全 文 ：收稿日期:2011-08-23; 修订日期:2012-12-20
基金项目:国家自然科学基金(No． 31070164) ;
大连市青年科技人才基金项目(No． 2006J23JH031)
作者简介:熊海浪(1984-) ，男(汉族) ，江西丰城人，现为大连工业大学生
物工程学院在读硕士研究生，学士学位，主要从事发酵工程研究工作．
* 通讯作者简介:张宗申(1968-) ，男(汉族) ，河南郸城人，现任大连工业
大学生物工程学院教授，博士学位，主要从事发酵工程研究工作．
影响濒危药用植物滇重楼愈伤组织发生的因素
熊海浪1，于振艳2，张宗申1* ，刘同祥2，叶乾堂2
(1．大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034;
2．河南省海乐森药用细胞工程技术有限公司，河南 郑州 450001)
摘要:目的 研究影响重楼愈伤组织发生的关键因素。方法 以重楼的根状茎、侧根、茎、叶、种胚等为材料，在添加不同配
比的激素组合的 MS培养基中培养。结果 在上述 5 种材料中，只有种胚在胚乳看护培养的条件下才能诱导出愈伤组织;
IAA诱导重楼愈伤组织的作用最大，而 6 － BA 对重楼愈伤组织分化的调节作用较好;MS + 2 mg·L －1 IAA + 0． 02 mg·
L －1 6 － BA是诱导愈伤组织的最佳培养基，诱导率达到 53． 3%。结论 合适的外植体和激素组合是诱导重楼愈伤组织的
关键因素。
关键词:重楼; 愈伤组织; 诱导; 药用植物
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 06． 023
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)06-1372-02
Factors Affecting the Formation of Callus of Paris polyphylla ，An Endangered Medicinal
Plant Species
XIONG Hai-lang1，YU Zhen-yan2，ZHANG Zong-shen1* ，LIU Tong-xiang2，YE Qian-tang2
(1． School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China;2． Henan Health Me-
dicinal Cell Engineering and Technology Ltd． Company，Henan Zhengzhou 450001，China)
Abstract:Objective To study the key factors affecting the formation of callus of Paris polyphylla．Methods The explants (rhizo-
mes，lateral roots，stems，leaves and seeds )were cultured on the MS basal medium with supplement of various combinations of-
phytohormones． Results Callus could be induced successfully from the seed embryos only with the method of nursing culture of
endosperm． It＇s also found that IAA exhibited the greatest capacity to improve the induction of Paris callus among tested phtohor-
mones，however，6 － BA possessed stronger ability in regulating the differentiation of Paris callus than IAA did． In addition，it＇s
demonstrated that the formula of MS + 2 mg·L －1 IAA + 0． 02 mg·L －1 6 － BA was proven to be better for the induction of Paris
callus，and achieved a maximum induction rate of 53． 3% ． Conclusion Appropriate explants and combinations of phytohormones
might play pivotal roles in inducing the formation of callus of Paris polyphylla．
