全 文 ：虎耳草的组织培养和离体再生
赵宏波 , 房伟民 , 陈发棣
(南京农业大学园艺学院 ,江苏南京 210095)
　　摘要:以第一张展开的叶片为外植体进行了虎耳草组织培养研究。结果表明 ,最佳的培养体系为:以培养基
MS+1. 0 m g /L 6 -BA+0. 1 mg /L NAA诱导愈伤组织;形成的愈伤组织转接到 M S+2. 0 m g /L 6 - BA +0. 1 mg /L
NAA上诱导分化 ,分化率达到 65%;分化的不定芽转接到 M S+0. 5 mg /L 6 - BA +0. 1 m g /L NAA上诱导增殖 ,增
殖倍数达到 6. 35;形成的植株转移到不含激素的 1 /2MS培养基上诱导生根 ,同时还有壮苗效果。
　　关键词:虎耳草;组织培养;离体再生;叶片
　　中图分类号:S682. 036　　文献标识码:A　　文章编号:1002 - 1302(2006)05 -0070 - 02
收稿日期:2006 - 03 - 03
基金资助:江苏省农业三项工程项目 [编号:S01(48)] 。
作者简介:赵宏波(1979— ),男 ,浙江武义人 ,博士生 ,从事观赏植物
种质资源和遗传育种等研究。 Tel:(025)84395231;E -m ai l:zhao-
hbzh ou@ yahoo. com。通讯作者:陈发棣 , 教授 , 博导。 E - m ail:
chenfd@ n jau. edu. cn。
　　虎耳草 (Saxifraga stolon ifera)是虎耳草科多年
生常绿宿根植物[ 1] ,不仅可用于盆栽观赏 、点缀盆
景和园林地被 ,还具有较好的药用价值。虎耳草的
叶茎密被茸毛 ,叶形似老虎耳朵 ,叶表面有白色斑
点 ,背面多为紫红色;具匍匐茎 ,顶端可形成小植株;
初夏从叶丛间抽出花葶 ,开 5瓣白色小花 ,优雅动
人 。具有清热解毒 、祛湿消肿 、凉血止血的功效 [ 2] ,
可用于治疗中耳炎 、外伤出血 、牙痛 、湿疹 、吐血 、前
列腺增生等多种疾病 [ 3 -5] 。本研究拟建立虎耳草组
织培养和离体快繁体系 ,为产业化育苗生产提供技
术支持 ,同时为提取和生产虎耳草中的药用活性成
分奠定基础 。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料为虎耳草第一张刚展开的嫩叶及其叶
柄 。愈伤组织诱导培养基:①MS+1. 0mg /L 6 -BA
+0. 1 mg /L NAA;②1 /2M S +1. 0 mg /L 6 - BA +
0. 1mg /L NAA;③MS′(大量元素为 MS培养基的一
半 ,微量 、铁盐 、有机物质与 MS同 )+1. 0 mg /L 6 -
BA +0. 1 mg /L NAA。分化培养基:①MS +1. 0
mg /L 6 - BA +0. 1 mg /L NAA;④MS +2. 0 mg /L 6
- BA +0. 1 mg /L NAA;⑤MS +0. 01 mg /L TDZ +
0. 1 mg /L NAA;⑥MS+0. 02 mg /L TDZ +0. 1 mg /L
NAA。增殖继代培养基:①MS+1. 0 mg /L 6 - BA +
0. 1 mg /L NAA;⑦MS +0. 5 mg /L 6 - BA +0. 1
mg /L NAA;⑧MS +0. 2 mg /L 6 - BA +0. 1 mg /L
NAA。生根培养基:⑨1 /2MS。培养基均加 3%蔗糖
和0. 6%琼脂 , pH值 5. 8。
1. 2　方法
选取健康嫩叶 ,放入洗洁精水中漂洗 8 ～ 10
m in,用自来水冲净 ,滤纸吸干 ,再用 70%乙醇浸泡
30 s, 0. 1%HgC l2消毒 8 m in,无菌水冲洗 4次。切
成(2 ～ 3)mm ×(2 ～ 3)mm大小 ,接种于愈伤组织
诱导培养基中 。 30 d后将形成的愈伤组织转接到
分化培养基中 ,再过 30 d后将分化的不定芽切下 ,
接到增殖继代培养基上。将长至一定大小 (全展叶
直径 1 cm以上 )的不定芽切下 ,转接到生根培养基
中。以上各阶段培养条件均为 (25±2) ℃, 1 500 ～
2 000 lx, 12 h /d。 30 d后进行驯化移栽 ,将装有已
生根的试管苗的培养瓶拿出培养室 ,在室温自然条
件下锻炼 3 d,然后打开瓶盖 ,再锻炼 3 d,最后用镊
子将试管苗取出 ,在自来水下将培养基冲净 ,栽到经
高温灭菌过的基质 [W(珍珠岩 ) ∶W (泥炭 )=3 ∶
1]中 ,用塑料薄膜罩住保湿 ,温度 23 ～ 25 ℃,光照
3 000 lx。 1个月后移栽 。
1.3　数据分析
采用最小显著极差法(LSR)进行数据分析。
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织的诱导
接种于①、②、③培养基中的叶片在 10 d后开
始膨大 ,形成愈伤组织 , 30 d后膨大的叶片周边形
—70— 江苏农业科学　2006年第 5期DOI牶牨牥牣牨牭牳牳牴牤j牣issn牣牨牥牥牪牠牨牫牥牪牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牪牱
成了一定量的愈伤组织 , 3种培养基出愈率差异不
