全 文 ：2 ,4-D和 6-BA对早熟禾愈伤组织
诱导的影响
丁路明 , 龙瑞军 , 朱铁霞
(甘肃农业大学 草业学院 , 甘肃 兰州　730070)
　　摘要:早熟禾愈伤组织的诱导是建立早熟禾高频再生体系的前提和基础 。本试验以早熟禾成熟种
子作为外植体 ,MS为基本培养基 ,在不同的 2 ,4-D和 6-BA浓度下诱导愈伤组织。结果表明早熟禾不同
品种间 ,愈伤组织诱导率显著不同。在 2 ,4-D和 6-BA 配合使用的情况下 ,愈伤组织的质量和诱导率要
优于单独使用 2 , 4-D的情况。
关键词:早熟禾;组织培养;愈伤组织;再生体系;2 ,4-D;6-BA
中图分类号:S 312　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5500(2003)01-0034-04
　　早熟禾属(Poa)植物是一种多年生禾本科牧草和
草坪草 ,是我国重要的传统牧草 ,具有兼性无融合生殖
特性 。喜冷湿气候环境 ,生于草甸和沼泽化草甸中 ,局
部能形成单优势种群落。
早熟禾在我国栽培历史悠久 ,种植面积广泛 ,主要
分布在我国西北和华北地区。早熟禾是品质优良的重
要饲料作物 ,同时在改良土壤 、水土保持 、改善生态环
境中起着重要的作用。适口性非常好 ,各种家畜均喜
食 ,被视为家畜的抓膘牧草 ,耐牧性强 ,也可用于调制
干草[ 1] 。早熟禾还是品质优良的草坪草 ,在城市绿化 、
水土保持中有着重要的作用 。早熟禾具有生长缓慢 、
不需频繁修剪 、耐践踏 、坪用性好等优点 ,是建植运动
场和绿地草坪的优质草坪草种 。同时也存在一些突出
的缺点 ,如生长缓慢 、叶量少 、易感病 、不抗虫 、耐高低
温性能差 ,季节变换时易变黄等 ,另外 ,草地早熟禾的
抗旱力不强 ,遇旱变成褐色[ 2 〗,这些性状在一定程度
上都可以通过基因转化的手段得到改良 。成功的基因
转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立[ 3] 。这种
用于转基因的植物受体系统必须具有高频 、稳定的再
生能力 ,能接受外源基因的整合 ,并且外源基因能够实
现转录和翻译 ,完成正常的表达。因此 ,建立一个成功
的受体系统是实现基因转化的先决条件 , 关系到
收稿日期:2002-09-09;修回日期:2002-10-15
作者简介:丁路明(1977 ～ ), 男 , 山东省日照市人 , 在读硕
士研究生。
基因转化的成败 。建立高频再生体系最基础 ,其中最
关键的一步是诱导愈伤组织 。高质量的愈伤组织是进
一步诱导分化和生根的前提和基础 。本试验旨在应用
不同植物激素配比诱导早熟禾愈伤组织 ,并进一步使
其分化生根发芽 ,建立用于早熟禾基因转化的高频再
生体系。
1　材料和方法
1.1　试验材料
1.1.1 　植物材料　本试验采用草坪草草地早熟禾
(Poa pratensis L)和硬质早熟禾(Poa sphendylodes L)
的成熟种子作为外植体 。基本培养基为 MS培养基+
7 g/L 琼脂粉+30 g/L 蔗糖[ 2] 。
1.1.2　植物激素　(1)2 , 4-D(2 , 4-二氯苯氧乙酸)用
少量 1 mol/L 的氢氧化钾溶解后 , 加蒸馏水配成
1 mg/mL 的母液 ,于 4 ℃下保存[ 3] 。(2)6-BA(6-苄基
氨基嘌呤)用少量 1 mol/L 的盐酸溶解后 ,加蒸馏水配
成 1 mg/mL的母液 ,于 4 ℃下保存[ 3] 。
1.2　试验方法
取适量早熟禾种子 ,在自来水下冲洗几分钟 ,然后
置于 50%(V/V)的硫酸中搅拌 30 min。在自来水下
洗净 。在超净工作台上 ,以 70%(V/V)的酒精消毒 30
～ 40 s ,无菌水冲洗 3 ～ 5次 ,再用 0.1%升汞(氯化汞)
溶液消毒 3 ～ 4 min ,无菌水冲洗 8 ～ 10次 ,将消毒后的
种子接种在愈伤组织诱导培养基上 ,于 25 ℃黑暗培
养。4周后选取诱导的愈伤组织在相同培养基(激素
34 Grassland and Turf　　(Quarterly)　　2003　　No.5　　(Sum　No.100)
DOI :10.13817/j.cnki.cyycp.2003.01.010
浓度不变)上继代第一次 , 3 周后在相同培养基(激素
浓度不变)上继代第二次 。
2　结果与分析
2.1　不同 2 ,4-D浓度对早熟禾愈伤组织诱导的影响
以MS 为基本培养基 ,加入不同浓度的 2 ,4-D。接
种 25 ℃暗培养 20 d后 ,有乳白色 、表面湿润的愈伤组
织出现 ,体积较小(2 ～ 4 mm)。30 d 后转至相同成分
的新鲜培养基上继代培养 , 20 d后愈伤组织体积增大
至4 ～ 6 mm ,表面逐渐干燥 ,部分有颗粒状突起 ,颜色
转为浅黄色(见图 1)。但大部分仍为乳白色 、浆糊状 ,
无颗粒结构 。继代 2次后 ,其诱导率(愈伤块数/外植
体数)见图 2 。
图 1　继代 2 次的愈伤作组织(Ken)
　　从图 1可以看出菲尔金和肯塔基两种草地早熟禾
只有在 2 ,4-D的情况下 ,愈伤组织诱导率都不是太高
(16.3%～ 41.3%),肯塔基草地早熟禾的诱导率高于
