全 文 ： ·544· Chin J Mod Appl Pharm, 2014 May, Vol.31 No.5 中国现代应用药学 2014年 5月第 31卷第 5期
响应面法优化广金钱草多糖的酶法提取工艺

程轩轩，郭楚楚，邹凤汝，杨全*(广东药学院中药学院，广州 510006)

摘要：目的 研究酶法提取广金钱草多糖的最佳工艺条件。方法 在单因素实验的基础上，根据 Box-Behnken 试验设计
原理，采用加权评分法以广金钱草提取物中多糖得率和多糖含量为综合评价指标，建立二次多项式回归方程的预测模型，
构建以综合评分为响应值的响应曲面和等高线图，考察酶解温度、酶解时间和酶用量 3 个主要因素对多糖提取效果的影
响以及因素间的交互作用。结果 回归模型拟合性良好，置信度较高。酶法提取广金钱草多糖的最佳工艺条件为：料液
比 1∶40，pH 5.5，酶解温度 49.94 ℃，酶解时间 1.53 h，酶添加量为 2.00%。主要因素对提取效果的影响程度为：酶解
时间>酶解温度>酶用量。各因素之间存在交互作用，且达到极显著水平。结论 酶法处理可提高广金钱草多糖的提取效
率。本实验优选的工艺稳定可行，可为相关生产加工企业提供有益的参考。
关键词：广金钱草多糖；酶法；响应面法；提取工艺
中图分类号：R284.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2014)05-0544-06
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.05.007

Optimization of Enzymatic Extraction Technology for Polysaccharides from Desmodium Styracifolium by
Response Surface Method

CHENG Xuanxuan, GUO Chuchu, ZOU Fengru, YANG Quan*(School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong
Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study the optimal technological conditions for extracting Desmodium styracifolium
polysaccharides. METHODS According to Box-Behnken design principle and results of single-factor experiments, the
quadratic polynomial mathematical model, response surface and contour line map were analyzed. The effects of enzymatic
hydrolysis time, temperature and enzyme amount on the polysaccharides yield were explored by using yield and content of
polysaccharides as evaluating indicators. RESULTS The degree of fitting and confidence level for mathematical model was
satisfactory. Optimum extraction technology conditions were as follows: the ratio of liquid to solid 1∶40, pH 5.5, enzymatic
hydrolysis temperature 49.94 ℃ , time of 1.53 h and cellulase amount of 2.00%. The effect order of three factors on
polysaccharides yield was as follows: enzymatic hydrolysis time>enzymatic hydrolysis temperature>enzyme amount. The
interaction effects of different factors were highly significant. CONCLUSION Optimized extraction technology is stable,
feasible, highly efficient. It could provide references for the industrial production.
KEY WORDS: Desmodium styracifolium polysaccharides; enzymatic extraction; response surface method; extraction
technology


