全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 12 食品科学 ※工艺技术108
超声辅助提取甘青虎耳草总黄酮工艺及其
抑菌作用
崔 玮 1，李玉兰 2,3，杨爱梅 3,*
(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；3.张掖铁路学校，甘肃 张掖 734012；
3.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050)
摘 要：目的：研究甘青虎耳草(Saxifraga tangutica Engl.)总黄酮的提取工艺及其抑菌作用。方法：用正交试验超
声波辅助乙醇提取总黄酮；用琼脂扩散法和肉汤倍比稀释法研究不同质量浓度总黄酮提取物对 6种供试菌的抑菌作
用。结果：方差分析得各因素影响的顺序为提取次数＞乙醇体积分数＞超声时间＞料液比，最佳工艺为提取 50℃、
超声功率100W、乙醇体积分数80%、料液比1:25(g/mL)、超声时间 35min、提取4次，在此条件下提取率达81.73mg/g；
抑菌试验显示总黄酮提取物对细菌均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌的最小杀菌质量浓度
分别为 0.156、0.313、0.625mg/mL；对酵母菌的抑制作用较弱；对霉菌没有抑制作用。结论：本实验结果可为
甘青虎耳草总黄酮提取工艺的确定及在抑菌方面的应用提供实验依据。
关键词：甘青虎耳草；总黄酮；超声波；提取工艺；抑菌
Ultrasonic-Assisted Extraction and Antibacterial Activity of Total Flavonoids from Whole Plants of
Saxifraga tangutica Engl.
CUI Wei1，LI Yu-lan2,3，YANG Ai-mei3,*
(1. College of Agricultural Technique and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. School of Zhangye Railway,
Zhangye 734012, China；3. College of Life and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)
Abstract ：Objective: To investigate the extraction and antioxidant activity of total flavonoids from whole plants of Saxifraga
tangutica Engl. Methods: Orthogonal array design was employed to optimize extraction conditions. The antibacterial effect of
total flavonoid extract at different concentrations on 6 strains was evaluated by agar diffusion and broth dilution methods.
Results: According to the results of analysis of variance, four extraction parameters could be ranked in decreasing order of their
effect on extraction efficiency as follows: extraction number ＞ ethanol concentration ＞ ultrasonic treatment time ＞ material-
to-liquid ratio. The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 80%, material-to-liquid ratio of 1:25 (g:mL),
ultrasonic treatment time of 35 min, repeated ultrasonic treatment number of 4, ultrasonic power of 100 W and extraction
temperature of 50 ℃. Under these conditions, the extraction efficiency of total flavonoids was 81.73 mg/g. Total flavonoids from
whole plants of Saxifraga tangutica Engl. had inhibitory effect on all tested strains. The minimum inhibitory concentrations were
0.156, 0.313 mg/mL and 0.625 mg/mL against Staphyloccus aureus, Bacillus subtilis and Escherichia coli, respectively. The anti-
yeast activity was weak. No inhibitory effect on mold was found. Conclusion: This study can provide experimental references
for further development and utilization of Saxifraga tangutica Engl.
Key words：Saxifraga tangutica Engl.；total flavonoids；ultrasonic treatment；extraction process；antibacterial activity
