全 文 ：收稿日期:2010-11-14; 修订日期:2011-05-07
基金项目:国家科技支撑计划项目(No． 2007BAI45B00)
作者简介:陈 晨(1984-) ，男(汉族) ，安徽省淮北人，现任中国科学院西
北高原生物研究所助理研究员，硕士学位，主要从事天然产物开发工作．
* 通讯作者简介:邵 赟(1962-)，女(汉族)，安徽宿州人，现任中国科学院
西北高原生物研究所副研究员，博士学位，主要从事天然药物化学研究工
作．
不同地点虎耳草中
17 种氨基酸含量的高效液相色谱测定
陈 晨1，2，赵晓辉1，文怀秀1，陶燕铎1，邵 赟1* ，梅丽娟1
(1．中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008; 2．中国科学院研究生院，北京 100049)
摘要:目的 建立高效液相色谱法测定虎耳草中 17 种氨基酸含量的方法。方法 采用 N，N －二硝基氟苯柱前衍生氨基酸
后测定;色谱柱为 Phenomenex Gemini 5 μm C18，流动相为醋酸钠 (pH = 6． 40)和 50%乙腈，采用梯度洗脱，检测波长为
360 nm，外标法计算含量。结果 17 种氨基酸线性关系、精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率为 96． 7% ～ 103． 2%
(RSD为 1． 14% ～ 2． 43%)。各地点的氨基酸总量范围是 5． 51% ～ 7． 8%，虎耳草含有 7 种必需氨基酸，它们的含量占总
量均大于 60%。在不同地点虎耳草中氨基酸平均含量顺序为苯丙氨酸 ＞亮氨酸 ＞天冬氨酸 ＞苏氨酸 ＞丝氨酸 ＞组氨酸
＞精氨酸 ＞谷氨酸 ＞丙氨酸 ＞脯氨酸 ＞缬氨酸 ＞异亮氨酸 ＞赖氨酸 ＞甘氨酸 ＞甲硫氨酸。结论 该方法简便、准确，为
虎耳草药理提供理论依据。
关键词:虎耳草; 氨基酸; 高效液相色谱法; 衍生化
DOI标识:doi:10． 3969 / j． i;ssn． 1008-0805． 2011． 10． 036
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)10-2402-02
虎耳草 Saxifraga stolonifera Meerb．，为虎耳草科虎耳草属植
物。性味:辛、苦，寒;小毒，有疏风清热、凉血解毒之功效，用于风
热咳嗽、急性中耳炎、大泡性鼓膜炎、风疹瘙痒等疾病治疗。其主
要成分有岩白菜素、鼠李糖苷、槲皮素、原儿茶酸、没食子酸、琥珀
酸、反甲基丁烯二酸等［1 ～ 5］。而对虎耳草的氨基酸分析研究较
少。近年来氨基酸高效液相分析得到了较大的发展，柱前衍生化
具有设备简单、方法通用、稳定性好等特点在氨基酸分析中占有
重要地位［6 ～ 8］。本文采用 N，N －二硝基氟苯作为衍生化试剂，分
析不同地点虎耳草的氨基酸，探讨了虎耳草氨基酸与地点的关
系。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪［四元梯度泵，DAD 检
测器，Agilent 1200 色谱工作站］;UPT －Ⅱ － 10 优普超纯水机(成
都超纯科技有限公司) ;N －1001 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限
公司) ;AG204 电子分析天平(梅特勒公司)。
1． 2 虎耳草药材 共 3 批，分别于 2010 － 08 采自青海省境内(见
表 3)。经中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟高级工程师鉴
定为虎耳草 Saxifraga stolonifera Meerb．，全株清洗后用去离子水
冲洗，然后自然阴干，粉碎后备用。
1． 3 试剂 17 种氨基酸对照品(Sigma 公司，纯度≧ 98%) ，甲醇
(色谱纯，山东禹王试剂公司) ;蒸馏水;超纯水;磷酸(优级纯，天
津兴华化学试剂厂) ;盐酸(分析纯，白银良友化学试剂有限公
司) ，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Gemini 5 μm C18 column(