基金项目：中山市科技计划项目(20101H020)
作者简介：程轩轩，女，博士，讲师 Tel: (020)39352327 E-mail: xuanxuanch@gmail.com *通信作者：杨全，男，博士，教授 Tel:
(020)39352173 Email: yangquan7208@vip.163.com
广金钱草以“马蹄草”始载于肖步丹所著的
《岭南采药录》 [1]，为豆科植物广金钱草
Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.的干燥地上
部分。本品味甘、淡，性凉，能利湿退黄、利尿
通淋、排石，主治黄疸尿赤、热淋、石淋、小便
涩痛、水肿尿少等[2]。作为防治尿石症的常用传统
中药，广金钱草是一种有着显著药理作用、临床
疗效及广阔开发前景的广东道地药材。据报道，
广金钱草中含有黄酮、生物碱、酚类、鞣质、多
糖等成分[3]。目前关于广金钱草多糖的研究较少，
现代药理试验证实广金钱草多糖对水负荷大鼠有
明显的利尿作用[4]。在一水草酸钙的过饱和溶液
中，多糖提取液可明显延缓一水草酸钙的成核，
提示其对尿石中最常见的一水草酸钙的结晶生长
有抑制作用[5-6]。
热水浸提是提取多糖最常见的方法，较高的
温度能够获得较高的多糖提取率，但却容易破坏
多糖的结构及生物活性[7]。某些酶可以在常温、常
压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较
大幅度提高植物中化学成分的提取率。酶法提取
能保持天然产物的构象，有利于保持有效成分原
有的药效。本试验采用响应面分析法优化酶法提
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取广金钱草多糖的工艺参数，旨在最大限度提高
多糖得率，为更好地开发广金钱草资源和多糖的
工业化生产提供理论依据。
1 材料
YJ-10 高速中药粉碎机(上海永久制药机械有
限公司)；UV-2450 紫外分光光度计(日本岛津公
司)；FA2204B电子天平(上海精科天美科学仪器有
限公司)；PHS-25型数字 pH计(上海盛磁仪器有限
公司)；PH2T-92VOA电热恒温鼓风干燥箱(上海精
宏实验设备有限公司)；DK-S26 电热恒温水浴锅
(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-500DE型数控
超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；
EYELA-N-1100D-WD 型旋转蒸发仪(日本东京理
化)。
广金钱草购自广东清平中药材市场，经广东
药学院杨全教授鉴定为豆科植物广金钱草
Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.的全草；纤维
素酶(30 000 U·g-1，上海蓝季科技发展有限公司，
批号：20130506)；果胶酶(20 000 U·g-1，上海蓝季
科技发展有限公司，批号：20130420)；无水葡萄
糖对照品(上海金穗生物科技有限公司，批号：
20130509，纯度≥98%)；无水乙醇、浓硫酸、苯
酚、盐酸、丙酮、乙醚等试剂均为分析纯(天津市
大茂化学试剂厂)；实验用水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 广金钱草预处理[8]
将广金钱草药材粉碎过 2 号筛，以无水乙醇
为溶剂，料液比 1:8，超声提取 2次，每次 40 min，
脱脂，抽滤，滤渣于 45 ℃恒温烘干，得到脱脂
药材。
2.2 多糖标准曲线的绘制
采用苯酚-硫酸法[7-8]测定多糖含量。准确称取
10 mg减压干燥至恒重的葡萄糖，加水溶解定容至
100 mL，摇匀，制成 0.1 mg·mL1的对照品溶液。
分别精确吸取 0.0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.7 mL
葡萄糖对照品溶液置于具塞试管中，分别用蒸馏
水补至 1.0 mL。依次加入 5%苯酚溶液 1.0 mL，摇
匀；缓慢加浓硫酸 5.0 mL，摇匀，室温静置 30 min。
以蒸馏水 1.0 mL同上操作加苯酚和浓硫酸显色，
作为空白对照。在 490 nm处测吸光度，以溶液浓
度 X(mg·mL1)为横坐标，吸光度 Y为纵坐标绘制标
准曲线，得回归方程 Y=48.275X+0.187 6(r=0.999 6)，
线性范围为 1.43~10.0 μg·mL1。
2.3 多糖含量的测定
分别称取样品多糖 10 mg，蒸馏水溶解，置于
50 mL量瓶中定容至刻度。精密移取 2 mL溶液于
具塞试管中，加入 5%苯酚 2.0 mL，摇匀，缓慢加
浓硫酸 10.0 mL，摇匀，室温静置 30 min。在 490 nm
处测吸光度，根据标准曲线方程计算多糖含量。
2.4 多糖的提取
准确称取脱脂药材 2 g，置于具塞锥形瓶中，
提取溶剂为蒸馏水，在适宜的料液比、纤维素酶、
pH值、温度等条件下于水浴锅中进行酶解，酶解
结束后于沸水浴中灭酶 5 min，过滤，减压浓缩。
在浓缩液中加入数倍体积的无水乙醇，使溶液中
乙醇含量达到 80%，边加边搅拌，低温静置 24 h，
离心，收集沉淀。沉淀的多糖以无水乙醇、丙酮、
乙醚依次洗涤，低温干燥至恒重，计算多糖得率
和多糖含量。二者的综合评分作为评价指标，采
用加权评分法[7]综合评估广金钱草多糖的提取工
艺条件。
多糖得率(%)=100%×粗多糖干品质量(g)/原料
质量(g)；多糖含量(%)=100%×C×D/M。式中 C
为根据标准曲线计算出待测液的多糖浓度
(μg·mL1)；D为稀释倍数；M 为干燥后所得粗多糖
的质量(mg)。
加权评分法：把各项与该列最大值相除再乘
以 100为该项得分，根据多糖得率 X和多糖含量 Y
的作用，确定两者的权重系数，对两项指标进行
加权求和，通过公式 Z=0.5X+0.5Y可得综合评分 Z。
2.5 单因素试验
2.5.1 酶种类对多糖提取率的影响 精密称取脱
脂药材 6份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，其中
5 份样品中分别加入 0.5%的纤维素酶、果胶酶、
复合酶 1(纤维素酶∶果胶酶=3∶2)、复合酶 2(纤
维素酶∶果胶酶=1∶1)和复合酶 3(纤维素酶∶果
胶酶=2∶3)。按料液比 1∶20加入蒸馏水，盐酸调
pH至 4.5，在 45 ℃水浴酶解 2 h，沸水灭酶 5 min，
过滤，减压浓缩。按“2.4”项下方法提取多糖，
按“2.3”项下方法测定多糖含量。计算多糖得率
和多糖含量，并对 2项指标加权求和。结果见图 1，
结果表明，在同等工艺条件下加入酶可以提高多
糖的得率，比较不同酶的作用效果，最终选用纤
维素酶作为本次试验用酶。
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图 1 不同酶对综合评分的影响
Fig 1 Effect of different enzymes on colligation scores
2.5.2 料液比对多糖提取率的影响 精密称取广
金钱草粉末 5份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，
分别按 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 的
料液比加入蒸馏水，在纤维素酶用量 0.5%、pH 4.5、
45 ℃水浴条件下酶解 2 h，其余操作按“2.5.1”项
下方法。结果见图 2，结果表明，料液比由 1∶10
增至 1∶40 过程中，多糖提取率显著增大。此后
继续增大料液比，样品中酶浓度和底物浓度都逐
渐减少，有效碰撞降低，因此多糖得率呈下降趋
势。故选择适宜料液比为 1∶40。

