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China Pharmaceuticals
2013年 7月 5日 第 22卷第 13期
Vol． 22，No． 13，July 5，2013
＊广东省中医药局建设中医药强省科研课题，项目编号: 20131030; 广东省深圳市科技计划项目 (医疗卫生类 )，项目编号: 201203293。
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(收稿日期:2012 － 11 － 26 )
金钱草为《中国药典(一部)》1985 年版、2000 年版、2005 年 版和 2010 年版收载的品种 [ 1 ]，来源为报春花科 Prmuhceae珍珠菜
·药物研究·
Drug Research
高效液相色谱法测定金钱草胶囊中槲皮素的血药浓度＊
王启平 1，王洪锐 2，李 东 3，朱杰华 4，林永胜 5，冯雪科 2，陈玩珊 3
(1． 广东省深圳市沙井人民医院，广东 深圳 518104; 2． 广东省深圳市福永人民医院，广东 深圳 518103;
3． 广东省深圳市人民医院·暨南大学第二临床医学院，广东 深圳 518020;
4． 广东省深圳市大鹏人民医院，广东 深圳 518120; 5． 广东省深圳市南澳人民医院，广东 深圳 518121)
摘要:目的 建立金钱草胶囊中槲皮素的血药浓度测定方法，为临床应用和药代动力学研究提供技术参考。方法 采用高效液相色谱 －
紫外检测方法测定，色谱柱为 Kromasil C8 柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm)，流动相为甲醇 －乙腈 － 0． 4%磷酸溶液 ( 40 ∶ 10 ∶ 50 )，流速
1 mL /min，柱温 30 ℃，进样量 20 μL，检测波长 360 nm。血样提取方法，以 β －葡萄糖苷酸酶水解后，以乙酸乙酯提取，氮气流吹干后复
溶进样。结果 槲皮素保留时间约为 8． 8 min，金钱草胶囊中槲皮素的血药浓度线性范围 0． 08 ～ 12 μg /mL，最低定量限为 0． 05 μg /mL，
检测限为 0． 02 μg /mL。方法平均回收率为 97． 50% ～ 102． 50%，水解提取回收率为 76． 46% ～ 87． 43%，日内精密度 RSD为 4． 18% ～
6． 17%，日间精密度 RSD为 5． 08% ～ 8． 63%。结论 方法简便，分析速度快，灵敏度较高，重复性好，适用于临床血药浓度测定及药代
动力学研究。
关键词:金钱草胶囊;槲皮素;血药浓度; 高效液相色谱法
中图分类号:R284． 1;R285． 6;R286 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2013 )13 － 0019 － 03
Determination of Plasma Quercetin Concentration after Oral Administration of
Jinqianchao Capsules by HPLC
Wang Qiping1， Wang Hongrui2， Li Dong3， Zhu Jiehua4， Lin Yongsheng5， Feng Xueke2， Chen Wanshan3
( 1． Shajing People s Hospital， Shenzhen， Guangdong， China 518104; 2． Fuyong People s Hospital， Shenzhen， Guangdong， China
518103; 3． Shenzhen Municipal People s Hospital， Second Clinical College， Jinan University， Shenzhen， Guangdong， China 518020;
4． Dapeng People s Hospital，Shenzhen，Guangdong，China 518120; 5． Nan ao People s Hospital， Shenzhen，Guangdong，China 518121)
Abstract: Objective To develop an HPLC method for the determination of quercetin concentration in human plasma to provide the
technical reference for its pharmacokinetic study and clinical application． Methods The HPLC － UV method was used． The separation
was performed on the Kromasil C8 column (250 mm × 4． 6 mm，5 μm) with the mobile phase of methanol － acetonitrile － 0． 4% phosphoric
acid solution (40 ∶ 10 ∶ 50 ) ． The flow rate was 1． 0 mL /min and the detection wavelength was 360 nm． The column temperature was 30℃
