全 文 ：蝴蝶兰愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生的研究
吕晓辉 ,黄象男 ,郭晓慧 ,宿显瑞 ,臧新 (郑州大学生物工程系 ,河南郑州 450001)
摘要 研究了蝴蝶兰愈伤组织的诱导和通过体细胞胚胎发生的植株再生。原球茎在含有蔗糖的VW培养基上形成愈伤组织。结果表
明 ,最有效的诱导愈伤组织的培养基为VW+0.1 mg/L BA+0.1 mg/L2 , 4-D+60 g/L蔗糖或者VW+0.3 mg/L BA+0.1 mg/LNAA+40 g/L
蔗糖。愈伤组织在被转到不含植物激素的VW培养基上易形成原球茎。组织学观察证实了体细胞胚胎结构的形成 ,暗示了试验中诱导
的愈伤组织即为体细胞胚。
关键词 蝴蝶兰;愈伤组织;原球茎;体细胞胚胎发生
中图分类号 Q943.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)25-08068-03
Callus Induction and Somatic Embryogenesis of Phalaenopsis
LV Xiao-hui et al (Bioengineering Department , Zhengzhou University, Zhengzhou , Henan 450001)
Abstract Callus induction and plant regeneration through somatic embryogenesis in Phalaenopsis were researched.Protocorm-like body(PLB)segments
formed callus on VW medium with sucrose.The results showed that the medium containing 0.1 mg/ L BA , 0.1 mg/L 2 ,4-D and 60 g/L sucrose or 0.3
mg/L BA , 0.1 mg/L NAA and 40 g/L sucrosewas effective for callus induction.The callus easily formed PLBs after being transferred to VW medium
without plant hormone.Histological observation proved that the somatic embryo structure formation and suggested that the callus induced in this work was
somatic embryos.
Key words Phalaenopsis;Callus;Protocorm-like body(PLB);Somatic embryogenesis
蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属 ,深受广大兰科爱
好者的欢迎。由于蝴蝶兰是单轴气生兰 ,植株很少发育侧
枝 ,因此利用传统的无性繁殖方法远远不能满足商品化生产
的要求[ 1] 。蝴蝶兰种子极为细小 ,多发育不完全 ,通过种子
萌发而来的实生苗易发生基因变异 ,从而无法保持母本的优
良性状[ 2] 。因此 ,组织培养已成为蝴蝶兰大量繁殖的最有效
手段[ 3] 。目前在利用原球茎诱导途径和丛生芽途径进行快
繁方面已做了大量的工作 。然而对蝴蝶兰愈伤组织诱导的
报道较少。该试验通过由体细胞胚胎发生形成愈伤组织而
来的蝴蝶兰植株再生体系的建立 ,为寻找蝴蝶兰快繁的新方
法提供基础 。
1 材料与方法
1.1 材料 蝴蝶兰的原球茎 。
1.2 方法 试验中如无特殊说明 ,则以添加 10 g/L琼脂的
VW培养基为基本培养基 ,将原球茎横切接种于 VW培养基。
为了研究植物生长调节因子和蔗糖浓度对原球茎诱导愈伤
组织的影响 , 2 , 4-D(0、0.1、0.5、1 mg/L)、NAA(0、0.1 、0.5、1
mg/L)、6-BA(0 、0.1 、0.3 、0.5mg/L)和蔗糖(0 、20、40、60 g/L)被
添加到基本培养基中。所有的培养基在灭菌前将 pH值调至
5.4。原球茎在温度为 25 ℃、光照时间为 16 h的条件下培养
约 8周得到愈伤组织。
1.3 组织学和形态学观察 将材料固定在福尔马林—醋酸
—70%酒精固定液(体积比为 1∶1∶18)中 24 h ,用系列浓度的
酒精进行脱水后用石蜡包埋。将切片(10 μm厚)在 0.5%固