图 2 料液比对综合评分的影响
Fig 2 Effect of different liquid/solid ratio on colligation
scores
2.5.3 酶解温度对多糖提取率的影响 精密称取
广金钱草粉末 5份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，
料液比为 1∶40，纤维素酶用量 0.5%，pH值为 4.5，
分别在 40，45，50，55，60 ℃下酶解 2 h，其余
操作按“2.5.1”项下方法。因为酶是一类具有最
适反应温度范围的物质[9]，过低温度会抑制其催化
能力，过高温度会致其失活。根据单因素考察结
果，确定 50 ℃为最佳酶解温度，见图 3。

图 3 酶解温度对综合评分的影响
Fig 3 Effect of different enzyme hydrolysis temperatures on
colligation scores
2.5.4 酶解时间对多糖提取率的影响 精密称取
广金钱草粉末 5份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，
料液比为 1∶40，在纤维素酶用量 0.5%、pH 4.5、
50 ℃水浴条件下分别酶解 1，1.5，2，2.5，3 h，
其余操作按“2.5.1”项下方法。结果见图 4，结果
表明，1.5 h为适宜的酶解时间。

图 4 酶解时间对综合评分的影响
Fig 4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on
colligation scores
2.5.5 酶用量对多糖提取率的影响 精密称取广
金钱草粉末 5份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，
料液比为 1∶40，分别按 0.5%，1%，1.5%，2%，
2.5%加入纤维素酶，在 pH 4.5、50 ℃水浴条件下
酶解 1.5 h，其余操作按“2.5.1”项下方法。结果
见图 5，结果表明，随着纤维素酶浓度的增加，多
糖提取率逐渐增大。当酶量超过 2%时，继续增加
酶浓度，对多糖得率无显著影响。说明在该底物
浓度下，单位底物上的酶浓度已经趋于饱和，多
糖已充分溶出。因此确定适宜加酶量为 2%。

图 5 酶用量对综合评分的影响
Fig 5 Effect of different enzyme amounts on colligation
scores
2.5.6 pH值对多糖提取率的影响 精密称取广金
钱草粉末 5份，每份 2 g，置于具塞锥形瓶中，料
液比为 1∶40，纤维素酶用量为 2%，分别用盐酸
调 pH值至 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，于 50 ℃水浴
中酶解 1.5 h，其余操作按“2.5.1”项下方法。结
果见图 6，结果表明，适宜 pH为 5.5。
2.6 响应面分析法优化提取工艺
根据 Design Expert 8.0.5 软件中的 Box-
Behnken 试验设计原理[5-6,8]，综合单因素考察结
果，选取酶解温度、酶解时间、加酶量 3 个主要
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因素，采用 3 因素 3 水平的响应面分析方法，因
素水平设计见表 1，响应面分析方案及结果见表 2。


