全 文 ： 收稿日期：2009-01-19
基金项目：国家大学生创新性实验计划项目（081057411）和华南师范大学 2008 年度大学生创新性实验项目资助
作者简介：陈冬茵（1987-），女，广东东莞人，本科生。
注：李玲为通讯作者。
多酚氧化酶抑制剂对蝴蝶兰叶外植体褐变的影响
陈冬茵 1，赖艳艳 1，许传俊 1,2，李 玲 1
(1.华南师范大学 生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东 广州 510631；2.福建省亚热带植物研究
所，福建 厦门 361006)
摘 要：将多酚氧化酶（PPO）抑制剂添加到酶反应液中，抗坏血酸和半胱氨酸在 0.5 mmol/L 就完全抑制蝴
蝶兰 PPO 活性。300 mg/L 柠檬酸和 100～200 mg/L 亚硫酸氢钠分别添加到培养基中，可使蝴蝶兰外植体褐变
程度降低；采用抑制剂浸泡处理外植体，对外植体褐变抑制效果最好的为 50 mg/L 抗坏血酸，外植体在褐变
发生前 PPO 活性低于对照。
关键词：蝴蝶兰；外植体；褐变；多酚氧化酶；抑制剂
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2009.02.004
中图分类号：S682.31; Q943.1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2009)02-0015-04
Influences of PPO Inhibitors on Browning in Phalaenopsis Explants
CHEN Dong-yin1, LAI Yan-yan1, XU Chuan-jun1,2, LI Ling1
(1.Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University,
Guangzhou 510631, Guangdong China; 2.Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen 361006, Fujian China)
Abstract：The effects of Polyphenol oxidase (PPO) activity inhibitors supplemented to reaction
buffer at different concentrations showed that ascorbate acid and Cys complete inhibited PPO
activity at 0.5 mmol/L. Adding PPO activity inhibitors to media at different concentrations, the
results showed that 300 mg/L citric acid and 100-200mg/L NaHSO3 could reduce the browning of
Phalaenopsis explants. Soaking explants with PPO activity inhibitors, it showed that 50 mg/L
ascorbate acid gave the best result for browning inhibition and PPO activity was lower than that of
control before explants browning happened.
Key words：Phalaenopsis; explants; browning; polyphenol oxidase; inhibitor
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）与组织褐变相关，抑制 PPO 活性或基因表达能降低果蔬
褐变的发生[1-3]。PPO 是一种含铜的蛋白质，其活性依赖于铜的氧化还原作用。PPO 的抑制剂有两种类
型，分别是与金属离子结合的抑制剂（如叠氮化合物、氰化物、CO、氯化物和托芬酮）和芳香族有机
酸（如苯甲酸衍生物和桂皮酸衍生物）[4]。
前期研究发现，在蝴蝶兰叶外植体褐变过程中 PPO 出现新的酶带[5]。本文通过在培养基中添加 PPO
活性抑制剂及浸泡处理，观察其对蝴蝶兰叶外植体褐变的影响，以期寻找 PPO 与外植体褐变的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
供试蝴蝶兰为杂交品种‘满天红’（Dtps. Queen Bee‘RedSky’）。无菌苗购自广东省花卉研究所。
2009,38(2):15-18.
Subtropical Plant Science
第 38 卷 ﹒16﹒
1.2 方法
1.2.1 PPO 活性测定
取 0.3 g 外植体用 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH 8.0）3ml，0.1 ml 0.1% Triton X-100，冰浴研磨， 4 ℃
11 000 r/min 离心 20 min，取上清液测定酶活。酶反应液为：2 ml 磷酸缓冲液，0.1 mol/L 儿茶酚 0.5 ml，
酶液 0.5 ml，525 nm 波长下测定 OD 值。以每 min 每 g 蛋白引起吸收值（OD）改变 0.001 为一个活力
单位。按考马斯亮蓝法测定蛋白含量。
1.2.2 抑制剂处理
a. 将不同浓度的抗坏血酸、NaHSO3、柠檬酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸、半胱氨酸、氯化钠、SDS
分别添加到 PPO 活性测定液中，测定对 PPO 酶活性的影响。
b. 将不同浓度的抗坏血酸、硫代硫酸钠、NaHSO3、柠檬酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸分别添加到
MS 培养基中，于(24±1 )℃、16/8 h 光周期培养（下同），观察上述抑制剂对蝴蝶兰外植体褐变的影响。
