全 文 ：中国农业科学 2008,41(11):3716-3721
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.11.036

收稿日期：2007-10-09；接受日期：2008-02-25
基金项目：国家自然科学基金（30571286）和国家公益性行业（农业）科研专项经费（nyhyzx07-024）
作者简介：彭 静（1983-），女，山东枣庄人，硕士，研究方向为果树生理学。Tel：0538-8245986；E-mail：pswallow123@163.com。通讯作者彭福
田（1969-），男，山东莒南人，教授，研究方向为果树生理学。Tel：0538-8245986；E-mail：pft@sdau.edu.cn



氮素形态对平邑甜茶 IPT3 表达与内源激素含量的影响
彭 静，彭福田，魏绍冲，主春福，周 鹏，姜远茂
（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

摘要：【目的】研究 NO3- 和 NH4+对平邑甜茶生长的影响及其与异戊烯基转移酶基因（MhIPT3）表达、细胞分
裂素含量变化的关系。【方法】在水培条件下，以平邑甜茶实生苗为试材，测定分析不同供氮形态对植株生长的影
响, 同时采用实时荧光定量 PCR 研究 MhIPT3 表达量的变化，采用酶联免疫测定植株中 Z+ZR 与 iP+iPA、IAA、ABA
含量的改变。【结果】（1）处理 24 h，NO3-处理的叶面积略高于 NH4+处理，但差异不显著，第 72 小时测定结果已
存在显著差异；且 NO3-处理的植株生长量和株高均高于 NH4+处理。（2）NO3-处理 0.5 h，新根中 MhIPT3 表达量开始
增加，2 h 达到最大，之后下降但仍高于起始水平，而各个测定时期 NH4+处理与 KCl 对照 MhIPT3 表达量变化不大。
（3）根中 iP+iPA 和 Z+ZR 与 MhIPT3 表达量呈现相似的变化趋势。（4）处理 24 h，NO3-处理与 NH4+处理 IAA 含量差
异不显著，ABA 含量 NO3-处理高于 NH4+处理；到第 72 小时与 168 小时，IAA 含量差异仍然不显著，ABA 含量 NO3-处
理低于 NH4+处理。【结论】NO3-作为信号通过诱导 MhIPT3 基因表达，促进细胞分裂素合成，可能是平邑甜茶对硝态
氮与铵态氮早期生长反应差异的重要原因之一。
关键词：平邑甜茶；硝态氮；IPT3；内源激素

Effect of Nitrogen Forms on IPT3 Expression and Hormone
Contents of Pingyitiancha (Malus hupenensis Rehd.)
PENG Jing, PENG Fu-tian, WEI Shao-chong, ZHU Chun-fu, ZHOU Peng, JIANG Yuan-mao
(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology,
Tai’an 271018, Shandong)

Abstract:【Objective】Experiments were carried out to study the mechanism about the effects of nitrate and ammonium on the
growth of Malus hupenensis Rehd. Seedlings and the relationship among nitrogen forms, MhIPT3 expression and the concentrations
of cytokinin. 【Method】 Under water culture condition, analyzing the effect of nitrogen forms on the growth of Malus hupenensis
Rehd, on the MhIPT3 expression by quantitative real-time PCR and on the contents of Z+ZR, iP+iPA, IAA, as well as ABA by
ELISA.【Result】No significant difference was observed in leaf area between the treatment and the control in 24 hours after nitrate
treatment, but the leaf area of nitrate treatment were larger than ammonium treatment after 72 hours and 168 hours. When nitrate was
supplied to seedlings, MhIPT3 transcripts rapidly accumulated within 0.5 hour, the manner of MhIPT3 induction corresponded well
with that the accumulation of Z+ZR and iP+iPA. The levels of IAA were similar between nitrate treatment and ammonium treatment.
The amounts of ABA by supplied nitrate were upper than ammonium treatment after 24 hours, then decreased and lower than
ammonium treatment.【Conclusion】 It is presumed that nitrate can act as a signal to induce the expression of MhIPT3 and promote
the synthesis of cytokinin. That is an important reason why nitrate is better than ammonium for the early growth of Malus hupenensis
Rehd.
Key words: Malus hupenensis Rehd.; Nitrate; IPT3; Hormone