图 6 pH值对综合评分的影响
Fig 6 Effect of different pH values on colligation scores
表 1 响应面分析因素与水平
Tab 1 Factors and levels of response surface method
水平 A.酶解温度/℃ B.酶解时间/h C.酶用量/h
1 45 1.0 1.5
0 50 1.5 2.0
1 55 2.0 2.5
表 2 响应面分析方案及结果
Tab 2 Design scheme and results of response surface
analysis
因素 评价指标
序号
A B C 多糖得率/% 多糖含量/%
综合
评分
1 50 1.5 2.0 2.51 31.09 98.07
2 45 1.0 2.0 1.90 21.57 71.11
3 55 2.0 2.0 2.00 21.92 73.61
4 55 1.5 2.5 2.25 26.60 85.89
5 50 2.0 1.5 2.29 24.19 82.84
6 50 1.0 2.5 2.11 24.91 80.49
7 45 2.0 2.0 2.40 25.67 87.32
8 50 1.5 2.0 2.49 31.27 97.97
9 50 1.0 1.5 2.13 23.34 78.39
10 50 1.5 2.0 2.50 31.27 98.16
11 50 1.5 2.0 2.58 30.19 97.90
12 55 1.5 1.5 2.18 26.13 83.79
13 50 2.0 2.5 2.24 23.77 81.20
14 55 1.0 2.0 2.29 25.99 85.70
15 45 1.5 1.5 2.35 25.09 85.43
16 45 1.5 2.5 2.31 24.22 83.27
17 50 1.5 2.0 2.48 31.45 98.06
采用响应面法分析试验结果，得到以多糖提
取效果的综合评分 Z 为响应值的回归方程：
Z=97.999+0.230A+1.156B+0.049C7.079AB+1.065
AC0.939BC7.352A211.214B26.052C2。式中 A、
B、C 分别为酶解温度(℃)、酶解时间(h)和酶用量
(%)。结果见表 3。由表 3 可知，二次方程模型的
“Prob>F”值< 0.0001，表明该模型极显著，此试
验方法可靠。失拟相 P=0.0615>0.05(不显著)，表
明模型不存在失拟因素，试验结果与数学模型拟
合良好，可用该二次多项式方程模拟试验真实点。
回归模型的校对决定系数 R2=0.999 6，R2Adj=0.997 7，
变异系数 CV=0.20，说明模型的置信度较高[10]，
进一步证实模型的拟合性良好，可用于提取工艺
的分析和预测。由“Prob>F”值可知，A、B、AB、
AC、BC、A2、B2、C2均为二次回归模型的极显著
性因素(P<0.01)。各因素对广金钱草多糖提取效果
的影响次序为：酶解时间>酶解温度>酶用量。根
据回归方程所得的各因素对综合评分影响的响应
曲面和等高线图结果见图 7~9。因素间的交互效应
可由曲面的陡度和等高线的形状及密度进行判
断。等高线近椭圆形且比较密集，三维响应曲面
陡峭，表明各因素间交互作用明显[11]。图 7~9 分
别将酶用量、酶解时间、酶解温度固定在 0水平，
可以直观分析出各因素及任意两因素间的交互作
用对综合评分影响效应的大小。例如，图 7 表示
的是当酶用量为 2%时，酶解温度和酶解时间对综
合评分影响的响应面和等高线图，由图可知在酶
解时间较短时，随着温度的升高，综合评分值先
呈显著增加趋势，而后增加趋势减缓，温度再继
续升高则综合评分呈逐渐下降趋势；说明在-1~0
水平区段之间，酶解温度和酶解时间之间的交互
作用对综合评分值的影响极显著。同理，图 8~9
可以看出，在远离 0 水平的区段，综合评分值呈
明显的递增或递减趋势，故 2 因素的交互作用极
显著。此结论亦与方差分析结果(P<0.01，见表 3)
吻合。
2.7 提取工艺的验证
由响应面分析得到广金钱草多糖的最佳提取
条件为：料液比 1∶40，pH 值为 5.5，酶解温度
49.94 ℃，酶解时间 1.53 h，酶用量 2.00%，综合
评分的理论预测值为 98.03。为了验证模型方程的
适应性，同时考虑到操作的方便性，将上述条件
调整为酶解温度 50 ℃，酶解时间 1.5 h，酶用量
2.00%，进行 5次平行试验得到的综合评分均值为
95.59，符合度为 97%。