and the injection volume was 20 μL． In the blood sample extraction method，after β － glucuronidase hydrolysis，the plasma was extracted
with ethyl acetate and dried under nitrogen． The residue was redissolved with mobile phase and injected into the sampler． Results The
retention time of quercetin was about 8． 8 min． The calibration curve for quercetin was linear in the concentration range of 0． 08 －
12． 0 μg /mL． The lowest limit of quantitation ( LOQ ) for quercetin was 0． 05 μg /mL; the limit of detection ( LOD ) was 0． 02 μg /mL． The
methodological recovery rate of low，medium and high concentration was 97． 50% － 102． 50% ． The hydrolysis extraction recovery rate was
76． 46% － 87． 43% ． The relative standard deviations ( RSD ) for intra － day and inter － day assay were 4． 18% － 6． 17% and 5． 08% －
8． 63% ，respectively． Conclusion The established HPLC method is simple，rapid and highly sensitive with good repeatability，sutable for
the determination of quercetin concentration in human plasma and its pharmacokinetic study．
Key words: Jinqiancao Capsule; quercetin; plasma concentration; HPLC
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
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Vol． 22，No． 13，July 5，2013
1. 槲皮素
A. 空白血浆 B. 对照品 C. 对照品 +空白血浆 D. 样品血浆
图 1 人血浆中槲皮素高效液相色谱图
属 Lysimachia双子叶植物过路黄 Lysimachia christinae Hance的新
鲜或干燥全草，因其叶子近圆形，很像金钱故名金钱草，又称铜钱
草。四川《百草堂验方抄本》[清代乾隆年间(1736 － 1795)]中就有
金钱草治疗“黄痧走疸”的记载，“黄痧走疸周身黄，金钱草是救命
王，炕干为末冲甜酒，草药更比官药强”，迄今至少有 200 年的应
用历史。金钱草味苦、酸，微寒，归肝、胆、肾、膀胱四经，主治清热
解毒、利尿排石、活血散瘀 [ 2 － 4 ]。中药制剂金钱草胶囊是以金钱草
新鲜或干燥全草为原料的单味现代中药制剂，为中药八类新药
(国药准字 Z20060007)，为全国独家医保品种。现代药理研究 [ 2 － 6 ]
证明，金钱草中药制剂口服可用于肝胆结石、胆囊炎、黄疸性肝
炎、泌尿系结石、水肿、跌打损伤、毒蛇咬伤、毒蕈及药物中毒，外
用治疗化脓性炎症、烧烫伤。金钱草不良反应较少，临床应用越来
越广泛 [ 4 ]，但目前国内尚无金钱草胶囊血药浓度测定方法的报
道。笔者选择金钱草胶囊中有效成分槲皮素(quercetin)为指标，参
考国内外有关文献 [ 1，7 － 13 ]，并根据槲皮素的性质，建立了血药浓度
测定方法，为临床血药浓度测定和药代动力学研究提供分析手段。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪(G1311A四元泵，G1322A真空
脱气机，G1315B － DAD检测器，D1316A柱温箱，rheodyne － 7725i
进样器，ChemStation 色谱工作站);AG285 型电子天平(梅特勒托
利多仪器有限公司);XW － 80A 型旋涡混合器(上海医科大学仪
器厂);KQ5200DB型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司 );
高速离心机 (雅培公司 );pHS － 3C 型数字 pH 计(上海精科雷磁
仪器厂)。金钱草胶囊 (四川宝光药业有限公司，规格为每粒装 0． 4 g，
批号为 120203A);槲皮素对照品(国家药品标准物质，供高效液
相色谱法测定，含量为 96． 5%，批号为 100081 － 200907，中国食