菲尔金草地早熟禾。肯塔基草地早熟禾呈淡黄色 、结
构紧密 、颗粒状愈伤块的数量多于菲尔金草地早熟禾
的 ,说明肯塔基草地早熟禾愈伤块的质量较好 。
2 ,4-D浓度为 2.0 mg/L 时 , 肯塔基草地早熟禾
(41.3%);2 ,4-D 浓度为 1.0 mg/ L 时 ,菲尔金草地早
熟禾的愈伤组织诱导率最高(29.1%)。
图 2　不同 2 , 4-D浓度对愈伤组织诱导的影响
2.2　不同 2 ,4-D和 6-BA浓度配比对早熟禾愈伤组织
诱导的影响
以 MS 为基本培养基 ,然后加入不同浓度配比的
2 ,4-D和 6-BA。诱导方法与前相同 ,其愈伤组织诱导
率见图 3。
图 3　不同 2 , 4-D和 6-BA浓度配比对愈伤组织诱导的影响
　　从图 3 看出硬质早熟禾的愈伤组织诱导率最高
(78.5%)。2 , 4-D和 6-BA最佳浓度配比为:3 mg/L +
0.1 mg/L 和 3 mg/L +0.2 mg/L。和单独的使用
2 ,4-D相比 ,2 , 4-D和 6-BA配合使用 ,愈伤组织诱导率
更高 ,质量更好(愈伤块大 ,呈淡黄色)。
2.3　愈伤组织的分化
将所得愈伤组织(肯塔基草地早熟禾)分成两组 ,
一组为乳白色粘稠状;一组为淡黄色颗粒状 ,分别转移
至含有低浓度 2 , 4-D的分化培养基上诱导分化(白天
26 ℃,夜晚 18 ℃, 16 h光照 ,8 h黑暗),继代两次后(6
周),统计结果 ,发现乳白色粘稠状愈伤组织不能分化;
淡黄色颗粒状愈伤组织的分化结果见表 1。
表 1　不同 2 , 4-D 浓度对愈伤组织诱导分化的影响
2 , 4-D浓度 接种愈伤块数 出芽数 平均出芽数
0.05 43 215 5
0.1 50 400 8
0.3 45 180 4
0.5 37 111 3
3　讨论
早熟禾作为一种主要的冷地型草种 ,在我国北方
具有重要的生产实际意义。对其进行品种改良已迫在
眉睫 。采用基因工程手段进行品种改良工作 ,在许多
作物和一些牧草(如苜蓿 、三叶草 、高羊茅和黑麦草等)
上[ 4] ,国内外已有报道 。早熟禾在这方面的报道不多 。
本试验的目的在于建立早熟禾的高频再生体系 ,为其
35草原与草坪　　季刊　　2003年　　第 1期　　总第 100期
基因转化建立基础。
禾本科牧草的组织培养技术是生物技术的主要组
成部分和基础。只有建立成熟的早熟禾高频再生体
系 ,才能进行早熟禾基因转化的研究 。禾本科牧草的
愈伤组织诱导要明显此豆科牧草难 ,不同基因型之间
的差别也比较大。在本试验中 ,单独使用 2 ,4-D的情
况下 ,愈伤组织诱导率比较低(16.3%～ 41.3%),这与
复旦大学生物化学系马忠华等人的试验结果出入较
大[ 2] 。马忠华等人的试验中 ,随 2 ,4-D浓度的增加 ,早
熟禾的愈伤组织诱导率不断升高 ,当 2 ,4-D浓度达到
7 mg/ L时 ,愈伤组织诱导率达到 91.1%。原因尚不
清楚 ,可能是不同早熟禾品种基因型间差异比较大的
原因 。
在配合使用 2 ,4-D和 6-BA 的情况下 ,愈伤组织诱
导率要高于单独使用 2 , 4-D 情况 ,而且 ,出现淡黄色 、
颗粒状愈伤组织的比率也高。这与 P.van der Valk等
人的试验结果基本一致[ 7] 。但对于其他禾本科植物 ,
添加 6-BA反而会限制愈伤组织的形成[ 8] 。
有试验证明用早熟禾的幼嫩花序作为外植体诱导
愈伤组织诱导率比较高[ 9 , 10] 。朱根发等人用早熟禾的
幼穗诱导愈伤组织 ,诱导率达到 100%,并且从幼穗愈
伤组织中获得了较高频率的分化(58.33%)[ 9] 。Van
der Valk P.等人分别用幼穗和种子作为外植体建立
早熟禾的再生体系 ,从幼穗获得的愈伤组织诱导率要
高于从种子获得的[ 10] 。虽然从幼穗容易获得高频率
的愈伤组织诱导率 ,但受季节限制比较大;成熟种子同
幼穗相比 ,虽然其愈伤组织的诱导率较低 ,但易于获
取 ,且不受季节 、植株发育时期等因素限制 ,具备取材
方便 、操作简单等优点 ,目前更多的试验是用种子作为
外植体 ,寻找合适的培养基和激素配比 ,以期获得更高
的愈伤组织诱导率 ,并进一步诱导分化生根 ,建立早熟
禾的高频再生体系。
Kirsten等人通过早熟禾的胚性细胞悬浮系建立
再生体系 ,获得了再生植株[ 11] 。试验通过种子获得的
愈伤组织建立胚性悬浮细胞系 ,得到了再生植株 。据
Kirsten等人报道 ,选择质量高的愈伤组织是获得再生
苗的关键 。
作为建立再生体系的前提和基础 ,愈伤组织的诱
导是非常关键的 。由于巴润和菲尔金草地早熟禾愈伤
组织的诱导率比较低 ,而且多为乳白色 、粘稠状 、很难
诱导分化 ,需要进一步研究培养基的成分和激素配比 ,
或通过其他手段(如对外植体进行预处理等)来提高愈
伤组织的诱导率。
从单个细胞有效地再生出正常可育的植株是植物
分子遗传改良的一个基本问题 ,但是这一点对禾本科
牧草来说是相当困难的 ,因为他们在离体操作中惰性
非常强[ 4] 。单子叶禾本科牧草高频再生体系的建立是
比较困难的 ,需要进一步探讨禾本科牧草组织培养的
最佳条件 、影响因素和体细胞的胚胎发生 。禾本科牧
草组织培养很难成功 ,其原因可能正是由于对禾本科