11 期 彭 静等：氮素形态对平邑甜茶 IPT3 表达与内源激素含量的影响 3717
0 引言
【研究意义】氮素既是植物最重要的结构物质，
又是生理代谢中最活跃、无处不在的重要物质——酶
的主要成分[1]，所以氮素对植物生理代谢和生长有重
要作用。植物所利用的主要氮素形式是铵态氮（NH4+）
和硝态氮（NO3-），植物吸收 NO3-后，经氮同化将
NO3-还原为 NH4+加以利用。不同形态氮素对植物生长
发育的影响存在差异，但其机理并未完全阐明。平邑
甜茶（Malus hupenensis Rehd.）是中国特有的植物资
源，广泛用作苹果砧木，研究氮素形态对其生长影响
的生理机制，可以为利用不同形态氮养分调控苹果生
长发育提供理论参考。【前人研究进展】有报道认为
不同形态氮素通过影响植物内源激素的变化，引起植
物生长发育的改变。植物组织中的细胞分裂素浓度与
供氮水平呈正相关[2~4]，并且不同形态氮素对细胞分裂
素种类和水平有不同影响[5,6]。烟草[7]、荨麻[8]、大麦[9]
以及在玉米[4]上的研究表明，硝态氮比铵态氮更能促
进细胞分裂素的合成，从而引起不同的生长效应。异
戊烯基转移酶是控制细胞分裂素合成的关键酶，Takei
等[10]已在拟南芥上克隆了 7 个编码异戊烯基转移酶的
基因（AtIPT1，AtIPT3-AtIPT8）。与拟南芥相似，水
稻[11]、大白菜[12]和莲花（Liu Y，Liu J，Unpublished）
上也存在多个 IPT 基因，而桑椹[13]、蛇麻草[14]和大
豆[15]上仅存在一个 IPT 成员。对拟南芥 IPT 基因的研
究还发现，硝酸盐能在 30 min 内上调 IPT3 基因的表
达，从而促进细胞分裂素的合成，IPT3 是拟南芥对
NO3-信号响应的关键基因，铵态氮虽然能通过上调
AtIPT5 的表达促进细胞分裂素合成，但 AtIPT5 对铵态
氮的响应需要数天时间，因此短期内硝态氮处理植株
细胞分裂素含量高于铵态氮处理[16]。而在苹果矮化砧
木上的试验表明，施用铵态氮比硝态氮更能促进苹果
细胞分裂素的合成[5]。【本研究切入点】本研究在成
功克隆平邑甜茶异戊烯基转移酶基因（MhIPT3）的基
础上，利用荧光定量 PCR 鉴定硝态氮能否上调
MhIPT3 基因的表达，同时测定植株内源激素含量及
生长的变化。【拟解决的关键问题】研究确定 NO3-
作为信号诱导 MhIPT3 基因表达，促进细胞分裂素合
成，是否是平邑甜茶对硝态氮与铵态氮生长反应差异
的重要原因。
1 材料与方法
1.1 试验材料
平邑甜茶（Malus hupenensis Rehd.）种子经过低
温层积处理消毒后播种于洗净消毒的河沙中。每天浇
Hoagland 营养液氮浓度为 80 µmol·L-1，以 KNO3为氮
源，培养条件为光照 14 h，光强 230～260 µmol·m-2·s-1，
温度 22～25℃，相对湿度 50%～60%。
1.2 试验方法
1.2.1 材料处理 当幼苗长到 6 片真叶时，选长势相
近的植株移至双蒸水中，水培容器直径 20 cm，高 25
cm，每盆 3 株幼苗，每 10 盆为 1 个重复。进行氮饥
饿 48 h 后开始处理，处理液均用无氮 Hoagland 营养
液配制，以 KNO3设置 NO3-浓度, NH4Cl 设置 NH4+浓
度，对照为 KCl，浓度为 16 mmol·L-1。Hoagland 营养
液其它元素的浓度：MgSO4·7H2O 1.2 mmol·L-1，CaCl2
2.0 mmol·L-1 ， KH2PO4 0.5 mmol·L-1 ， H3BO3 10
µmol·L-1，MnSO4 0.5 µmol·L-1，ZnSO4 0.5 µmol·L-1，
CuSO4 0.1 µmol·L-1，Fe-EDTA 15 µmol·L-1，(NH4)6Mo7O24
0.01 µmol·L-1。pH 5.5～6.5。在 NH4Cl 处理中加入
K2SO4以补充 K+浓度。分别诱导处理 0、0.5、2 和 3.5
h，按根、茎、叶收集材料，用于 RT-PCR、荧光定量
PCR、激素的测定。叶面积按 24、72 和 168 h 取样，
同时在 168 h 测定植株的鲜重、干重和株高。
1.2.2 总RNA的提取 经诱导的平邑甜茶幼苗根约 2
g，用双蒸水冲洗吸干水分，于液氮中研磨，加入 5 ml
CTAB 提取液，后续步骤根据 CTAB 法操作说明进行。
1.2.3 RT-PCR 提取的总 RNA 用 SMART™ RACE
cDNA Amplification Kit（Clontech 公司）进行逆转录，
合成 cDNA 第一链，并用其作为模板进行 PCR 扩增。
根据 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit 说明书
操作。根据 GenBank 上注册的苹果叶片中 IPT 的 EST
序列设计 5′RACE 和 3′RACE 特异引物，5′RACE 特异
引物 GSP5：5′-ACTTTCCAGTCCCTGTTGCTCCCAT
TAC-3′；3′RACE 特异引物 GSP3：5′-CCGGCAGAA
GGAGAAGG-3′。RACE 程序按照 Clontech 公司的
5′RACE 和 3′RACE 试剂盒的说明书进行：94℃ 30 s，
72℃ 3 min，5 个循环；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3
min，5 个循环；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，
27个循环。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA
纯化试剂盒（上海生物工程公司）回收目的条带，克
隆到 pMD-18T 载体（TaKaRa 公司）上，进行序列分
析。
1.2.4 荧光定量 PCR 根据 MhIPT3 基因的核苷酸序
列设计探针，以 r18s 为内参，利用 TaqMan 探针荧光
定量 PCR 检测氮素对 MhIPT3 基因表达的影响。使用
3718 中 国 农 业 科 学 41 卷
Primer Express 软 件 设 计 引 物 探 针 ： MhIPTf:
GAAGGAGAAGGTGGTGATCGTA；MhIPTr：GACTT
GCATTTTGTCGGAG；MhIPTprobe: fam+AACAGGG
ACCGGAAAGTCAAGGC+tamr。
PCR 反应条件为：94℃预变性 4 min 后，按以下
程序进行：94℃ 20 s，60℃ 30 s，共 40 个循环。荧
光定量 PCR 仪为上海枫岭生物技术公司产品，型号为
FTC2000。
1.2.5 叶面积的测定 采用复印称重法[17]，在每天
的同一时间将叶片覆盖在复印纸上，将复印纸剪成叶
形并称重，则单张叶片面积＝整张复印纸面积×叶形
纸重/整张复印纸重。将全部单张叶面积累加，即为整
株的叶面积。所有数据均采用 Microsoft Excel 进行统
计分析。
1.2.6 激素的测定 采用酶联免疫吸附测定法
（ELISA）测定，将植株按根、茎、叶分别采样，称
取 0.5 g 样品，加入预冷的 95%甲醇共 5 ml，冰浴研
磨，匀浆液倒入离心管中，于 4℃，10 000 r/min 离心
10 min，取上清液，过 C18 胶柱，过滤液即可用于免
疫测定。ELISA 试剂盒由中国农业大学提供，在中国
农业大学农学与生物技术学院进行。各处理重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 MhIPT3 基因的克隆
本研究把 5′RACE 和 3′RACE 产物拼接后获得 1
个 1 314 bp 基因，该基因包括 1 个 248 bp 的 5′非编码
区，963 bp 的编码区共编码 321 个氨基酸和 151 bp 的
3′非编码区，预测分子量为 37.3 kD。由图 1 的进化树
分析可以看出，本试验克隆的基因所编码的氨基酸与
LjIPT3 （ Lotus japonicus ）、 AtIPT3 （ Arabidopsis
thaliana）、BrIPT3（Brassica rapa L.）和 OsIPT3（Oryza
sativa L.）的同源性最高，所以将该基因命名为
MhIPT3，GenBank 注册号为 DQ792508。用 POSRT Ⅱ
Servrer（http:/psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html）进行
亚细胞定位预测，发现这个基因定位在细胞质中。同
时以基因组 DNA 为模板所克隆的基因序列与以
cDNA 为模板所克隆的序列完全一样，证明 MhIPT3
基因内部没有内含子。
2.2 不同形态氮素对 MhIPT3 表达的影响
从图 2 可以看出，在根际施用 KNO3 0.5 h 后
MhIPT3 基因的表达开始增加，2 h 后达到最大值，随
后下降但仍高于 KCl 和 NH4Cl，NH4Cl 处理在 0.5 h
时有一峰值但随后下降，低于 KCl 处理。


