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作者简介：刘功成（1988-），男，硕士研究生，研究方向:分子生物物理学。E-mail: liugongcheng@126.com
*通讯作者：曾宪垠（1966-），男，博士，研究员，博士生导师，研究方向：动物生理与生殖免疫调控。
E-mail: xyzeng1966@163.com
重楼叶多糖改善 D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力
刘功成 王作伟 李亭亭 杜金莹 杜小刚 曹晓涵 曾宪垠*
（四川农业大学生命科学院原子能农业应用研究室，四川雅安 625014）


摘要：采用 D-半乳糖注射诱导衰老模型，探讨了重楼叶多糖（PPLPs）对小鼠脾脏免疫功能和抗氧化的影响。分别对小鼠 D-半
乳糖，D-半乳糖和 PPLPs，D-半乳糖和 Vc 以及生理盐水处理，持续 42 d。结果显示：与模型组相比，灌胃 PPLPs 或 Vc 均能
显著增加小鼠脾脏指数（p<0.05），显著上调脾脏免疫相关基因（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4 和 IL-10）mRNA
表达水平（p<0.05），也显著增强了脾脏总超氧化物歧化酶（T-SOD）、铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、谷胱甘肽过氧化
物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性（p<0.05）；同时，灌胃 PPLPs 或 Vc 显著降低了脾脏丙二醛（MDA）含量
（p<0.05）。结果表明，PPLPs 可增强脾脏免疫功能并提高小鼠的抗氧化活性。
关键词：重楼多糖，衰老，免疫，抗氧化，脾脏

The effects of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla on immune function and
antioxidant capacities of mouse spleen tissue in a D-galactose-induced aging mouse model.
LIU Gong-cheng, WANG Zuo-wei, LI Ting-ting, DU Jin-ying, DU Xiao-gang，Cao Xiao-han，ZENG Xian-yin*
(Isotope Research Laboratory, College of life science, Sichuan Agricultural University, Ya’an，Sichuan，625014)

Abstract：In the present study, the protective effects of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla (PPLPs) against aging in an
accelerated aging mice model induced by D-galactose were investigated. A group of 2-month-old C57BL/6J mice were treated daily with
D-galactose, D-galactose combined with PPLPs, D-galactose combined with vitamin C (Vc), and control buffer for 42d. The results
showed that compared with the model group, oral administration of D-galactose-induced aging mice with either PPLPs or Vc both
significantly increased spleen indices（p<0.05）, the mRNA expression levels of immune function related genes(T-bet, GATA, IFN-γ,
IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10) （p<0.05） and the total superoxide dismutase (T-SOD), CuZn superoxide dismutase(CuZn-SOD)，
glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) in spleen tissue were significantly higher in both PPLPs and Vc group than those in
the model group（p<0.05）; besides, the malondialdehyde(MDA) concentrations were decreased in PPLPs and Vc group compared to
those in the model group（p<0.05）. The results indicate that PPLPs is able to enhance the immune function and improve the antioxidant
capacities of mouse spleen tissue.
Key words: PPLPs; aging; immunity; antioxidantation; spleen
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A
目前，我国已进入人口老龄化的快速发展阶段。2010 年，全国 60 岁以上的老年人口已接近 2 亿，预计到 21 世纪中叶，将
达到 4.5 亿，约占总人口的 1/3[1]。免疫学理论认为免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要因素。另外，新陈代谢会产生活性氧
（ROS），如超氧负离子自由基（O2-·），过氧化氢(H2O2)和羟基自由基（·-OH）等。ROS 可参与细胞内的信号传导，但过多
的 ROS 会扰乱机体正常氧化/抗氧化平衡，损害与免疫相关细胞的蛋白质、脂质、核酸，从而破坏了免疫细胞的结构和功能，
导致机体免疫功能下降[2]。因此，机体 ROS 含量与衰老可能存在着密切的关系。
多糖分布于植物、动物、微生物和藻类中，是维持生命机器正常运转的基本物质之一。研究表明，多糖具有免疫调节[3]、
抗氧化[4]等功能，且由于多糖对细胞几乎没有毒副作用，现在越来越受到当今医药与食品行业的关注。重楼是一种传统中药，
广泛分布于中国西南地区，具有消肿、缓解疼痛、有效治疗蛇虫咬伤及跌打损伤等作用[5]，并作为抗菌剂和止痛剂应用于临床
[6-7]，但对于重楼多糖免疫调节作用的研究鲜见报道。
为此，本试验拟研究重楼多糖对小鼠脾脏免疫功能和抗氧化活性的影响，为寻找和开发新的安全、有效的免疫增强剂和天
然抗氧化剂提供科学依据。
1.材料和方法
网络出版时间：2015-03-09 14:02
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20150309.1402.008.html