牧草外植体在离体培养过程中 ,所用培养基的大量元
素 、微量元素的多少及其比例关系了解甚少 ,因此禾本
科牧草的培养基大多不能使其外植体得到很好的表
达。另外 ,培养基中的大量元素 、微量元素对外植体的
生长 、分化不仅仅是起到供给无机营养的作用 ,更大的
作用可能是调节作用[ 5] 。早熟禾的组织培养比较困
难 ,另外一个原因很可能是由于早熟禾的高度无融合
生殖现象 ,这需要进行试验验证 ,寻找解决这一问题的
最佳途径 。
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The Effect of 2 ,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2 ,4-D)and
6-Benzyladenine(6-BA)on Callus Inductionof Bluegrasses
DING Lu-ming , LONG Rui-jun , ZHU Tie-xia
(Pratacultural Collage , Gansu Agriculture Universi ty , Lanzhou , Gansu　730070)
　　Abstract:The callus induction of Bluegrasses is the prerequisite and foundation to establish high frequency regen-
erat ion system.Callus cultures w ere obtained from mature seeds of Kentucky bluegrasses(Poa pratensis L.)and Poa
sphendylodes.Mature seeds were cultured on Murashige and Skoog medium(MS)supplemented wi th dif ferent 2 ,4-
dichlorophenoxyacetic acid(2 ,4-D)and 6-Benzy ladenine concentrations.The rate of callus induction is strongly differ-
ent w ith the cultivar.The effect of 2 ,4-dichlo rophenoxyacetic acid(2 ,4-D)combining with 6-benzy ladenine(6-BA)
is better than only using 2 , 4-dichlorophenoxyacetic acid.
Key words:blueg rass;tissue culture;callus culture;regeneration;2 ,4-dichlorophenoxyacetic acid;6-benzylade-
nine
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Botanical Morpha and Ecological Adaptation of Rhododendron
in Eastern Qilian Mountains
ZHANG De-gang , CAO Wen-xia , PU Xiao-peng , HU Zi-zhi
(Pratacul tural Col lege , Gansu Agricultural Universi ty , Lanzhou 730070)
　　Abstract:The botanical mo rpha and ecological adaptat ion of Rhododendron in Eastern Qilian Mountains were
studied.The results indicate that R .capitatum and R .thymi folium show lower height with leathery leaves coated
by dense spuama and lihgt aroma;R .anthopogonoides shows higher height with sof t leathery leaves coated by sparse
squama and st rong aroma;R .przewalski i show s highest height with hard leathery leaves without squama and aro-
ma.The leaf of four Rhododendron shrubs shows reverse tw ist shape for adapting alpine climate.
Key words:Eastern Qilian Mountains;Rhododendron ;shrubland;botanical morpha;ecological adaptation
37草原与草坪　　季刊　　2003年　　第 1期　　总第 100期