250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ，流动相 A:0． 05 mol /L 醋酸钠 (pH =
6． 40) ;流动相 B:50%乙腈，紫外检测波长:360 nm，流速:1 ml /
min，进样量 10 μl，柱温:37 ℃，梯度洗脱:0 min(74% A)～ 5 min
(65% A)～ 15 min(60%A)～ 20 min(45% A)～ 25 min(35% A)
～ 30 min(25%A)～ 35 min(2%A)～ 40 min(2%A) ，对照品及样
品色谱图分别见图 1。
图 1 对照品(a)与供试品(b)HPLC图
2． 2 样品溶液制备 准确称取 20 mg 虎耳草样品放置于安瓿瓶
中，再移入 6 ml 6 mol /L的盐酸，充氮气，迅速将安瓿瓶在酒精灯
下封口，然后置于 105 ℃恒温干燥箱中水解 24 h取出后过滤，然
后旋转蒸发至干，再用 0． 02 mol /L 的盐酸复溶。加入 N，N －二
硝基氟苯于 60 ℃进行衍生处理 1 h。处理完后 0． 45 μm滤膜过
滤以备液相色谱分析［9 ～ 11］。
2． 3 对照品溶液品制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜
的 17 种氨基酸对照品 0． 25 g 于烧杯中，加入 0． 05 mol /ml 盐酸
溶解，定容于 25 ml的容量瓶后备用。
2． 4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液 0． 05，0． 10，0． 15，
0． 20，0． 25 ml 于 25 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容，既得不同浓
度的对照品混合液。各进样 10 μl进行分析，以标准品峰面积对
浓度进行线性回归，得到 17 种氨基酸对照品的回归方程和相关
关系见表 1。
2． 5 稳定性实验 取样品待测液分别在 0，3，6，9，12 h 后在
“2． 1”项下色谱条件测定，结果表明 17 种氨基酸峰面积的 RSD
为 1． 1% ～ 1． 9%，表明样品在 12 h内稳定。
2． 6 精密度实验 精密取样品待测液溶液，在“2． 1”项下色谱条
件连续进样 5 次，结果表明 17 种氨基酸峰面积的 RSD 为 0． 8%
～ 1． 7%，该实验表明该方法精密度良好。
2． 7 重复性实验 精密取样品待测液溶液 5 份，在“2． 1”项下色
谱条件测定，结果表明 17 种氨基酸峰面积的 RSD 为 1． 2% ～
1． 9%，该实验表明该方法重复性良好。
2． 8 回收率测定 精密取已知含量的样品 5 份，加入适量的混合
对照品溶液，混合均匀后，按照“2． 1”项下色谱条件测定样品溶
液中 17 种氨基酸的含量，并计算出加样回收率。由表 2 可知样
品的加样回收率为 96． 7% ～ 103． 2%，RSD为 1． 14% ～ 2． 43%。
2． 9 样品含量测定 分别精密吸取样品待测液各 10 μl，注入
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 10
HPLC中，按“2． 1”项下色谱条件测定，外标法计算样品溶液中 17
种氨基酸的含量，每个样品重复 3 次取平均值。结果见表 3。
3 结果
本文测定不同地点虎耳草 17 种氨基酸的含量，其中半胱氨
酸和酪氨酸均未检测出。各海拔的氨基酸总量范围是 5． 51% ～
7． 8%，虎耳草含有 7 种必需氨基酸，它们的含量占总量均大于
60%，最新研究表明必需氨基酸与人体衰老有关，这为金露梅的
药理提供了理论基础［12］。
在不同地点虎耳草中氨基酸平均含量顺序为苯丙氨酸 ＞亮
氨酸 ＞天冬氨酸 ＞苏氨酸 ＞丝氨酸 ＞组氨酸 ＞精氨酸 ＞谷氨酸
＞丙氨酸 ＞脯氨酸 ＞缬氨酸 ＞异亮氨酸 ＞赖氨酸 ＞甘氨酸 ＞甲
硫氨酸。
从 3 个地点的氨基酸总量看出大阪山产的虎耳草氨基酸含
量最高，其次是果洛，再者是玉树。从虎耳草中氨基酸含量看出，
虎耳草中氨基酸的最大值分别是不同海拔地区的。这些差异可
能与虎耳草的地理位置、土壤气候环境有关，使虎耳草在不同地
