜。细胞贴壁后，给药组分别加
入１００μＬ用培养液配制的不同浓度的 ＣＨＴＰ和
ＣＨＴＰⅡ－１；阳性对照组加１００μＬ５－氟尿嘧啶使其终
浓度为１００ｍｇ·Ｌ－１；阴性对照组加１００μＬ培养液；空
白对照组不加细胞只加２００μＬ培养液。各组加入药
物培养６８ｈ后，加入２０μＬ５ｇ／Ｌ　ＭＴＴ溶液，于３７℃、
５％ＣＯ２培养箱内反应４ｈ。小心吸弃上清，加入ＤＭ－
ＳＯ１５０μＬ／孔，剧烈震荡１０ｍｉｎ。在酶标仪上测定
ＯＤ值（λ＝５７０ｎｍ）。
１．２．４　数据处理及统计分析　实验结果用均数±
标准差（ｘ±ｓ）表示，多糖给药组、阳性对照组与阴性
对照组间差异的显著性比较用ｔ检验。按下式计算
细胞增殖抑制率：
细胞增殖抑制率（％）＝
对照组ＯＤ－实验组ＯＤ值
对照组ＯＤ值 ×１００％
将多糖对肿瘤细胞的抑制率与多糖浓度进行线
性回归分析，并通过ＩＣ５０软件１．０．０版本计算ＣＨＴＰ
和ＣＨＴＰＩＩ－１对各个细胞株的ＩＣ５０值。
２　结果
２．１　多糖的ＤＥＡＥ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换柱层析　
ＣＨＴＰ经离子交换层析柱线性梯度洗脱后，获得了
较好的分离，见图１，得到水洗部分的两个小峰，因没
有完全分开，统一称作ＣＨＴＰＩ，还得到了一个较大的
酸性多糖峰，称为ＣＨＴＰＩＩ。经计算，ＣＨＴＰＩ、ＣＨＴ－
ＰＩＩ的含糖量分别占上样量的２１．７５％和６７．５９％。
将ＣＨＴＰＩＩ部分的主峰合并，浓缩。
图１　ＣＨＴＰ的离子交换层析洗脱曲线
２．２　 多糖的 Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００ 凝胶过滤层析 　
ＣＨＴＰＩＩ部分的浓缩液经凝胶过滤后，获得较好分
离，结果见图２。将图２中第一个主峰所对应的第９－
１６管合并，进行浓缩、透析、冷冻干燥后得一多糖组
分，命名为ＣＨＴＰＩＩ－１。经计算该组分所含多糖占凝
胶过滤层析上样时总多糖含量的８２．０２％，若从离子
交换层析上样量开始折算，则为５１．０９％。
图２　ＣＨＴＰⅡ的Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶过滤层析洗脱曲线
２．３　多糖的体外抗肿瘤活性研究
２．３．１　多糖对 ＨｅｐＧ２细胞的抑制作用　在测定浓
度范围内，ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰⅡ－１处理 ＨｅｐＧ２细胞组
的 ＭＴＴ检测ＯＤ值均极显著低于阴性对照组（Ｐ＜
０．０１），结果见表１。随着给药剂量的增大，抑制率也
增大，即呈明显的量效关系，见图３。当ＣＨＴＰ终浓
１４２
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度为１０００ｍｇ·Ｌ－１、ＣＨＴＰＩＩ－１终浓度为５００ｍｇ·Ｌ－１
时，其对 ＨｅｐＧ２细胞的抑制率分别为６２．０３％和
５４．１８％。其中，ＣＨＴＰＩＩ－１对 ＨｅｐＧ２细胞的抑制率
与浓度之间呈良好的线性关系，线性回归方程为 Ｙ
＝０．１１２７Ｘ＋４．９２９６（ｒ＝０．９９８４）。ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰ
Ⅱ－１对 ＨｅｐＧ２细胞的ＩＣ５０分别为９２６．１４ｍｇ·Ｌ－１和
３９５．６６ｍｇ·Ｌ－１。
表１　ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰⅡ－１对肿瘤细胞抑制作用的 ＭＴＴ法检测ＯＤ值（ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 浓度（ｍｇ·Ｌ－１） ＨｅｐＧ２ ＭＧＣ８－０３ Ｋ５６２
ＣＨＴＰ　 １０００　 ０．５５４±０．０５３＊＊ ０．１６６±０．０２３＊＊ ０．３０７±０．０６９＊＊