c. 蝴蝶兰叶外植体用不同浓度的抗坏血酸、硫代硫酸钠、肉桂酸浸泡 10 min，再用无菌水漂洗后
接种到 MS 培养基中，观察褐变发生情况。
褐变率 = 褐变外植体总数/接种外植体总数×100%
结果统计采用 SPSS 的 Univarlate 方法分析。
2 结果与分析
2.1 不同抑制剂对蝴蝶兰 PPO 活性的影响
表1表明，将PPO活性抑制剂加入酶活性测定液中，0.5 mmol/L抗坏血酸和半胱氨酸及1～2 mmol/L
NaHSO3，能完全抑制 PPO 活性；柠檬酸的抑制性随浓度升高而增强；与对照相比，肉桂酸、对羟基
苯甲酸、NaCl 都具有抑制 PPO 活性的作用；SDS 对 PPO 活性有一定的激活作用。
表 1 不同抑制物对 PPO 活性的影响
抑制剂 浓度(mmol/L) PPO 活性(100%) 抑制剂 浓度(mmol/L) PPO 活性(100%)
2 0g 2 0.65e
1 0g 1 0.75d 半胱氨酸
0.5 0g
肉桂酸
0.5 0.77d
2 0.31f 2 0.57e
1 0.46e 1 0.65d 柠檬酸
0.5 0.51e
氯化钠
0.5 0.69d
2 0g 2 0g
1 0g 1 0g 抗坏血酸
0.5 0g
亚硫酸氢钠
0.5 0.51e
2 0.53e 10% 1.19b
1 0.79d 15% 1.20b 对羟基 苯甲酸
0.5 0.75d
SDS
20% 1.36a
CK 0 1c
注：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
2.2 PPO 抑制剂对蝴蝶兰叶外植体褐变的影响
将不同浓度的 PPO 活性抑制剂添加到培养基中，对蝴蝶兰叶外植体褐变产生了一定影响（表 2）。
添加 300 mg/L 柠檬酸和 100～200 mg/L 硫代硫酸钠，蝴蝶兰外植体的褐变程度低于对照；而对羟基苯
甲酸处理却加重了外植体褐变；肉桂酸和抗坏血酸则导致外植体黄化。
第 2 期 陈冬茵,等：多酚氧化酶抑制剂对蝴蝶兰叶外植体褐变的影响 ﹒17﹒
PPO 活性抑制剂浸泡处理外植体结果（表 3）表明，50 mg/L 抗坏血酸浸泡外植体 10 min，培养 6
d 外植体褐变率低于对照，为 73.08%，50 mg/L 抗坏血酸在一定程度上可抑制外植体的褐变；高浓度硫
代硫酸钠处理的叶外植体褐变率也低于对照；肉桂酸处理的外植体褐变与对照无明显差异。50mg/L 抗
坏血酸和 100mg/L 硫代硫酸钠对外植体的褐变有抑制效果，
表 3 PPO 抑制剂浸泡处理对蝴蝶兰叶外植体褐变的影响
抑制剂 抗坏血酸 肉桂酸 硫代硫酸钠 CK
浓度(mg/L) 50 100 150 50 100 150 50 100 150 0
褐变率(%) 73.08 83.87 96.97 100.00 88.46 100.00 100.00 85.71 88.46 100
2.3 PPO 抑制剂浸泡处理对蝴蝶
兰叶外植体 PPO 活性的影响
蝴蝶兰叶外植体经 50 mg/L
抗坏血酸浸泡处理 10 min 后，培
养 2 d 和 4 d 的外植体 PPO 活性
低于对照（分别为对照的 91%和
74%），而 100 mg/L 硫代硫酸钠
处理与对照的 PPO 差别不显著；
抗坏血酸和硫代硫酸钠处理的
外植体培养 6 d，PPO 活性均显
著高于对照（图 1）。
3 讨 论
植物组织培养过程中外植
体褐变是导致组培失败的重要
因素之一，一直以来多采用 PPO 活性抑制剂或螯合剂处理来解决。梅兴国等[6]发现，在培养基中添加
100 mg/L 柠檬酸可显著抑制红豆杉细胞褐变，且生长速率也高，Vit C 和半胱氨酸有一定的抗褐效果，
但比二硫苏糖醇和柠檬酸差，Na2S2O3 的抗褐效果最差。本研究将不同物质添加到蝴蝶兰 PPO 测定反
应液中，发现抗坏血酸和半胱氨酸对蝴蝶兰 PPO 抑制效果最佳，低浓度就可完全抑制酶的活性。Cabanes
等[7]发现，SDS 可以激活梨 PPO 活性，本研究中也发现 SDS 能激活蝴蝶兰 PPO 活性，其原因可能是
酶蛋白与 SDS 结合使构型发生变化导致活性增加；亦有报道指出，PPO 在植物体内以潜伏态存在，其
活性可以被 SDS 或蛋白酶激活[8-10]。
PPO 抑制剂添加到蝴蝶兰外植体的培养基中，抗坏血酸等没有表现出抑制效应，将这些抑制剂浸
表 2 培养基添加 PPO 抑制剂对蝴蝶兰叶外植体的影响
抑制剂 抗坏血酸 柠檬酸 对羟基苯甲酸 NaHSO3 肉桂酸 硫代硫酸钠 CK
浓度
(mg/L) 100 150 200 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 0
褐变
程度 黄化 黄化 黄化 +++ +++ ++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ 黄化 ++++ 黄化 黄化 ++ ++ +++ +++
注：“+”多少表示褐变程度的强弱。
f
cd
a
e
e
b
cd
de
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
2d 4d 6d
培养时间
PP
O
酶
活
性
(U
/m
g·
m
in
)
CK 抗坏血酸 硫代硫酸钠
图 1 抗坏血酸和硫代硫酸钠对蝴蝶兰外植体 PPO 活性的影响
注：不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
第 38 卷 ﹒18﹒
泡处理外植体，发现抗坏血酸对外植体有很好的抗褐变效果，业已证实，抗坏血酸抑制 PPO 活性通过
两种方式来实现：在无底物存在的情况下，与 PPO 活性位点结合，抑制 PPO 活性；在有底物存在的情
况下，还原被 PPO 氧化的产物[11]，抗坏血酸添加到培养基中没有抑制外植体的褐变，可能与抗坏血酸
易氧化不能稳定地发挥效果有关。
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(上接第 9 页)
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