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表 3 回归模型方差分析
Tab 3 Anova for response surface quadratic model
数据来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F P
模型 1 227.885 9 136.431 6 4 502.471 <0.00 01 <0.01
A温度 0.423 798 1 0.423 798 13.986 05 0.007 3 <0.01
B时间 10.683 06 1 10.683 06 352.558 7 <0.00 01 <0.01
C酶量 0.019 286 1 0.019 286 0.636 486 0.451 2
AB 200.433 4 1 200.433 4 6 614.635 <0.000 1 <0.01
AC 4.534 344 1 4.534 344 149.640 9 <0.000 1 <0.01
BC 3.523 129 1 3.523 129 116.269 1 <0.000 1 <0.01
A2 227.604 8 1 227.604 8 7 511.335 <0.000 1 <0.01
B2 529.441 3 1 529.441 3 1 7472.44 <0.000 1 <0.01
C2 154.192 9 1 154.192 9 5 088.620 <0.000 1 <0.01
残差 0.212 111 7 0.030 302
失拟相 0.172 391 3 0.057 464 5.787 003 0.061 5 不显著
纯误差 0.039 719 4 0.009 930
总和 1 228.097 16

图 7 酶解温度和酶解时间对综合评分的等高线和响应面图
Fig 7 Contour line and response curved surface of temperatures and time to colligation scores

图 8 酶解温度和酶用量对综合评分的等高线和响应面图
Fig 8 Contour line and response curved surface of temperatures and enzyme amounts to colligation scores

图 9 酶解时间和酶用量对综合评分的等高线和响应面图
Fig 9 Contour line and response curved surface of time and enzyme amounts to colligation scores
中国现代应用药学 2014年 5月第 31卷第 5期 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 May, Vol.31 No.5 ·549·
3 讨论
传统的多糖提取多采用煎煮的方法，较高的
温度虽可保证提取充分，但反应条件剧烈容易造
成多糖结构的破坏。为了进一步说明酶法提取的
优势，本试验还分别比较了无酶组(除无酶添加外，
同最佳提取工艺)、加酶组(最佳提取工艺)和热水
组(沸水浴提取 1 h)药材中多糖的提取效果，各组
样品中粗多糖的得率分别为：1.71%，2.70%和
3.04%。因此，酶法提取多糖的效率与传统煎煮法
相当，且操作安全、反应条件温和，利于活性成
分的保存。本试验通过响应面法探索出广金钱草
多糖的最佳提取工艺，可为工业生产提供参考，
同时促进广金钱草的资源利用。
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收稿日期：2013-09-28



益智仁水提物的化学成分研究( )Ⅰ

常青鲜，王宗权，贾继明(石家庄以岭药业股份有限公司，石家庄 050035)

摘要：目的 研究益智仁(Alpinia oxyphylla Miq.)水提物中的化学成分。方法 采用溶剂法、Sephadex LH-20柱色谱法等
对益智仁的化学成分进行分离纯化，运用波谱技术鉴定其结构。结果 从益智仁水提物中分离得到了 5 个化合物，分别
鉴定为原儿茶醛(1)、原儿茶酸(2)、对香豆酸(3)、()-表儿茶素(4)、(+)-儿茶素(5)。结论 化合物 1，3和 4为首次从该属
植物中分离得到，化合物 5为首次从该植物中分离得到。
关键词：益智仁；水提物；化学成分；分离鉴定
中图分类号：R284.1 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2014)05-0549-03
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.05.008

Chemical Constituents from the Water Extract of Alpinia Oxyphylla Miq. ( )Ⅰ

CHANG Qingxian, WANG Zongquan, JIA Jiming(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, Shijiazhuang 050035,
China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study the chemical constituents from the water extract of Alpinia oxyphylla Miq.. METHODS
The chemical constituents were isolated by solvent and Sephadex LH-20 methods. The structures were identified on the basis of

作者简介：常青鲜，女，助理工程师 Tel: 15232123326 E-mail: qingzhechang@sina.com