中图分类号：R965.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)12-0108-06
收稿日期：2011-05-11
基金项目：兰州理工大学优秀青年教师资助计划项目(Q200808)
作者简介：崔玮(1969—)，男，副教授，硕士，主要从事动物和人体解剖生理研究。E-mail：zhangyecw@163.com
*通信作者：杨爱梅(1976—)，女，副教授，博士，主要从事天然药物化学研究。E-mail：yangaimei@163.com
甘青虎耳草(Saxifraga tangutica Engl.)是虎耳草科
(Saxifragaceae)虎耳草属的多年生常绿草本植物，别名耳
朵红、老虎耳等，分布于青海、甘肃、西藏及四川
的石渠、色达、壤塘、德格、巴塘等县。甘青虎耳
草为常用藏药，其味苦性凉，清热，治肝、胆热症
和创伤[ 1 ]，还可治急性中耳炎、风热咳嗽以及具有抑
109※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 12
菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等药理作用[ 2 -4 ]。现代药理
研究表明黄酮具有抗氧化、抗癌、抑菌等多种生物活
性及药理作用，对人类的肿瘤、衰老和农业病虫害的
防治具有重要意义[5-6]。刘世旺[7]、钮绪燕[8]、陈娇[9]等
分析了虎耳草(Saxifraga stolonifera Meerb)乙醇提取物
有抑菌作用。本实验以芦丁为对照品，通过单因素和
正交试验，研究超声波辅助提取甘青虎耳草总黄酮工
艺和对 6种不同菌株的抑菌效果，为甘青虎耳草的进一
步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
甘青虎耳草全株购自青海塔尔寺藏医院，植物标本
由兰州大学生命科学院张国梁教授鉴定为 S ax i f r a g a
tangutica Engl.，粉碎，过 80目筛，60℃烘烤至质量
恒定后，备用。
大肠杆菌(Es c he r i c h ia c o l i )、金黄色葡萄球菌
(Staphylococc us aur eus )、枯草芽孢杆菌(Baci l l us
subtilis)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisia)、米曲霉
(Aspergillus oryzae)、玉米大斑菌(Exserohilum turcicum)
河西学院微生物实验室。
芦丁标准品 中药固体制剂制造技术国家工程研究
中心；无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢
氧化钠、氯化钠、牛肉膏和蛋白胨均为国产分析纯。
TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通
用仪器有限责任公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪
器系统有限公司；电热干燥箱 上海申光仪器仪表有限
公司；JY92-Ⅱ型超声波细胞破碎仪 宁波新芝科学仪
器厂；旋转蒸发器 RE-52 上海精宏实验设备有限公
司；LD4-2A型低速离心机 北京医用离心机厂；SW-
CT-2D型洁净工作台 苏州智净净化设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线制作
精确称取 105℃常压干燥至质量恒定的芦丁标准品
10.0mg，加无水乙醇适量，超声振荡溶解，定容 50mL，
即得芦丁对照品标准溶液(0.20mg/mL)。精密量取对照品
标准溶液 0.00(空白对照)、0.50、1.00、1.50、2.00、
2.50、3.00、3.50、4.00mL，分别置于 1～9号 10mL容
量瓶中，加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3mL，放置 6min，再
加入 10%硝酸铝溶液 0.3mL，放置 6min，加入 4%氢氧
化钠溶液 4mL，加水定容至刻度，摇匀，静置 10min，
在 511nm波长处测其吸光度，以质量浓度(C)为横坐标，
吸光度( A )为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：
A＝ 10.858C＋ 0.0016，r ＝ 0.9997，在0.011～0.088mg/mL
范围内呈良好的线性关系。
1.2.2 总黄酮的提取和测定
取甘青虎耳草粉末 150g，置 500mL锥形瓶中以料液
比 1:2加入石油醚脱脂 2h，重复至石油醚层几近无色，
回收石油醚，干燥备用。
精密称取脱脂的虎耳草粉末 1.000g，置 50mL锥形
瓶中，用不同体积分数的乙醇超声波辅助水浴提取一定
时间，将提取液旋蒸至干后，用相应体积分数的乙醇
溶解，定容于 50mL容量瓶中待测。精密量取待测提取
液 1.0mL于 10mL容量瓶中，按 1.2.1节方法显色后，在
511nm波长处测定吸光度，计算总黄酮的提取率。

(0.0921A－0.0001)×测定液稀释倍数×提取液总体积
总黄酮提取率 /(mg/g) =——————————————————————————

提取物质量
1.2.3 总黄酮提取单因素和正交试验
拟定乙醇体积分数、料液比、提取时间、温度和
提取次数进行单因素试验。在单因素试验基础上确定正
交试验工艺参数，进行 L9(34)正交试验，经方差分析确
定甘青虎耳草总黄酮提取的最佳工艺。
1.2.4 抑菌实验
1.2.4.1 总黄酮供试液制备
称取 50g脱脂的虎耳草粉，按照最佳工艺得到提取
液，醇沉法除多糖后，制得粗黄酮粉。精确称取 20mg
粗黄酮粉，用 60%乙醇定容至 50mL。按 1.2.1节方法显
色后，在 511nm波长处测定吸光度，按总黄酮液列公
式计算：

(0.0921A－ 0.0001)×测定液稀释倍数×提取液总体积