显著(表 1)。培养基①上形成的愈伤组织呈黄绿
色 ,表面湿润;培养基②和③上形成的愈伤组织呈米
黄色 ,半透明 ,较疏松 。培养基①诱导的愈伤组织后
期分化能力较强 。
表 1　不同培养基上愈伤组织诱导情况
培养基 接种数(个)
愈伤组织数
(个)
出愈率
(%)
① 39 33 84. 6a
② 54 42 77. 8a
③ 50 40 80. 0a
2. 2　不定芽的诱导和增殖
30 ～ 40 d后将愈伤组织及时转接到分化培养
基①、④、⑤和⑥上 , 15 d后便陆续分化出不定芽 ,
但在培养基①上分化率只有 20%,而在培养基④上
分化率达到 65%;在添加了 TDZ的培养基 ⑤和⑥
上 ,分化率较低 ,且愈伤组织褐化严重 (表 2)。不定
芽形成之后需及时转接 ,若转接太迟易发生玻璃化 ,
且形成的不定芽过多 ,导致个体太小 ,继代之后生长
缓慢 。
表 2　不定芽的诱导情况
培养基 分化率(%)
褐化率
(%) 分化情况
① 20. 0B 2. 5B 愈伤组织周边形成 1 ～ 3个不定芽
④ 65. 0A 0 愈伤组织周边形成 2 ～ 5个不定芽
⑤ 5. 00B 50. 0A 极少数分化 ,大部分愈伤组织褐化
⑥ 8. 30B 64. 0A 少数分化 ,绝大部分愈伤组织褐化
　　形成的不定芽及时转接到增殖继代培养基①、
⑦和⑧上 ,结果见表 3。在培养基①上 40 d后不定
芽增殖倍数达到 10. 6,但形成的不定芽过多且小 ,
部分发生玻璃化;而在培养基⑦上每株不定芽增殖
倍数适中 , 40 d后达 6. 35,形成的个体较粗壮 ,适合
生根移栽;在培养基⑧上虽然增殖倍数和长势均较
好 ,但芽丛形成了根 ,不适合移栽 ,也给转接继代带
来不便。
表 3　不定芽的增殖情况
培养基 接种数(个)
不定芽数
(个) 增殖倍数 生长情况
① 60 634 10. 6A 不定芽过多且太小 ,有部分玻璃化
⑦ 60 381 6. 35B 不定芽大小适中 ,长势好
⑧ 60 256 4. 27B 长势较好 ,但芽丛形成了一定量的根
2. 3　根的诱导和移栽
从丛生芽上切下长至一定大小的不定芽 ,转接
到培养基 ⑨上诱导生根。 30 d后 ,不定芽生长健
壮 ,基部形成一定量白色的根 ,根上形成了大量根
毛 ,生根率达到 95%以上 ,说明培养基⑨兼有生根
和壮苗的作用。生根植株经驯化后 ,移栽成活率达
95%以上 , 1个月后移栽 ,后期长势旺盛 (图 1)。
3　结论
以虎耳草不同部位(叶片 、叶柄 )为外植体诱导
愈伤组织 ,发现只有叶片能诱导出长势良好且具有
较好分化能力的愈伤组织 ,以培养基 MS+1. 0mg /L
6 -BA +0. 1 mg /L NAA最为适宜 。在不同培养基
上诱导出的愈伤组织状态不同 ,可作不同用途使用。
在培养基 MS+1. 0mg /L 6 - BA +0. 1mg /L NAA上
诱导出的黄绿色愈伤组织作为诱导分化的材料 ,而
培养基 1 /2MS +1. 0mg /L 6 - BA +0. 1 mg /L NAA
和 MS′(大量元素为 MS培养基的一半 ,微量 、铁盐 、
有机物质与 MS同 )+1. 0 mg /L 6 -BA +0. 1 mg /L
NAA上诱导出的愈伤组织呈米黄色 ,半透明 ,较疏
松 ,可作为悬浮培养的材料 ,用以提取药用成分。黄
绿色的愈伤组织转接到分化培养基 MS +2. 0 mg /L
6 -BA +0. 1mg /LNAA上 ,分化率达到 65%。形成
的不定芽需及时转接继代 ,否则极易玻璃化。不定
芽转接到 MS+0. 5mg /L 6 - BA +0. 1mg /L NAA上
诱导增殖 ,增殖倍数达到 6. 35,植株生长旺盛。将
增殖的芽丛切成单株 ,转移到不含激素的 1 /2MS培
养基上诱导生根 ,结果表明 1 /2M S兼有生根和壮苗
效果 。生根植株驯化移栽成活率高且长势好 。
(下转第 72页)
—71—赵宏波等:虎耳草的组织培养和离体再生
同源四倍体抗热萝卜同工酶研究
徐伟钰 , 张蜀宁 , 万双粉 , 侯喜林
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,园艺学院 ,江苏南京 210095)
　　摘要:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,对二倍体和四倍体萝卜进行了营养生长和生殖生长时期超氧化物歧
化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和酯酶(EST)同工酶研究。结果表明 ,与二倍体相比 , 无论是营养生长期还是生
殖生长期 ,四倍体 EST同工酶多 1 ～ 2条特异条带且颜色较深;POD同工酶酶谱带的条数相同 , 但四倍体的酶谱
带显色深 ,差异显著;营养生长期四倍体中 SOD同工酶酶谱带和二倍体相同;生殖生长期四倍体 SOD酶酶谱带的
活性加强。
　　关键词:萝卜;同工酶;二倍体;四倍体
　　中图分类号:S631.103. 4　　文献标识码:A　　文章编号:1002 - 1302(2006)05 - 0072 - 03
(上接第 71页 )
参考文献:
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版社 , 1992.