Key words:Paris polyphylla; Callus; Induction; Medicinal plant
重楼是延龄草科(Trillilaceae)重楼属 Paris L． 植物的统称，
系多年生草本植物［1］。世界上共有 24 种重楼，我国有 19 种［1］，
遍布于云南、四川、广西、贵州等省份。重楼是一种全草入药的野
生名贵民族药材，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效，是
云南白药、季德胜蛇药片、热毒清和宫血宁等多种中成药的主要
原料之一［2，3］。近年来，由于生境破坏、滥采滥挖，使野生重楼资
源濒临枯竭，再加上切块繁殖耗种量大、种子发芽率低及生长周
期长(从发芽到药用一般 5 年) ，导致重楼药材供应严重短缺且
品质参差不齐，直接影响到以重楼为主要原料的中药品种的生存
和发展。
利用组织培养技术可短时间内繁殖大量性状优良的幼苗，而
且不受地区、季节与气候等因素限制，可以全年生产，是解决珍稀
濒危药用植物资源的重要途径之一，并已在多种药用植物上取得
成功［4 ～ 10］。本文以滇重楼 Paris polyphylla var． yunnanensis 为材
料，探索重楼愈伤组织诱导的最佳外植体和最佳激素配比，为后
续的重楼组织培养育苗提供重要依据。
1 植物材料
滇重楼种子由云南农业科学院药用植物研究所提供。种子
于 10 月采集后去除外种皮，置于 4℃的冰箱中层积 3 ～ 5 个月，备
用。
所用根、茎、叶等外植体取自大连工业大学药用植物细胞工
程研究室盆栽的重楼植株。重楼根茎购自云南佳禾野生滇重楼
繁育种植基地，种植在充满珍珠岩的苗床中，定期喷洒 MS 营养
液，维持(20 ± 2)℃，12 h散光照，大约 2 个月后长出新芽。
2 方法
2． 1 外植体的处理 从经过低温层积处理的备用种子中选取籽
粒饱满的重楼种子，用 30℃温水浸泡 4 h，再用纱布包裹，保持湿
度，与培养皿一起放置于 20℃人工气候植物培养箱中 7 d，取出，
用自来水冲洗、用脱脂棉擦洗表面 1 h，再用 75%的酒精浸泡 10
s，0． 1%的 HgCl2 处理 20 min，无菌水冲洗 3 次，备用。
选取幼嫩植株，将地上茎叶剪下，用自来水冲洗 30 min 后，
再用 75%的酒精浸泡 5 s，0． 1%的 HgCl2 处理 6 ～ 8 min，无菌水
冲洗 3 次，最后在无菌条件下将无菌幼茎切成 1 cm左右的切段，
将无菌幼叶切成 1 cm × 1 cm大小的方块。
选取带芽多侧根的根茎，用自来水冲洗、软毛刷刷洗和脱脂
棉擦洗表面 2 h，再用 75%的酒精浸泡 30 s，0． 1%的 HgCl2 处理
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 6
20 min，无菌水冲洗 3 次，最后在无菌条件下将须根切成 1 cm 左
右的切段，将根茎切成 1 cm × 1 cm大小的方块。
2． 2 愈伤组织的诱导 在无菌条件下，将处理好的外植体分接种
于含不同激素配比的 MS基本培养基上，每瓶培养基中接种 3 块
外植体，再于温度(20 ± 2)℃下进行暗培养，连续观察 30d。培养
基中添加蔗糖 30 g /L，琼脂 8 g /L，pH调至 5． 8。
3 结果
3． 1 生长素和细胞分裂素配比对不同外植体诱导愈伤组织的影
响 将重楼 5 种外植体在添加不同激素配比的培养基上培养，然
后连续观察 30 d愈伤组织诱导情况。结果如表 1 所示，在激素
方面，处理 a、d、k、n、o、p、q、r 上都有愈伤组织产生，在外植体方
面，只有种子经切开预处理，在 1 周后能诱导出愈伤组织，并且该
愈伤组织沿着种胚所在位置发生、生长，外观呈黄白色，组织致
密、结实(图 1 － A)。对比处理 a、d、k、n、p、q、r 的激素种类可以
看出，所有处理中都添加了 2 mg·L －1 IAA，说明 IAA 有利于重
楼愈伤组织的诱导，且重楼愈伤组织诱导的最佳生长素浓度数量
级是 10 －5。
同时实验过程中还发现处理 a、d、k中的愈伤组织过于紧密，
生长缓慢，30 d后大小无明显变化。处理 n、o中的愈伤组织呈白
色紧密状态，生长较快，但在 30 d后开始分化出芽(如图 1 － B)。
处理 p、q、r中的愈伤组织呈淡黄色、紧偏松状(如图 1 － C) ，生长
较快，培养 30 d可长至 1 cm × 3． 5 cm的小块。由此说明重楼愈
伤组织诱导的最佳细胞分裂素浓度数量级是 10 －7。
本研究接种茎、叶、须根、根茎 4 种外植体各 250 块，均不能
产生愈伤组织，诱导率为 0;接种种子切片 340 块，产生愈伤组织
67 块，诱导率为 19． 7%。统计处理 k至处理 r的数据发现，在附
加 6 － BA 的培养基中，接种种子切片外植体 90 块，产生愈伤组
织 35 块，诱导率为 38． 9%，在附加 KT 的培养基中，接种种子切
片外植体 90 块，产生愈伤组织 28 块，诱导率为 22． 2%，说明，6 －