５００　 ０．８３７±０．１３０＊＊ ０．５７１±０．０３１＊＊ ０．７８７±０．０９５＊＊
２５０　 ０．８９２±０．０５２＊＊ ０．７６６±０．０３９＊＊ １．２１６±０．０６１＊＊
１２５　 １．０５３±０．０２４＊＊ ０．８９０±０．０３０＊＊ １．４３１±０．０６０
ＣＨＴＰⅡ－１　 ５００　 ０．４５９±０．０３２＊＊ ０．３１３±０．０２１＊＊ ０．３２０±０．０２２＊＊
２５０　 ０．８２９±０．０３０＊＊ ０．６９９±０．０２４＊＊ ０．９１３±０．０４７＊＊
１２５　 ０．９８１±０．０４７＊＊ ０．９０６±０．０３１＊＊ １．３１８±０．０７２＊＊
６２．５　 １．０５１±０．０３１＊＊ １．０２２±０．０５５　 １．３５３±０．１２９＊
阳性对照（５－Ｆｕ） １００　 ０．３８１±０．０５３＊＊ ０．１４５±０．０１３＊＊ ０．１４１±０．１２９＊＊
阴性对照 ０　 １．２０９±０．０１５　 １．０１５±０．０４７　 １．４５１±０．０７６
　　与阴性对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１
图３湖州铁线莲多糖对 ＨｅｐＧ２细胞增殖的抑制曲线
２．３．２　多糖对 ＭＧＣ８－０３细胞的抑制作用　ＣＨＴＰ
和ＣＨＴＰⅡ－１对 ＭＧＣ８－０３细胞抑制作用的 ＭＴＴ
检测ＯＤ值见表１。在测定浓度范围内，除了ＣＨＴ－
ＰＩＩ－１浓度为６２．５ｍｇ·Ｌ－１时检测ＯＤ值与阴性对照
组间无显著差异外，其余处理与阴性对照组间均存
在极显著差异（Ｐ＜０．０１）。ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对
肿瘤细胞的抑制率与浓度之间呈良好的线性关系，
见图４，其线性回归方程分别为 Ｙ＝０．０８０６Ｘ＋
３．２８０９（ｒ＝０．９９９６）和 Ｙ＝０．１５８５Ｘ－９．５６４８（ｒ＝
０．９９９５）。当ＣＨＴＰ终浓度为１０００ｍｇ·Ｌ－１、ＣＨＴ－
ＰＩＩ－１终浓度５００ｍｇ·Ｌ－１时抑制作用最为明显，抑制
率分别为８３．６５％和６９．１６％。ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰⅡ－１
对 ＭＧＣ８－０３细胞的ＩＣ５０分别为４５５．５９ｍｇ·Ｌ－１和
３４８．５７ｍｇ·Ｌ－１。
２．３．３　多糖对 Ｋ５６２细胞的抑制作用　ＣＨＴＰ和
ＣＨＴＰⅡ－１对Ｋ５６２细胞抑制作用的 ＭＴＴ检测ＯＤ
值见表１。与阴性对照组相比，ＣＨＴＰ浓度为２５０～
１０００ｍｇ·Ｌ－１时对Ｋ５６２细胞增殖的抑制作用达到极
图４湖州铁线莲多糖对 ＭＧＣ８－０３细胞增殖的抑制曲线
显著水平（Ｐ＜０．０１），１２５ｍｇ·Ｌ－１时无显著差异；而
ＣＨＴＰＩＩ－１在药物浓度为１２５～５００ｍｇ·Ｌ－１时对
Ｋ５６２细胞增殖的抑制作用达到极显著水平（Ｐ＜
０．０１），在６２．５ｍｇ·Ｌ－１时呈显著性差异。湖州铁线
莲多糖ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对Ｋ５６２细胞增殖抑制
作用的曲线，两者对细胞的抑制效果呈明显的浓度
依赖关系，且在相同浓度下，ＣＨＴＰＩＩ－１对Ｋ５６２细胞
增殖的抑制作用均高于 ＣＨＴＰ的抑制作用。当
ＣＨＴＰ终浓度为１０００ｍｇ·Ｌ－１、ＣＨＴＰＩＩ－１终浓度为
５００ｍｇ·Ｌ－１时对 Ｋ５６２细胞增殖的抑制作用最为明
显，抑制率分别达７８．８４％和７７．９５％。ＣＨＴＰ和
ＣＨＴＰⅡ－１对 Ｋ５６２细胞的ＩＣ５０分别为５５６．２８ｍｇ·
Ｌ－１和３０３．３４ｍｇ·Ｌ－１。见图５。
３　讨论
植物多糖尤其是从中药中分离出来的水溶性多
糖作为有效低毒的抗肿瘤治疗药物已越来越引起人
们的关注［３］。湖州铁线莲治疗肿瘤具有良好的临床
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浙江中医药大学学报２０１１年３月第３５卷第２期　