总黄酮纯度/ % = ———————————————————————————

粗黄酮粉质量
计算得总黄酮纯度为 26.35%，用 30%的乙醇配制
总黄酮为 10、5、2.5、1.25mg/mL的供试液备用[10 ]。
1.2.4.2 菌悬液制备
将供试菌种分别接种于固体培养基上活化培养
后，在无菌操作条件下，用麦氏比浊法，取活化后
的菌落(霉菌取孢子)与无菌生理盐水配成菌悬液浓度
0.5McFarlaod单位的标准接种物(即 1× 108CFU/mL)，再
用无菌生理盐水按 10 倍稀释法将标准接种物配成 1 ×
106CFU/mL的菌悬液[11]。
1.2.4.3 抑菌活性的测定
采用琼脂扩散法。参考文献[12-13]方法进行。在直
径 9cm的培养皿中倒入 15mL灭菌的肉汤培养基，凝固后
取0.1mL菌悬液均匀涂布后安放牛津杯，杯内加300μL供
试液或对照液(阳性对照为 1000U/mL的链霉素，空白对
照为 30%乙醇溶液)，37℃恒温培养 24h，采用十字交
叉法测量抑菌圈直径。每组 3 个重复。
2012, Vol. 33, No. 12 食品科学 ※工艺技术110
1.2.4.4 最低抑菌质量浓度测定
采用肉汤倍比稀释法。参考文献[14-15]方法进行。
取 13支灭菌试管，1号试管加 1.5mL肉汤培养液，2～
12号管各加 1.0mL肉汤培养液，再向 1号试管加 0.5mL
含黄酮 10mg/mL供试液，然后由 1～10管依次进行倍比
稀释，1～10号管的供试液质量浓度依次为 2.5、1.25、
0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、
0.005mg/mL。然后向1～11号试管每管加1×106CFU/mL
菌悬液 1.0mL，其中 11号管作为阴性对照；12号管加
入 1.0mL供试液代替菌液作为阳性对照；13号管加入
1.0mL 30%乙醇和 1.0mL菌液作为溶剂对照。将 13支试
管置于 37℃恒温培养箱中培养 18～24h，然后对各管进
行比浊，以确定最低抑菌质量浓度。供试管的混浊度
小于阴性对照管表明有抑菌活性，混浊度与阴性对照管
相同表示无抑菌活性，混浊度越大表明抑菌活性越小。
将未见细菌生长的管内肉汤转接到普通琼脂培养基平皿
上，再于 37℃条件下培养 18～24h，将琼脂平皿上未见
细菌生长的药物质量浓度作为最低杀菌质量浓度。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 料液比对总黄酮提取率的影响
精密称取已脱脂的虎耳草粉末 1.000g，用 70%乙醇
为溶剂，温度 50℃、超声功率 10 0W、时间 20 mi n，
提取 2次。考察不同料液比 1:15、1:20、1:25、1:30、
1:35(g/mL)对黄酮提取率的影响。
由图 1可见，溶剂用量对黄酮提取率影响明显，随
溶剂用量的增加而先上升后下降。料液比与总黄酮提取
率的关系显著(P＜ 0.05)。其中料液比为 1:25时总黄酮提
取率最高，为 62 .7 5mg/g，与其他因素水平差异极显
著。因此，料液 1 : 2 5 为最佳料液比。当溶剂用量大
于 1:25时，黄酮提取率下降，这可能是由于在超声波
的作用下溶出黄酮的同时还能溶出更多其他物质，使
浸提液黏度增大，扩散速度变慢，导致黄酮类化合物
不易溶出。
2.1.2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
料液比 1:25、其余操作同 2.1.1节，考察乙醇体积
分数 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%对
黄酮提取率的影响。
由图 2 可见，乙醇体积分数对黄酮提取率影响明
显，随乙醇体积分数的增加提取率先上升后下降。乙
醇体积分数与总黄酮提取率的关系显著(P＜ 0.05)。乙醇
体积分数为 70%时总黄酮提取率最高，为 60.28mg/g。
2.1.3 提取次数对总黄酮提取率的影响
料液比 1:25、其余操作同 2.1.1节，考察提取次数
1、2、3、4、5 次对黄酮提取率。
由图 3 可知，提取次数对总黄酮提取率的影响显
著，随提取次数的增多，总黄酮提取率先上升后下降，
提取次数与总黄酮提取率的关系极显著(P＜ 0.05)。提取
次数为 3次时，黄酮提取率最高，为 55.92mg/g，与其
他各次的差异显著(P＜ 0.05)。
2.1.4 超声时间对总黄酮提取率的影响
图 1 料液比对总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of material/liquid ratio on the extraction rate of
total flavonoids
70
60
50
40
30
20
10
0
a
总
黄
酮
提
取
率
/(
m
g/
g)
料液比(g/mL)
1:15 1:20 1:25 1:30 1:35
bc c b
d
图 2 乙醇质量分数对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of
total flavonoids
70
60
50
40
30
20
10
0
总
黄
酮
提
取
率
/(
m
g/
g)
乙醇体积分数 /%
30 40 50 60 70 80 90
b
a
c
d
e
f
g
图 3 提取次数对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of repeat extraction number on the extraction rate of
total flavonoids
60
50
40
30
20
10
0
总
黄
酮
提
取
率
/(
m
g/
g)
提取次数
1 2 3 4 5
dc
b
a
e
111※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 12
料液比为 1:25、其余操作同 2.1.1节，考察超声时