点表现出不同的氨基酸的最大含量。
表 1 17 种氨基酸的线性范围
氨基酸种类 线性方程 相关系数
天冬氨酸 Y = 2． 873 5X + 5． 098 7 0． 999 9
丝氨酸 Y = 1． 274 8X + 2． 131 5 0． 999 9
谷氨酸 Y = 1． 587 3X + 4． 573 6 0． 999 9
甘氨酸 Y = 1． 782 2X － 5． 945 3 0． 999 9
组氨酸 Y = 3． 867 3X + 5． 000 7 0． 999 9
精氨酸 Y = 1． 879 5X + 6． 754 3 0． 999 9
苏氨酸 Y = 2． 432 6X + 5． 642 8 0． 999 9
丙氨酸 Y = 1． 547 8X + 9． 874 8 0． 999 9
脯氨酸 Y = 2． 578 9X + 3． 582 3 0． 999 9
半胱氨酸 Y = 1． 221 5X + 2． 378 4 0． 999 9
酪氨酸 Y = 2． 428 6X + 3． 300 9 0． 999 9
缬氨酸 Y = 2． 441 3X + 2． 779 0 0． 999 9
甲硫氨酸 Y = 2． 221 9X + 2． 478 9 0． 999 9
赖氨酸 Y = 1． 623 5X + 5． 237 9 0． 999 9
异亮氨酸 Y = 1． 587 5X + 4． 143 9 0． 999 9
亮氨酸 Y = 1． 357 4X + 2． 245 7 0． 999 9
苯丙氨酸 Y = 3． 477 3X + 3． 122 7 0． 999 9
表 2 17 种氨基酸的加样回收率
氨基酸 加入量 m /mg 测得量 m /mg平均回收率(%) RSD(%) 氨基酸 加入量 m /mg 测得量 m /mg平均回收率(%) RSD(%)
天冬氨酸 1． 54 2． 48 98． 4 1． 21 脯氨酸 0． 60 1． 52 101． 8 2． 19
丝氨酸 0． 99 1． 87 98． 1 1． 42 缬氨酸 0． 69 1． 78 98． 5 2． 09
谷氨酸 0． 68 1． 57 97． 8 1． 87 甲硫氨酸 1． 10 2． 01 101． 2 2． 50
甘氨酸 0． 38 1． 46 96． 7 1． 14 赖氨酸 0． 18 1． 01 102． 6 1． 26
组氨酸 0． 74 1． 82 102． 1 2． 50 异亮氨酸 1． 02 2． 09 103． 2 2． 43
精氨酸 0． 85 1． 96 101． 4 1． 86 亮氨酸 2． 69 3． 57 99． 0 1． 78
苏氨酸 1． 06 2． 20 99． 5 2． 21 苯丙氨酸 0． 86 1． 79 98． 6 2． 21
丙氨酸 0． 95 2． 07 102． 3 1． 59
表 3 样品测定结果
地点 海拔 l /m
含量(%)
天冬氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 精氨酸 苏氨酸 丙氨酸 脯氨酸 缬氨酸 甲硫氨酸 赖氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸
玉树 4200 0． 45 0． 37 0． 28 0． 11 0． 30 0． 29 0． 32 0． 24 0． 20 0． 16 0． 21 0． 10 0． 13 1． 31 1． 04
果洛 4300 0． 69 0． 42 0． 34 0． 20 0． 35 0． 45 0． 53 0． 26 0． 19 0． 30 0． 26 0． 23 0． 20 1． 47 1． 68
大阪山 4000 0． 54 0． 39 0． 38 0． 18 0． 44 0． 35 0． 39 0． 29 0． 32 0． 24 0． 31 0． 18 0． 24 1． 69 1． 86
4 结论
采用衍生化测定氨基酸含量的方法稳定性好，操作简便，精
密度好。本实验对虎耳草氨基酸的测定为进一步研究藏药的作
用机理、开发新药资源、研发新药，提供了进一步的信息和基础。
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