绿液中染色 ,以便显微观察。
2 结果与分析
2.1 6-BA、2 ,4-D和蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响 在添
加了蔗糖和植物生长调节子(PGR)的培养基上 ,许多 PLB可
以诱导出愈伤组织(图 1)。愈伤组织在大小和颜色上差异较
大 ,或较大呈亮黄色 ,或较小呈浅黄色。从表 1可以看出 ,蔗
作者简介 吕晓辉(1980-),女 ,河南镇平人 ,硕士研究生 ,研究方向:花
卉植物组织培养。
收稿日期 2007-05-16
糖因素的极差(R)最大 ,2 ,4-D次之 , 6-BA最小 ,说明蔗糖对
愈伤组织诱导的影响最大 ,其次是 2 ,4-D ,6-BA影响最小。
图1 由原球茎诱导的愈伤组织
评价各因素水平平均值 ,发现 6-BA和 2 ,4-D因素均为
0.1mg/L 、蔗糖因素为 60 g/L时 ,诱导率达 57%。但表 1表
明 ,当 6-BA 0.3mg/L 、2 , 4-D 0.1mg/L 、蔗糖 40 g/L时 ,诱导率
最大(59%)。后者虽数值较大 ,但诱导的愈伤组织较小且颜
色浅黄 ,因此最佳培养基组合仍为VW+0.1 mg/L BA+0.1
mg/L 2 ,4-D+60 g/L蔗糖 ,诱导率可达 57%。
表1 6-BA、2 ,4-D和蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响
试验号 6-BA∥mg/L 2 , 4-D∥mg/ L 蔗糖∥g/ L 诱导率∥%
1 0 0 0 0
2 0 0.1 20 48
3 0 0.5 40 46
4 0 1 60 40
5 0.1 0 40 44
6 0.1 0.1 60 57
7 0.1 0.5 0 0
8 0.1 1 20 43
9 0.3 0 60 44
10 0.3 0.1 40 59
11 0.3 0.5 20 39
12 0.3 1 0 0
13 0.5 0 20 42
14 0.5 0.1 0 0
15 0.5 0.5 60 38
16 0.5 1 40 29
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007 ,35(25):8068-8070 责任编辑 刘月娟 责任校对 俞洁
2.2 6-BA、NAA和蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响 在添
加有NAA的培养基上可诱导出颗粒状的黄色愈伤组织 ,与
含有 2 , 4-D的培养基上诱导出的愈伤组织没有明显的不同。
较高浓度的NAA阻碍了愈伤组织的诱导率。从表 2可以看
出 ,蔗糖因素的极差(R)最大 ,NAA次之 , 6-BA最小 ,说明蔗
糖对愈伤组织诱导的影响最大 ,其次是 NAA , 6-BA影响最
小。评价各因素水平平均值 ,发现 6-BA 0.3 mg/L 、蔗糖 40
g/L 、NAA 0.1 mg/L时 ,诱导率最大 。因此 ,最佳培养基组合
为VW+0.3 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖 ,诱导率
可达 59%。
表 2 6-BA、NAA和蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响
度验号 6-BA∥mg/ L NAA∥mg/ L 蔗糖∥g/ L 诱导率∥%
1 0 0 0 0
2 0 0.1 20 49
3 0 0.5 40 48
4 0 1 60 39
5 0.1 0 40 42
6 0.1 0.1 60 53
7 0.1 0.5 0 0
8 0.1 1 20 37
9 0.3 0 60 46
10 0.3 0.1 40 59
11 0.3 0.5 20 47
12 0.3 1 0 0
13 0.5 0 20 41
14 0.5 0.1 0 0
15 0.5 0.5 60 38
16 0.5 1 40 28
2.3 体细胞胚胎的形成及组织学观察 在光照下将愈伤组
织转到不含激素的基本培养基上时 ,愈伤组织由黄色变为绿
色(图 2), 3～ 4周后从愈伤组织的表层形成体细胞胚 ,并逐
渐形成一个独立的细胞。这些体细胞胚由比愈伤组织细胞
还小的胚细胞组成(图 3),进而体细胞胚继续膨胀形成一个
突起 ,最终转化为 PLB(图 4)。第二个叶鞘从相对于第一个
部位的茎尖处萌发(图 5),大部分PLB都带有冠毛(图 6)。
图 2 在不含植物生长调节因子培养基上的愈伤组织
3 讨论
3.1 碳源对从原球茎形成愈伤组织的影响 研究发现 ,在添