图 1 MhIPT3 编码的氨基酸序列与其它基因所编码的氨基
酸序列的同源性比较（DNAMAN）
Fig. 1 Rooted phylogenetic tree of cloned plant IPTs,
constructed with DNAMAN according to the
alignment result of amino acid sequences



图 2 不同形态氮素对 MhIPT3 表达的影响
Fig. 2 Effect of supply of inorganic nitrogen sources on
MhIPT3 expression

2.3 不同形态氮素对 Z+ZR 和 iP+iPA 含量的影响
细胞分裂素合成的过程是DMAPP在 IPT3催化下
与 ATP/ADP 作用合成 iP，然后在 CYP735A（细胞分
裂素羟化酶）的作用下生成 tZ 型细胞分裂素，而
CYP735A 主要活性形式 CYP735A2 主要在根中表达，
所以根部是 tZ 型细胞分裂素合成的主要部位[18]。这与
11 期 彭 静等：氮素形态对平邑甜茶 IPT3 表达与内源激素含量的影响 3719
本试验结果一致，处理前平邑甜茶根系玉米素和玉米
素核苷含量较低，NO3-处理 0.5 h 后，Z+ZR 含量增加
到最大，随后 Z+ZR 的含量呈下降趋势，但始终高于
对照；NH4+处理后，根部的 Z+ZR 含量逐渐升高，在
2 h 达到最大但低于 NO3-处理，随后开始下降。（图
3-A）。