间为 15、20、25、30、35、40min 对黄酮提取率的
影响。
由图 4 可见，提取时间对总黄酮提取率的影响明
显，随提取时间的增加，总黄酮提取率先上升后下降，
提取时间与总黄酮提取率的关系显著(P＜ 0.05)，提取时
间 30min时总黄酮提取率最高为 42.35mg/g。
2.1.5 温度对总黄酮得提取率的影响
料液比 1 :2 5、其余操作同 2 . 1 . 1 节，考察提取
温度 3 0、4 0、 5 0、6 0、7 0℃对总黄酮提取率的
影响。
由图 5可见，提取温度对总黄酮提取率的影响不明
显，差异不显著(P＞ 0.05)，但 50℃时总黄酮提取率最
高为 60.12mg/g，故选取 50℃进行正交试验。
2.2 正交试验结果
根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液
比、超声提取时间和提取次数进行四因素三水平正交
试验，因素水平见表 1。
水平
因素
A 体积分数 /% B 料液比(g/mL) C 时间 /min D 提取次数
1 60 1:20 25 2
2 70 1:25 30 3
3 80 1:30 35 4
表 1 L9(34)甘青虎耳草总黄酮提取工艺正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal array design
试验号 A B C D 总黄酮提取率/(mg/g)
1 1 1 1 1 51.00
2 1 2 2 2 64.95
3 1 3 3 3 72.57
4 2 1 2 3 76.81
5 2 2 3 1 61.10
6 2 3 1 2 62.29
7 3 1 3 2 76.52
8 3 2 1 3 79.57
9 3 3 2 1 60.74
K1 62.90 68.11 64.29 57.61
K2 66.73 68.54 67.50 67.92
K3 72.28 65.76 70.12 76.38
R 9.38 3.28 5.84 18.76
表 2 L9 (34)甘青虎耳草总黄酮提取工艺正交试验设计及结果
Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results
由表 2可知：影响甘青虎耳草中总黄酮提取率的因
素依次为D＞ A＞C＞ B，即提取次数＞乙醇体积分数
＞超声时间＞料液比；最佳工艺为 A 3B 2C 3D 3，即选用
80% 乙醇、料液比 1 :25 (g /mL)、在 50℃条件下提取
35min、提取 4次。由表 3可知，提取次数对甘青虎耳
草黄酮提取率具有显著影响(P＜ 0.05)。
2.3 验证实验
在最佳条件下进行 3次重复实验，总黄酮平均提取
率为 81.73mg/g，大于正交试验中最大提取率，因此可
得最优水平可靠且该工艺稳定可行。
2.4 抑菌活性测定
如表 4 所示，甘青虎耳草总黄酮对金黄色葡萄球
菌、枯草杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母有抑制作用。质
量浓度较低 (1.25mg/mL)时，对细菌已表现明显的抑菌效
果，抑菌圈直径＞ 14.00mm，而对啤酒酵母的抑菌圈直
图 4 超声时间对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of
total flavonoids
50
40
30
20
10
0总
黄
酮
提
取
率
/(
m
g/
g)
提取时间 /min
15 20 25 30 35 40
d c
a
cb
a
图 5 提取温度对总黄酮提取率的影响
Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total
flavonoids
60
50
40
30
20
10
0
总
黄
酮
提
取
率
/(
m
g/
g)
提取温度 /℃
30 40 50 60 70
a
a a a
a
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 133.345 2 3.791 6.940
B 19.066 2 0.542 6.940
C 51.274 2 1.458 6.940
D 529.805 2 15.064 6.940 *
误差 70.34 2
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance for the experimental results of
orthogonal array design
注：* .差异显著。
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径＜ 7.00mm；对细菌的抑制作用随着质量分数的增加而
增强。提取物对供试菌株的抑制效果顺序为金黄色葡萄
球菌＞枯草杆菌＞大肠杆菌＞啤酒酵母，对米曲霉和玉
米大斑菌没有抑菌作用。
2.5 最低抑菌质量浓度测定
由表 5 可知，甘青虎耳草黄酮对 3 种供试菌的抑
菌活性大小顺序为金黄色葡萄球菌＞枯草杆菌＞大肠
杆菌，对 3 种菌的最低抑菌质量浓度分别为 0 .0 78、
0.078、0.156mg/mL，即对革兰氏阳性菌的抑菌活性大
于革兰氏阴性菌。
2.6 最低杀菌质量浓度的测定
菌种 质量浓度 /(mg/mL)
溶剂对照 阴性对照 阳性对照
2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 0.078 0.039 0.020 0.10 0.005
金黄色葡萄球菌 +++ +++ +++ +++ + - - - - - - - +++
枯草杆菌 +++ +++ +++ +++ + - - - - - - - +++
大肠杆菌 +++ +++ +++ + - - - - - - - - +++
表 5 甘青虎耳草黄酮的最低抑菌质量浓度
Table 5 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from Saxifraga tangutica Engl.