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图５　湖州铁线莲多糖对Ｋ５６２细胞增殖的抑制曲线
应用基础，但是对其治疗肿瘤等疾病的有效部位及
作用机理等方面均未见有详细深入的研究。本文为
进一步深入研究湖州铁线莲抗肿瘤活性及作用机制
奠定了良好的实验基础。
在多糖的 ＤＥＡＥ－ｃｅｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换柱层析
过程中，先用超纯水将中性多糖全部洗脱出柱，而不
是一开始就用ＮａＣｌ梯度洗脱，这样可避免在低浓度
的ＮａＣｌ作用下，少量吸附不太紧密的酸性多糖随着
中性多糖一起先被洗脱出柱；待中性多糖被完全洗
脱后，再利用线性梯度的ＮａＣｌ溶液将所有的酸性多
糖一一洗出。
ＭＴＴ法是目前广泛应用于一些生物活性因子
的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试
验以及肿瘤放射敏感性测定等。其具有灵敏度高、
重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、与其他
检测细胞活力的方法有良好的相关性［５］等特点。
一般认为，抑制率ＩＲ＞７０％为高度敏感，ＩＲ＞
５０％为中度敏感，ＩＲ＜５０％为不敏感［４］。本实验结
果表明，湖州铁线莲多糖ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对上
述三种细胞株的最高抑制率均＞５０％，其中，ＨｅｐＧ２
对高浓度的 ＣＨＴＰ和 ＣＨＴＰＩＩ－１均表现为中度敏
感；ＭＧＣ８－０３对浓度为１０００ｍｇ·Ｌ－１的ＣＨＴＰ表现
为高度敏感，对浓度为５００ｍｇ·Ｌ－１的ＣＨＴＰＩＩ－１表
现为中度敏感；Ｋ５６２对高浓度的ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－
１均表现为高度敏感。通过ＩＣ５０软件１．０．０版本计
算湖州铁线莲多糖ＣＨＴＰ和ＣＨＴＰＩＩ－１对各个细胞
株的ＩＣ５０值，结果表明，相同的多糖浓度下，ＣＨＴＰＩＩ－
１的抑制率较ＣＨＴＰ要高，说明湖州铁线莲精多糖
组分具有更强的抗肿瘤活性。由于 ＭＴＴ法是目前
检测细胞增殖与活性的常用方法，其结果的准确性
已获得广泛认同［６］，因此认为湖州铁线莲多糖具有
较好的抑制肿瘤细胞生长的作用，为下一步对其抗
肿瘤作用机制研究奠定了基础。
参考文献：
［１］　全国中草药汇编编委．全国中草药汇编（下册）［Ｍ］．北
京：人民卫生出版社，１９７８：４０３．
［２］　顾伟民，王建中，徐惠平．金剪刀外用临证举隅［Ｊ］．中医
药学刊，２００４，２２（４）：６２８．
［３］　刘吉成，牛英才．多糖药物学［Ｍ］．北京：人民卫生出版
社，２００８：６４－６５．
［４］　李宜明，沈业寿，季俊虬，等．桑黄菌质多糖体外抑瘤及
抗环磷酰胺致突变的作用［Ｊ］．中国科学技术大学学报，
２００６，３６（７）：７００－７０３．
［５］　司徒镇强，吴军正．细胞培养［Ｍ］．西安：世界图书出版
公司，２００４：２５０－２５１．
［６］　卜书红，李方，田怀平．ＭＴＴ比色法进行体外肿瘤药敏
实验的影响因素［Ｊ］．北京医学，２００２，２４（５）：３２３－３２５．
（收稿日期　２０１０－０３－０５）
（上接第２３９页）　而药物左旋咪唑可以抑制血清
ＩＬ－１０的产生水平，提高血清ＩＬ－１２的分泌水平，从而
增强了细胞免疫，提高了机体的抵抗力，并且在一定
程度上减少了口腔溃疡的发生，为寻找更好的治疗
复发性口腔溃疡的药物提供了一个可靠的思路。
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（收稿日期　２０１０－０３－１９）
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　浙江中医药大学学报２０１１年３月第３５卷第２期