1.1 材料与仪器
昆明小白鼠 成都达硕生物科技有限公司(动物许可证号：SCXK(川)2013-24)；重楼多糖 四川农业大学生命科学院植物学
系提供[8]；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量 PCR 试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还
原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA） 南京建成生物工程研究所。
CFX96 荧光定量 PCR 仪 百乐科技有限公司；UV-1100 紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；ST16R 台式高
速冷冻离心机 北京联合科力科技有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；DGG-9140A 电热恒温鼓风干
燥箱 上海齐欣科学有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 动物分组和处理 试验选取 7~8 周体重 25~30 g 的健康雌性昆明小白鼠，40 只小鼠适应性喂养 1 周后，随机分为 4 组，每
组 10 只。其中第Ⅰ组，每天皮下注射 0.2 mL 生理盐水（0.9%）和灌胃 0.25 mL 蒸馏水，为正常对照组（Normal）；第Ⅱ组，
每天皮下注射 0.2 mL D-半乳糖[120 mg/(kg·d)]和灌胃 0.25 mL 蒸馏水，为模型组（Model）；第Ⅲ组，每天皮下注射 0.2 mL D-
半乳糖[120 mg/(kg·d)]和灌胃 0.25 mL Vc[200 mg/(kg·d)]，为阳性对照组（Vc）；第Ⅳ组，每天皮下注射 0.2 mL D-半乳糖[120
mg/(kg·d)]和灌胃 0.25 mL 重楼多糖[200 mg/(kg·d)]，为多糖处理组（PPLPs）。试验处理持续 42 d，第 43 d 起禁食 24 h，称重
后脱颈处死所有试验鼠，收集小鼠脾脏组织，称重。将一部分脾脏组织进行匀浆、离心取上清液（10 mg/mL），待测；另一部
分脾脏组织液氮研磨，通过苯酚-氯仿法提取组织总 RNA，电泳检测 RNA 以检测其完整性以及是否污染。
1.2.3 脾脏指数的测定 采用如下公式：脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体重（g）[9], 计算小鼠脾脏指数。
1.2.4 脾脏免疫功能相关基因的检测 实时荧光定量 PCR 检测小鼠脾脏免疫功能（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-
4、IL-10）相关基因的表达量。所提取出来的 RNA 采用反转录试剂盒将其反转录成 cDNA，相关操作严格按照操作说明书进
行。然后以 cDNA 为模板在特定引物下进行定量检测，每个样品重复 3 次。PCR 程序为：95 ℃ 10 s，然后进行 40 循环的
PCR：95 ℃变性 5 s，58~61 ℃退火+延伸 25 s，最后进行溶解曲线以监测 PCR 扩增产物的特异性。目的基因 mRNA 相对表达
水平采用标准曲线法进行计算。待检测基因及基因检测所采用的引物序列见表 1。
表 1 免疫功能相关基因及内参基因引物序列
Tab. 1 The primer sequences of immunity-related and reference genes
基因 引物序列（5-3） 扩增产物大小（bp） Genbank 收录号
TNF-α F: AACCTCAGATAAGCCCGTCG
R: CCAATGCCCTCCTGGCCAACG
128 NM_013693.1
[10]

IL-2 F: CGGCATGTTCTGGATTTGACT
R: CCATCTCCTCAGAAAGTCCACC
168 NM_008366.3

IL-4 F: TTGAACGAGGTCACAGGAGAAGG
R: CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG
112 NM_008091
IL-10 F: GACAACATACTGCTAACCGACTCCT
R: TCTCACCCAGGGAATTCAAATG
160 NM_010548

IFN-γ F: CAGCAACAGCAAGGCGAA
R: CTGGACCTGTGGGTTGTTGAC
199 NM-008337.3

T-bet F: CCCATTCCTGTCCTTCACCG
R: GCTGCCTTCTGCCTTTCCAC
139 AF241242

GATA-3 F: AACTGCGGGGCAACCTCTA
R: CGGTTCTGCCCATTCATTTTAT
101 NM_008091

β-actin F: CGGTTCCGATGCCCTGAGGCTC
R: CAGCAACAGCAAGGCGAA
108 NM-007393
[4]