注：+ + + 表示清澈；+ + 表示较清澈；+ 表示较混浊；- 表示混浊。
菌落数
菌种 2.50 1.25 0.625 0.313L 0.156 0.078
mg/mL mg/mL mg/mL mg/m mg/mL mg/mL
金黄色葡萄球菌 0 0 0 0 3 －
枯草杆菌 0 0 0 4 ＞ 5 －
大肠杆菌 0 0 0 ＞ 5 － －
表 6 甘青虎耳草黄酮的最低杀菌质量浓度
Table 6 Minimum bactericidal concentration of total flavonoids from
Saxifraga tangutica Engl.
注：- .表示未进行划线培养。
由表 6 可知，甘青虎耳草总黄酮对金黄色葡萄球
菌、枯草杆菌、大肠杆菌的最小杀菌质量浓度分别为
0.156、0.313、0.625mg/mL。其中对金黄色葡萄球菌的
最小杀菌质量浓度最小，说明对其杀灭效果最好。
3 讨论与结论
目前普遍认为空化效应、热效应和机械作用是超声
技术在中药提取中的三大理论依据[16-17]。因此超声提取
具有提取速度快、提取率较高的优点并且可避免高温对
活性成分的影响[18-20]。本实验在单因素试验基础上进行
正交试验，研究超声波辅助提取甘青虎耳草总黄酮的最
佳工艺。从正交试验和方差分析结果可知，各因素对
提取率的影响次序为提取次数＞乙醇体积分数＞超声时
间＞料液比；温度对得率影响差异不显著(P＞ 0.05)；
确定最优组合为 80%乙醇、料液比 1:25(g/mL)、在超声
功率 100W、50℃条件下提取 35min、连续提取 4次，
黄酮提取率达到最高，为 81.73mg/g。该提取工艺具有
稳定性好，时间短，操作简便，生产成本低等优点，
为工业化开发甘青虎耳草黄酮资源提供实验参考。
甘青虎耳草总黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、
大肠杆菌和啤酒酵母均有抑制作用。对菌株的抑制作用
随着浓度的增加而增强；抑制效果顺序为金黄色葡萄球
菌＞枯草杆菌＞大肠杆菌＞啤酒酵母。甘青虎耳草总黄
酮对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌的最小杀
菌质量浓度分别为 0.156、0.313、0.625mg/mL。本实验
为开发和利用甘青虎耳草抑菌作用提供一定依据。
参 考 文 献 ：
[1] 西北高原生物所. 藏药志[M]. 西宁:青海人民出版社, 1991: 107.
[2] 丁家欣, 张立石, 张玲, 等. 虎耳草提取物对前列腺癌细胞凋亡的影
响[J]. 中国中医基础医学杂志, 2005, 11(l2): 905-907.
[3] CHEN Zhuo, LIU Yumei, YANG Song, et al. Studies on the chemical
供试菌株 供试液质量浓度 /(mg/mL)
阳性对照(链霉素 1000U/mL) 空白对照(30%乙醇溶液)
1.25 2.50 5.0
金黄色葡萄球菌 10.83± 0.35 13.35± 0.64 31.80± 2.44 22.37± 0.85 —
枯草杆菌 9.31± 0.71 13.41± 1.14 26.19± 1.48 15.61± 0.67 —
大肠杆菌 6.71± 0.82 9.42± 0.40 17.88± 1.14 16.05± 0.48 —
啤酒酵母 — 2.57± 0.60 4.13± 0.37 3.50± 0.35 —
米曲霉 — — — — —
玉米大斑菌 — — — — —
表 4 不同质量浓度甘青虎耳草黄酮的抑菌作用
Table 4 Inhibitory activity of total flavonoids from Saxifraga tangutica Engl. at various concentrations on bacteria
注：表中抑菌圈直径为 3 次试验的平均值；—表示无抑菌圈。
mm
113※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 12
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