BA比 KT更有利于重楼愈伤组织的诱导。
A －种子培养 7 d后，在一端诱导出愈伤组织;
B －培养基中添加 6 － BA 0． 2 mg·L －1，
30 d后愈伤组织和芽同时出现;
C － 6 － BA 0． 02 mg·L －1时诱导 30 d的愈伤组织
图 1 诱导的愈伤组织
上述结果表明，重楼愈伤组织的诱导非常困难，可能与重楼
种子或其它外植体内存在抑制细胞脱分化的因素有关，或者本文
涉及的激素配比以及培养条件不太适合重楼愈伤组织生长，需要
在后续的研究中优化各种培养条件。
3． 2 种子不同处理方式对愈伤组织诱导的影响 为了证实诱导
的愈伤组织是来自种子的胚还是胚乳，进一步对种子作不同的预
处理后再分别诱导。选取经 6 个月低温层积的重楼种子作二次
变温处理，以促进重楼种胚后熟和解除种子休眠，在无菌条件下
将胚挑出或将种子切成薄片后置于 MS + IAA 2 mg·L －1 + 6 －
BA 0． 02 mg·L －1的培养基中培养，连续观察 30d发现，单独挑出
的重楼种胚并不能产生愈伤组织，只有在进行胚乳看护培养时才
能诱导出愈伤组织(表 2) ，诱导率为 53． 33%。该结果表明，重楼
种子诱导愈伤组织需要胚乳提供包括营养物质在内的多种成分
参与。
表 1 KT、BA、IAA、NAA和 2，4 － D不同配比
对重楼不同外植体愈伤组织诱导的效果
编号
ρ(生长调节剂)/mg·L －1
KT 6 － BA IAA NAA 2，4 － D
外植体
茎 叶 根状茎 须根 种子*
a 2 － － － － +
b 2 － － － － －
c 2 － － － － －
d 1 2 － － － － +
e 1 2 － － － － －
f 1 2 － － － － －
g 1 1 1 － － － － －
h 1 1 1 － － － － －
i 1 1 1 － － － － －
j 1 10 － － － － －
k 1 2 － － － － +
l 2 2 － － － － －
m 2 2 － － － － －
n 0． 2 2 － － － － + + +
o 0． 2 2 － － － － +
p 0． 02 2 － － － － + + +
q 0． 02 2 － － － － + +
r 0． 02 0． 02 2 － － － － +
种子* 为沿种脐切开的种子切片，“ +”表示诱导出愈伤组织，“ －”表示没有诱
导出愈伤组织
表 2 经不同处理的种子诱导愈伤组织的结果
编号
ρ /mg·L －1
IAA 6 － BA
外植体
胚乳看护培养 种胚培养 胚乳培养
s 2 0． 02 32 /60 0 /60 0 /60
n /m中 n表示产生愈伤组织的块数，m 表示接种外植被体块数，ρ 为
生长调节剂
4 讨论
重楼是目前测定过的基因组最大的物种［11］，也是重要的民
族药材，长期用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、温热病高热、跌
扑伤痛、惊风抽搐等病症的治疗。近年来，以重楼为材料的研究
越来越多，但主要集中在药理学、孢粉学、系统分类、共生菌、切块
繁殖及栽培等方面，而对愈伤组织诱导和培养以及根茎分化研究
较少。由于重楼具有极高的药用价值，并且其野生资源处于珍稀
濒危状态，因此研究重楼的快繁技术具有重要的实际价值。
生长素和细胞分裂素的种类和配比对愈伤组织的诱导效果
影响很大。本研究发现，单独使用 2 mg·L －1 IAA可以促进重楼
产生愈伤组织，而同浓度的 NAA 和 2，4 － D 明显具有抑制作用。
6 － BA 和 KT 在和生长素混合使用的情况下都能对愈伤组织产
生调节作用。在不同外植体中，根状茎、叶、须根、茎都不能诱导
出愈伤组织，可能是由于这些外植体的自我增生能力低于庞大基
因组复制所造成的负担。种胚只有在有胚乳看护的条件下才能
诱导出愈伤组织，说明胚乳中一定拥有某种促进胚生长的物质，
因此，在培养基中添加香蕉汁等外源有机物质或许能促使种胚诱
导出愈伤组织。
本实验以种胚为材料，在进行胚乳看护培养的条件下，成功
诱导出愈伤组织，该愈伤组织在 MS + 2 mg·L －1 IAA + 0． 02 mg
·L －1 6 － BA上培养，呈紧密状，淡黄色，30 d 后，可长至 1 cm ×
3． 5 cm;如果提高 6 － BA浓度 10 倍，可明显出现分化的现象。与
李群等［12］以芽为材料的实验相比，诱导率更高，并且不受外植体
取材时间限制，是一种愈伤组织诱导的好方法，为下一步愈伤组
织分化增生提供充足的材料，更为重楼组织培养快繁技术打好坚
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 6 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 6 期
实的基础。但是现已诱导出的愈伤组织还是偏紧密，不利于其快
速增殖，因此有必要继续优化培养基配方和激素配比。
参考文献:
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收稿日期:2011-10-14; 修订日期:2012-01-05
基金项目:广西壮族自治区科学基金(No． 0728078)
作者简介:覃骊兰(1980-) ，女(汉族) ，广西岑溪人，现任广西中医学院讲
师，硕士学位，主要从事中医药基础理论与药效筛选的研究工作．
青蟹水煎液对小鼠妊娠影响的实验研究
覃骊兰
(广西中医学院药学院，广西 南宁 530001)
摘要:目的 研究广西青蟹水煎液对小鼠妊娠的影响。方法 随机将 40 只妊娠小鼠分成 5 组，即 A组:生理盐水组;B组:
米非司酮组;C、D、E组分别为青蟹低、中、高剂量组，每组 8 只，灌胃给药。剂量分别为:A组给予生理盐水 0． 2 ml /10g;B
组给予米非司酮 2 mg /kg;C、D、E组分别给予青蟹水煎液 5，10，20 g /kg。结果 青蟹水提物 5，10，20 g /kg 对早期妊振均
有较显著的致流产、致死胎的作用，且随剂量增加作用增强，部分胚胎坏死吸收。结论 青蟹主要影响小鼠妊娠着床期和
孕早期，对妊娠中晚期影响不大。
关键词:青蟹水煎液; 妊娠小鼠; 抗生育
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 06． 024
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)06-1374-02
广西是个八山一水一分田一片海的少数民族自治区，水产品
品种十分丰富。改革开放以来，广西水产业取得了迅猛发展。作
为重要水产品的青蟹已经成为区内外广大人民群众餐桌上重要
的食用佳品和菜肴。然而不仅在中医学领域中还是在民间，都有
认为食用青蟹对人体有一些不良影响，特别是对孕妇有一定的致
流产作用等，因此青蟹自然在孕妇忌口的范围中。本实验观察广
西青蟹水煎液对小鼠妊娠各阶段的影响，为孕妇科学食用青蟹提
供实验依据。
1 材料
1． 1 动物 成年雄性昆明小鼠 60 只，成年雌性昆明小鼠(未孕)
180 只，体质量均(28 ± 3)g，由广西医科大学实验动物中心提供。
1． 2 药物 水煮青蟹(锯缘青蟹 Scylla serrata，属甲壳纲，梭子蟹
科)。过滤，浓缩滤液成浸膏，放冰箱。实验时把浸膏以生理盐
水配成一定浓度。
1． 3 试剂 米非司酮片(国药准字 H20010633，生产厂家为北京
紫竹药业有限公司) ，由广西中医学院瑞康医院药剂科提供。
2 方法
2． 1 实验条件 室温(25 ± 2)℃，湿度(55 ± 5)%，通风清洁，饲
以鼠料，给水充分，安静。
2． 2 造模 将 10 ～ 12 周小鼠雌雄以 3∶ 1 合笼，每天上午 8 时检
查雌鼠阴道口有无阴栓，将出现阴栓的雌鼠取出，作为妊娠的第
1 天，按日期分组饲养。
2． 3 实验分组与给药 将妊娠小鼠按体重分组，然后按随机数目
表法将妊娠小鼠分成 5 组，A 组(生理盐水组) ;B 组(米非司酮
组) ;C组(青蟹高剂量组) ;D(青蟹中剂量组) ;E组(青蟹低剂量
组) ，8 只 /组。每组灌胃给药。剂量分别为:A 组给予生理盐水
0． 2 ml /10g;B组给予米非司酮 2 mg /kg;C、D、E组分别给予青蟹
水提物 5，10，20 g /kg。
2． 4 观察一般情况 密切观察小鼠的健康情况，如精神状态、食
欲、反应活动状况、背毛色泽等。
2． 5 青蟹水煎液对小鼠妊娠的影响
2． 5． 1 抗着床实验 取妊娠第 1 天雌鼠 40 只，随机分成 5 组:A、
B、C、D、E组，每组 8 只。于妊娠 1 ～ 4 d连续灌胃给予相应药物，
2 次 /d，早晚各一次。剂量同“2． 3”项。于第 5 天尾静脉注射
2． 5%滂胺蓝生理盐水 2 ～ 3 ml /kg，注射后 15 min处死动物，检查
子宫中染成蓝色的着床点。或于妊娠第 12 天处死雌鼠，剖腹检
查子宫内胚胎数及其发育状况，记录妊娠动物数，计算终止妊娠
率。
2． 5． 2 抗早孕实验 取妊娠第 6 天雌鼠 40 只，随机分成 5 组:
A、B、C、D、E组，每组 8 只。于妊娠 6 ～ 8 d连续灌胃给予相应药
物，2 次 /d，早晚各一次。剂量同“2． 3”项。给药期间观察有无流
产现象。于妊娠第 12 天处死雌鼠，剖腹检查子宫内胚胎数及其
发育状况，记录妊娠动物数，计算终止妊娠率。
2． 5． 3 抗中孕实验 取妊娠第 9 天雌鼠 40 只，随机分成 5 组:A、
B、C、D、E组，每组 8 只。于妊娠 9 ～ 12 d 连续灌胃给予相应药
物，2 次 /d，早晚各一次。剂量同“2． 3”项。给药期间观察有无流
产现象。于妊娠第 16 天处死雌鼠，剖腹检查子宫内胚胎数及其
发育状况，记录妊娠动物数，计算终止妊娠率。
2． 5． 4 抗晚孕实验 取妊娠第 16 天雌鼠 40 只，随机分成 5 组:
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