注：TNF-α，肿瘤坏死因子 α；IL-2，白细胞介素 2；IL-4，白细胞介素 4；IL-10，白细胞介素 10；IFN-γ，干扰素 γ；T-bet，T 细胞调节蛋白；
GATA-3，GATA 结合蛋白 3；β-actin，β 肌动蛋白
1.2.6 脾脏抗氧化酶及 MDA 含量测定 总超氧化物歧化酶（T-SOD）和铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）：采用黄嘌呤氧化
酶法；过氧化物酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）：采用紫外分光光度法；丙二醛（MDA）：采用硫代巴比妥酸

法。脾脏蛋白含量采用紫外分光光度计法测定。以上测定均按照相应的试剂盒使用说明进行测定。
1.3 数据的统计分析
利用 SPSS 17.0 统计学软件中 ANOVA 对所测数据进行单因子方差分析，采用 LSD 法进行数据间多重比较，结果以平均值
±标准差表示，p<0.05 表示数据差异显著。

2 结果与分析
2.1 小鼠体重及脾脏指数
脾脏是人体最大的淋巴器官和外周免疫器官，含有大量 B 细胞和 T 细胞，能产生与免疫调节有关的活性物质，是研究免疫
系统的一个极其重要的组织[11-12]。如表 2 所示，与正常对照组相比，连续注射 D-半乳糖显著降低了小鼠体重和脾脏指数
（p<0.05）。与模型组相比，连续注灌胃 PPLPs 或 Vc 均显著提高小鼠体重和脾脏指数（p<0.05），且将脾脏指数维持在正常
对照组水平（p>0.05）。PPLPs 组小鼠脾脏指数与 Vc 组相比差异不显著（p>0.05）。说明 PPLPs 和 Vc 可以改善 D-半乳糖引起
的脾脏萎缩，明显提高 D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏指数，这与前人研究结果一致[13-14]。
表 2 小鼠体重及脾脏指数（x±s，n=10）
Tab. 2 The body weights and spleen indices of mice（x±s，n=10）
组别 体重（g） 脾指数（mg/g）
正常对照组 31.89±1.13b 4.13±1.09b
模型对照组 29.02±1.67a 2.69±0.87a
阳性对照组 31.32±1.19b 4.08±0.92b
重楼多糖组 32.55±1.31b 3.96±1.13b
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）
2.2 小鼠脾脏免疫基因 mRNA 表达水平
小鼠脾脏免疫相关基因 mRNA 表达水平如图 1 所示。与正常对照组相比，连续注射 D-半乳糖显著下调小鼠脾脏 T-bet、
GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4 和 TNF-α 及 INF-γ mRNA 表达水平（p<0.05）。而连续注射 D-半乳糖的同时灌胃 Vc 或 PPLPs，
均能显著上调小鼠脾脏组织 T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α 及 INF-γ mRNA 表达水平（p<0.05），且 Vc 组与
PPLPs 组的 T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α 及 INF-γ mRNA 表达水平均无显著差异（p>0.05）。上述结果说明，重
楼多糖能通过提高体液免疫和细胞免疫作用而增强机体的免疫功能。这与封海波等人报道的川牛膝多糖可以提高小鼠免疫功能
相关基因表达水平的研究结果相一致[4]。
图 1 小鼠脾脏 T-bet、
GATA-3、IL-2 、IL-4、IL-10、TNF-α 及 INF-γ mRNA 表达水平
Fig.1 The mRNA expression levels of T-bet，GATA-3，IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α and INF-γ in spleen tissue of mice
注：各组间不同字母表示差异显著（p<0.05）
2.3 小鼠脾脏抗氧化酶活性
小鼠脾脏组织抗氧化酶酶活性如图 2 所示。与正常对照组相比，连续注射 D-半乳糖显著降低小鼠脾脏组织中 T-SOD、
CuZn-SOD、CAT 和 GSH-Px 酶活（p<0.05）。在连续注射 D-半乳糖的同时灌胃 PPLPs 或 Vc 均能显著提高小鼠脾脏 T-SOD、
CuZn-SOD、CAT、GSH-Px 酶活（p<0.05）。灌胃 PPLPs 与灌胃 Vc 相比，除 GSH-Px 酶活无显著差异外（p>0.05），灌胃 Vc
组 T-SOD、CuZn-SOD、CAT 酶活，都有显著高于灌胃 PPLPs 组（p<0.05）。这些结果表明 PPLPs 可以通过提高抗氧化相关酶
的活性，提高其抗氧化作用。这与李俊丽等人的研究结果一致[15-16]。