[ 2]罗厚蔚 ,吴葆金 ,陈节庵. 虎耳草有效成分的研究 [ J] . 中国药科
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[ 3]钮绪燕 ,吴文君 ,刘虎奇 ,等. 虎耳草科植物杀菌活性的初步研究
[ J] . 西北农业大学学报 , 1996, 5(2):61 - 65.
[ 4]张秋海 ,丁家欣 ,张　玲. 不同产地与采收季节虎耳草中原儿茶
酸的含量测定 [ J] . 现代中药研究与实践 , 2004, 18(4):30 - 31.
[ 5]张立石 ,丁家欣 ,张秋海 ,等. 虎耳草提取物对大鼠成纤维细胞的
抑制作用 [ J] . 中国中医基础医学杂志 , 2005, 11(12):920 -
922.
　　植物多倍体具有抗逆性 、优质性和巨大性 [ 1] ,
备受人们重视。多倍体与二倍体差异的根本原因是
DNA分子水平表达不同 。有关果树多倍体与二倍
体同工酶电泳谱带特征的比较研究 [ 2 - 7]表明 , 多倍
体植株同工酶同一位点基因剂量加倍 ,该位点的酶
量相应增加 , 并且多倍体酶谱中出现特异条带 。蔬
菜多倍体中仅在不结球白菜 [ 8]和萝卜上有报道 ,但
在萝卜 [ 9]上只对同源多倍体萝卜过氧化物酶同工
酶进行了研究 ,关于二倍体和四倍体萝卜不同生育
时期 、不同组织器官的同工酶的变化规律还未见报
道 。本研究利用本实验室培育的抗热四倍体白萝卜
叶片和花蕾为试材 ,比较分析不同生育时期叶片和
花蕾中 EST、SOD和 POD同工酶酶谱带的表达特
性 ,为多倍体育种后代的遗传分析和倍性筛选提供
辅助方法。
收稿日期:2006 - 01 - 09
基金项目:江苏省重大科技攻关项目(编号:2002304)。
作者简介:徐伟钰(1980— ),女 ,河南南阳人 ,硕士生 ,主要从事蔬菜
遗传育种与生物技术研究。 Tel:( 025) 84395332;E - m ail:
xuw eiyu_0000@ sina. com。通讯作者:张蜀宁。 E - m ail:snzhang@
n jau. edu. cn。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
供试材料为二倍体抗热白萝卜 (2n =2x =18)
03R - 2和四倍体抗热白萝卜 (2n=4x =36)03R - 1
(本实验室利用秋水仙素诱导 03R - 2获得 ),试验
于 2004年 11月 ～ 2005年 4月在南京农业大学国家
重点实验室和园艺站进行。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　材料准备　田间试验设计采用随机区组 , 3
次重复。 2004年 9月播种 ,株行距 30 cm ×35 cm ,
每小区 40株。 9 ～ 12月营养生长 ,同年 12月收获
贮藏 ,次年 2月定植进行生殖生长 。
1. 2. 2　电泳 　(1)凝胶制备:分离胶浓度 7. 5%
(pH值 8. 9),浓缩胶浓度 4% (pH值 6. 7),电极缓
冲液为 Tris -甘氨酸缓冲液(pH值 8. 3)。 (2)样品
制备:营养生长期 ,取全展幼叶 1 g,加入 2 ～ 3倍体
积的缓冲液 (PBS 0. 1 mol /L, pH值 6. 8, 0. 2%β -
巯基乙醇 , 10%蔗糖 ), 冰浴研磨匀浆后在 12 000
r /m in下离心 10 m in,取上清液保存于 - 20 ℃冰箱
中待用。生殖生长期 ,取抽薹部位的全展叶及花蕾
(长度 0. 3 ～ 0. 4 cm)各 1 g,其他同营养生长期酶液
—72— 江苏农业科学　2006年第 5期