品药品检定研究院); 甲醇(色谱纯，天津四友精细化工有限公
司 );乙腈(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司 );β －葡萄糖
苷酸酶 (H － 2型，美国 Sigma公司 );硫酸酯酶(H － 1 型，美国 Sig-
ma 公司 ); 磷酸、乙酸乙酯及其他试剂均为分析纯，水为注射用
水。所有试剂及缓冲液使用前均经过 0． 45μm微孔滤膜过滤。
2 方法与结果
2．1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C8 柱 ( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm);流动相:甲
醇 －乙腈 － 0． 4%磷酸溶液 ( 40 ∶ 10 ∶ 50 );流速:1 mL /min;柱温:
30 ℃; 检测波长:360 nm; 进样量:20 μL。在此色谱条件下，槲皮
素的保留时间为 8． 8 min，理论板数按槲皮素计计算不低于 3
000，峰对称因子 ( AS )为 1． 08，见图 1。
2．2 溶液配制
精密称取槲皮素对照品 10 mg，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇
溶解并定容至刻度，制得质量浓度为 400 μg /mL的槲皮素对照
品贮备液，置 4 ℃冰箱中备用。临用时分别取槲皮素对照品贮备
液 0． 05，0． 10，0． 50，1． 50，2． 50，5. 00 mL，置 10 mL容量瓶中，以
流动相稀释至刻度，得系列质量浓度对照品溶液 ( 2． 0，4． 0，20． 0，
60． 0，100． 0，200． 0 μg / mL)。精密量取磷酸 4 mL，置 1 000 mL容
量瓶中，加水稀释，定容至刻度，混合均匀，经 0． 45 μm微孔滤膜
过滤，即得 0． 4%磷酸溶液。
2．3 样品预处理
取全血 4． 0 mL，置干燥管中，静置 30 min，10 000 r / min离心
10 min。取上清液，置 1． 5 mL离心管中，密封，做好标记，置 － 20 ℃
保存直到分析。分析前，血浆样品室温自然解冻后，精密吸取
0． 5 mL，置 10 mL具塞锥形离心管中，加入 40 μL β －葡萄糖苷酸
酶，调 pH 至 4． 5 ～ 5． 0，旋涡混合 30 s，37 ℃水解 8 h 后，加入乙
酸乙酯 6 mL(分 2 次，每次 3 mL)，分别旋涡提取 5 min，合并萃取
液，10 000 r /min离心 10 min，取乙酸乙酯层，50 ℃水浴氮气流吹
干，残渣以 100 μL甲醇溶解，旋涡 30 s，10 000 r /min 离心 3 min
后取 20 μL进样。
2．4 方法专属性试验
分别取 6 名健康者空白血浆 0． 5 mL，按 2． 3 项下操作，获得
空白血浆样品典型色谱图 (图 1 A);将一定浓度槲皮素对照品溶
液加入空白血浆中，同法操作，获得典型色谱图(图 1 C);健康受
试者口服 4 粒金钱草胶囊后的血浆样品，同法处理后得样品色谱
图(图 1 D)。结果表明，在上述血浆样品预处理及色谱条件下，血
浆中的内源性物质及金钱草胶囊可能的代谢物均不干扰样品测
定，峰形对称性好，基线噪音小。
2．5 标准曲线及检测限确定
取 10 mL具塞锥形离心管 8 支，分别精密加入健康体检者混
合空白血浆 0． 5 mL。除空白管外，其余每支管精确加入不同质量
浓度的槲皮素对照品溶液 20 μL，旋涡混合 30 s，得质量浓度分别
为 0． 08，0． 16，0． 80，2． 40，4． 00，8． 00，12． 00 μg /mL 的系列血浆
样品，然后按血浆样品预处理方法处理后进样分析，记录槲皮素
峰面积，并以峰面积 ( A )对槲皮素对照品质量浓度 ( C )进行线性
回归，得回归方程 A = 385． 85 C － 32． 518，r = 0． 998 8 ( n = 7 )。结
果表明，槲皮素质量浓度在 0． 08 ～ 12 μg / mL范围内与峰面积线
性关系良好。
2．6 方法回收率及精密度试验
用空白血浆及对照品溶液配制质量浓度为 0． 16，2． 40，
8． 00 μg / mL 的 3 种槲皮素质控样品，各 6 份，按 2． 3 项下方法
操作，于 1 d 内重复测定 6 次; 连续6 d，每天配制上述 3 种质
量浓度的质控样品进行测定，记录峰面积。将测定结果代入线
性方程，计算浓度，计算日内、日间精密度及方法回收率。结果
见表 1。
日内精密度 日间精密度 方法回收率
(% )
加入质量浓度
(μg /mL)
表 1 方法精密度及回收率测定结果
0． 16
2． 40
8． 00
实测浓度(μg /mL)
0． 151 ± 0． 010
2． 349 ± 0． 121
7． 917 ± 0． 331
RSD (% )
6． 17
5． 15
4． 18
实测浓度(μg /mL)
0． 157 ± 0． 014
2． 359 ± 0． 133
7． 906 ± 0． 401
RSD (% )
8． 63
5． 65
5． 08
102． 5 ± 3． 27
97． 5 ± 2． 11
99． 2 ± 3． 67
mAU
20． 0
10． 0
0
t / min
A
0 6 12 18
B
0 4 6 12
mAU
60． 0