图 2 小鼠脾脏 T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px 和 CAT 酶活
Fig. 2 Total superoxide dismutase and Cu, Zn superoxide dismutase in spleen tissue of mice
注：组间不同字母表示差异显著（p<0.05）
2.4 小鼠脾脏 MDA 含量
D-半乳糖属生理性营养成分，进入机体后，在半乳糖酶的作用下，生成醛糖和过氧化氢，过氧化氢过量会使细胞膜的组成
成分不饱和脂肪酸分解，产生MDA，从而破坏细胞的结构和功能 [17]。小鼠脾脏MDA含量如图3所示，与正常对照组相比，连
续注射D-半乳糖显著增加小鼠脾脏组织MDA含量（p<0.05），说明大量自由基的产生严重损伤机体，导致丙二醛(MDA)的产生
和积累。与模型组相比，连续灌胃PPLPs或Vc均显著降低小鼠脾脏组织MDA含量（p<0.05）且与正常对照组无显著差异
（p>0.05）。PPLPs组与Vc组间小鼠脾脏组织MDA含量无明显差异（p>0.05）。表明Vc可以抑制脂质过氧化产物MDA的产生。
以上结果表明，重楼多糖可能通过抑制机体内的脂质过氧化，减轻对机体组织造成的氧化损伤，这与前人研究结果一致 [16,18]。

图 3 小鼠脾脏 MDA 含量
Fig. 3 MDA contents in spleen tissue of mice
注：组间不同字母表示差异显著(p<0.05)

3.讨论与结论
衰老的免疫学假说认为免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要原因，免疫系统从根本上参与了机体的衰老过程[19]。目前衰
老研究的模型中，D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠模型较为公认[20-21]，衰老的代谢学说认为衰老是机体代谢性障碍的结果。
连续给动物注射D-半乳糖，在醛糖还原酶的催化下，还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响
正常的渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，最终导致衰老的发生[22]。故本试验以重楼多糖为研究材料，探讨了其对
D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力的影响。
初始 T 细胞分化为 Thl 或 Th2 的过程是受转录因子 T-bet 和 GATA-3 蛋白调控的。T-bet 诱导 T 细胞分化为 Thl 细胞；
GATA-3 只在 Th2 型细胞中表达并调控相关细胞因子的分泌[21]。在分子免疫学上，Thl 型细胞主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α，
主要是通过细胞因子作用于巨噬细胞、NK 细胞、CTL 等细胞，提高其吞噬活性，发挥细胞免疫反应。Th2 型细胞主要产生 IL-
4 和 IL-10，主要通过 CK 可刺激 B 淋巴细胞增殖并产生抗体，故其主要功能为辅助体液免疫反应[23]。连续 42 d 给雌性小鼠皮
下注射 D-半乳糖显著降低小鼠脾脏 T-bet、GATA-3 以及免疫相关基因（IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）mRNA 的表达。
灌胃 Vc 和 PPLPs 均可提高小鼠脾脏中 T-bet、GATA-3 以及免疫功能相关基因 mRNA 表达水平，这可能是 PPLPs 增强小鼠脾
脏免疫功能的机理之一。
动物体内的抗氧化系统包括抗氧化酶（SOD、CAT）和 GSH 等抗氧化剂，它们可以及时清除体内多余的自由基，防止自

由基对细胞产生损伤[24]。连续 42 d 给雌性小鼠灌胃 D-半乳糖显著降低小鼠脾脏抗氧化物酶（T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px、
CAT）活性，说明 D-半乳糖在半乳糖酶作用下分解，产生过量自由基严重损伤细胞，导致脂质过氧化物—丙二醛(MDA)的产
生。注射 D-半乳糖的同时给小鼠灌胃 Vc，小鼠脾脏抗氧化酶活性、MDA 含量保持在正常对照组小鼠水平，给小鼠注射 D-半
乳糖的同时灌胃 PPLPs 与灌胃抗氧化剂 Vc 效果相当。因而推测重楼多糖可能通过提高超氧化物歧化酶活性，增强其对自由基
的清除能力，抑制脂质过氧化，降低丙二醛含量，从而减轻对机体组织的损伤以延缓衰老。
综上所述，重楼多糖能显著增强小鼠脾脏免疫功能及抗氧化能力，可作为天然抗氧化剂的重要来源。

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