加了植物生长调节因子(PGR)而不含蔗糖的培养基上不能诱
导出愈伤组织。这个结果可能说明愈伤组织的诱导归因于培
养基中的蔗糖 ,而诱导率则受植物生长调节因子的调节。
图 3 由小而密集的胚细胞组成的体细胞胚
图 4 由体细胞胚结构转变而来的且与愈伤组织无血管相连的PLB
图 5 带有两个叶鞘的PLB
大量报道已经证实了碳源对兰科植物在进行体细胞胚
胎发生诱导时的影响。山梨糖醇作为单一碳源最适宜由原
生质体而来的PLBs的分化[ 4] ,蔗糖适用于PLBs根的形成[ 5] ,
麦芽糖和葡萄糖则有利于PLBs的增殖[ 6] 。Ichihashi 报道 ,在
蝴蝶兰和朵丽蝴蝶兰愈伤组织生长上 ,最佳碳源种类和浓度
的选择有很大的不同[ 7] 。万代兰的愈伤组织在较低浓度的
果糖培养基上转变成 PLBs[ 8] 。这些结果暗示了培养基中的
糖含量影响单轴兰科植物愈伤的生成 ,最佳碳源的种类和水
平因种属的不同而不同[ 9] 。
3.2 植物生长调节因子对愈伤组织诱导的影响 大量研究
证实 ,在大部分被子植物胚形愈伤组织的诱导上 ,外源生长
806935卷 25期 吕晓辉等 蝴蝶兰愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生的研究
图 6 长有冠毛的 PLB
素是最重要的生长调节因子[ 10-11] 。然而 ,从目前的研究看 ,
很多植物需要添加细胞分裂素和生长素去启动响应 ,并且在
某种情况下防止愈伤组织的死亡。外源细胞分裂素的需求
与维持生长素 、分裂素的平衡有关。这种平衡在调控细胞分
裂这一愈伤组织形成的重要过程中发挥着协同的作用[ 12] 。
在试验中 ,最高的诱导率在添加了 0.1 mg/L BA 、0.1
mg/L 2 , 4-D或 0.3mg/L BA 、0.1mg/L NAA的培养基上得到。
Huan研究表明 ,2 , 4-D或NAA的单独使用不能从原球茎诱导
出愈伤组织 ,与细胞分裂素的结合才能启动愈伤组织的诱
导;在比较二者的效力时发现 ,NAA比 2 , 4-D有效[ 13] 。而试
验表明 ,生长素的单独使用也可诱导愈伤组织 ,只是愈伤组
织形状较小 、颜色浅黄。Ishii支持了该试验结果[ 9] 。NAA和
2 ,4-D在诱导愈伤组织的作用上没有明显的效力差别 ,诱导
出的愈伤组织也没有明显的不同 。
生长素和细胞分裂素的组合水平是导致细小颗粒状的
愈伤组织向易脆致密的愈伤转化的主要原因。试验中发现 ,
较低水平的NAA或 2 ,4-D刺激了细胞数量的增加 ,较高水平
的 6-BA促进了愈伤组织颗粒状结构的诱导 ,NAA或 2 , 4-D
与 6-BA的组合对于长期维持愈伤组织的活力和再生能力至
关重要[ 14] 。
3.3 PLB的再生 虽然PGR在愈伤组织的诱导上起重要
作用 ,但是将愈伤组织转在不含激素的基本培养基上继续培
养时得到了再生的 PLB。由不同PGR诱导而来的愈伤组织
在转化PLB的数量上没有明显的不同。PLB的再生不依赖
于PGR的结果[ 15-16] ,但是 Ishii在不含蔗糖而含有 PGR的培
养基上得到了PLB的再生[ 9] 。
大量的研究表明 , PLB的再生可能因种属的不同而不
同。它需要暂时的缓冲或者需要继续在特定的PGR下培养。
在 Cymbidium ensifolium 中 ,当将愈伤组织转入添加有生长素
和细胞分裂素的培养基上时 ,促进了愈伤组织的增殖 ,取消
PGR时又诱导了根状茎的发展[ 10] ;在 Hemerocallis 中 , PLB的
再生需要将愈伤组织在含有生长素的培养基上培养 2周后
再转入 pH值较低的且不含生长素的培养基上[ 17] ;然而对于
D.fimbriatum ,却不需要严格的培养条件 ,不过培养基中硝
酸盐的浓度会影响愈伤组织的生长率[ 18] 。
3.4 组织学观察 愈伤组织的纵断面显示 ,愈伤组织最外
层的薄壁细胞分裂形成胚性细胞团 。胚性细胞团的细胞较
小 、壁薄 、细胞质密集 、核大且居于细胞中央 ,类似于胚胎发
育或胚状体形成时的早期原球胚阶段的细胞。随着发育的
继续 ,这种胚性细胞团的基部细胞开始分化伸长 、增大 ,逐渐
失去分生能力 ,而顶端的细胞分裂能力仍很活跃 ,使得整个
组织形成不规则的突起 ,这些突起逐渐长成卵圆形后形成
PLBs。PLBs是兰科植物所特有的结构 ,是兰科种子胚胎发展
过程早期的结构形式[ 19] 。组织学的观察暗示 ,从愈伤组织
而来的PLBs以及植株再生经历了体细胞胚结构。试验中诱
导的愈伤组织即为体细胞胚。
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8070 安徽农业科学 2007年