40． 0
20． 0
0 t / min
1
mAU
t / min
C
0 4 8 12
D
mAU
t / min
0 5 10 15 20
6
4
2
0
8
4
0
1
1
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表 2 提取回收率试验结果
加入质量浓度(μg /mL)
0． 16
2． 40
8． 00
对照品峰面积
45． 8718 ± 1． 1874
970． 2835 ± 61． 6276
3 112． 060 9 ± 267． 556 7
血浆样品峰面积
35． 0740 ± 2． 6821
846． 5901 ± 20． 7728
2 689． 112 0 ± 205． 574 3
回收率 (% )
76． 46 ± 5． 34
87． 43 ± 3． 55
86． 53 ± 3． 67
RSD (% )
6． 99
4． 06
4． 24
2．7 提取回收率试验
取空白血浆 0． 5 mL，加入槲皮素对照品溶液适量，分别配制
0． 16，2． 40，8． 00 μg /mL 系列质量浓度的溶液各 6 份，按 2． 3 项
下方法处理、测定;另取空白血浆0． 5 mL，不加入槲皮素对照品，
按 2． 3 项下方法处理，在取乙酸乙酯层后加入相同量的槲皮素对
照品溶液，旋涡 30 s，同法吹干，复溶后测定。将两组样品对应质
量浓度的槲皮素峰面积进行比较，计算提取回收率。结果见表 2。
2．8 稳定性考察
用空白血浆配制质量浓度为 0． 16，2． 40，8． 00 μg / mL 的槲
皮素样品，各吸取 2 mL，置离心管中，每个质量浓度 9 份。其中
3 份在室温下放置 0，1，2，4，8，12 h 后按 2． 3 项下方法处理、测
定;3份进行冻融循环处理，样品放入 － 20 ℃冰箱中冷冻，24 h后
解冻、处理、测定，重复冻融 3 次;另外3 份分别在 － 20 ℃冰箱中
保存 1，2，4 周后，再按 2． 3 项下方法处理、测定。3 个质量浓度样
品在室温下测定结果的 RSD分别为 3． 90%，3． 41%，4． 48%，冻
融循环条件下测定结果的 RSD 分别为 4． 70%，4． 89%，4． 03%，
冷冻条件下测定结果的 RSD为 6． 98%，4． 09%，4． 36%。结果表
明，槲皮素样品在室温放置和冷冻条件下均有较好的稳定性。
3 讨论
目前有关药代动力学的研究多集中在化学药物，对中药药代
动力学的研究相对较少。中药药代动力学的研究与发展对于中药
新药设计，改进中药剂型，提供高效、速效、长效、低毒副作用的中
药制剂，特别是对于指导临床合理用药、推动中药现代化、中药走
向世界都具有重大的现实意义 [14 ]。金钱草胶囊为中草药金钱草单
方制剂，槲皮素是金钱草的主要有效成分之一，主要以苷的形式
存在。为研究金钱草制剂的人体药代动力学，笔者建立了金钱草
胶囊中有效成分槲皮素的血药浓度测定方法。
槲皮素属多羟基黄酮类化合物，具有多种生理活性。曾试用
了 Hypersil ODS C18 柱和 Kromasil C8 柱两种色谱柱，峰形上无明
显差异，但后者的保留时间更适当，因此选用 C8 柱。配制质量浓
度为 4 μg /mL 的槲皮素对照品甲醇溶液，在 200 ～ 700 nm 波长
范围内扫描，结果在 360 ～ 374 nm 波长处有明显吸收。参照文
献 [ 7 － 8 ]及《中国药典(一部)》[1 ]，将检测波长定为 360 nm，在此
波长下，溶剂、内源性杂质及金钱草可能的代谢物均无干扰。
槲皮素的测定多以甲醇、乙腈和稀磷酸为基础流动相 [ 1，7 － 10 ]，
在此基础上对最佳流动相比例及磷酸浓度进行了筛选。槲皮素
为多羟基化合物，弱酸性环境可抑制其解离，有利于其快速分
离，曾试验了 3 个浓度的磷酸水溶液，最终选择 0． 4%。与甲醇和
乙腈相比，磷酸溶液的比例可对分离时间及峰形产生明显影响，
综合考虑保留时
间、灵敏度，最终
选择以甲醇 －乙
腈 － 0． 4% 磷 酸
溶液(40 ∶ 10 ∶ 50)
为流动相，保留
时间约为 8． 8 min，峰形、灵敏度和分离效果好。
植物中以苷形式存在的槲皮素进入人体胃肠道，在肠黏膜水
解后以苷元的形式吸收，进入血液后主要以结合形式存在，未能
检测到游离槲皮素 [ 11 － 12 ]。因此要测定人体内的槲皮素，需要对生
物样品进行水解，以获得游离槲皮素苷元 [ 10 ]。2010 年版《中国药
典(一部)》采用的是酸水解方式 [ 1 ]，需加热回流较长时间，不适于
取样量较小的生物样本。在本研究中，血浆样本的处理采用酶水
解后溶剂萃取方式，通过优化水解条件、提取溶剂、提取方式等可
获得较好效果，但不足之处是水解时间比较长。对 3 名服用金钱
草胶囊的志愿者血样检测结果表明，在优化的色谱条件及血样处
理条件下，色谱峰分离度好，内源性物质无干扰，专属性、准确度、
精密度、线性及最低定量检测限符合要求，可用于人体药代动力
学、生物等效性分析。
作者简介:王启平(1966 －)，男，副主任药师，研究方向为医
院药学，(电子信箱)szwangqp@ 163． com; 李东(1962 －)，男，主任
药师，研究方向为临床药学，本文通讯作者，(电子信箱)szlidong@
126． com。
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