图 3 NO3-和 NH4+对根部 Z+ZR 和 iP+iPA 含量的影响
Fig. 3 Effects of NO3- and NH4+ on Z+ZR and iP+iPA level in roots

根部异戊烯基腺嘌呤及其核苷（iP+iPA）在 NO3-
处理 2 h 后，含量达到最大值，然后逐渐下降；NH4+
处理的 iP+iPA 含量比 NO3-处理早 1.5 h 达到最大，而
后在 2 h 内大幅度下降，低于对照，随后略有上升（图
3-B）。一般认为在根部合成的细胞分裂素会沿木质部
运输到叶片，由表 1 可以看出随着处理时间的延长，
NO3-处理的叶片中 Z+ZR 和 iP+iPA 含量显著高于
NH4+处理。

表 1 不同形态氮素对叶片中 Z+ZR 和 iP+iPA 含量的影响
Table 1 Effects of NO3- and NH4+ on Z+ZR and iP+iPA level
in leaves
处理
Treatment
处理时间
Treatment time (h)
Z+ZR
(ng·g-1FW)
iP+iPA
(ng·g-1FW)
对照
Control
24
72
168
52.01 Bb
37.86 Cc
23.83 Cc
7.18 Bb
13.27 Cc
6.38 Cc
NO3- 24
72
168
64.57 Aa
122.87 Aa
34.37 Aa
28.87 Aa
78.98 Aa
148.98 Aa
NH4+ 24
72
168
50.05 Bb
100.34 Bb
27.05 Bb
11.52Bb
61.53 Bb
124.67 Bb
不同大小写字母分别表示 0.01 和 0.05 水平下 LSD 法的多重比较结果。
下同
Different capital and small letters indicate significant differences at 0.01 and
0.05 probability levels respectively by LSD. The same as below

2.4 不同形态氮素对叶片中 IAA 和 ABA 含量的影响
在 NO3-与 NH4+处理后，叶片中生长素（IAA）含
量差异不显著。对照由于营养液中缺少足够的氮素，
生长受到抑制，叶片脱落酸（ABA）含量一直很高，
NH4+处理 1 d 时 ABA 含量小于 NO3-处理，但随处理
时间变长，其 ABA 水平逐渐高于 NO3-处理（表 2）。

表 2 不同形态氮素对叶片中 IAA 和 ABA 含量的影响
Table 2 Effects of NO3- and NH4+ on IAA and ABA level in
leaves
处理
Treatment
处理时间
Treatment time (h)
IAA
(ng·g-1FW)
ABA
(ng·g-1FW)
对照
Control
24
72
168
4.33 Aa
2.78 Bb
3.17 Aa
226.93 Aa
122.36 Aa
495.15 Aa
NO3- 24
72
168
5.26 Aa
7.62 Aa
2.63 Aa
187.58 Bb
14.83 Cc
26.20 Cc
NH4+ 24
72
168
4.93 Aa
6.73 Aa
2.58 Aa
133.15 Cc
25.58 Bb
43.90 Bb

2.5 不同形态氮素对平邑甜茶叶面积及生长的影响
NO3-和 NH4+对叶片生长产生不同效应。从表 3 可
以看出，处理 24 h，NO3-处理的叶面积略高于 NH4+
处理，但差异不显著，第 72 小时测定结果已存在显著
差异，随着处理时间的延长，NO3-处理与 NH4+处理叶
面积差异愈显著。由表 4 看出，NO3-处理根部鲜重显
著高于 NH4+处理，两种氮形态处理根部干重低于对
照，但地上部干重、鲜重与株高均以 NO3-处理最高，
3720 中 国 农 业 科 学 41 卷
如果计算地上部与地下部干重之和也以 NO3-处理最
高，因此硝态氮比铵态氮更能促进平邑甜茶幼苗生长。

表 3 不同形态氮素对平邑甜茶幼苗叶面积（cm2）的影响
Table 3 Effect of NO3- and NH4+ on the leaf area of Malus
hupenensis Rehd seedling
处理 Treatments 对照 Control NO3- NH4+
24 h 15.54 Aa 15.50 A a 15.43 Aa
72 h 16.48 Ab 20.71 Aa 17.33 Ab
168 h 17.94 Bb 28.91 Aa 19.37 Bb

表 4 不同形态氮素对平邑甜茶幼苗生长的影响
Table 4 Effect of NO3- and NH4+ on growth of Malus
hupenensis Rehd seedling
对照 Control NO3- NH4+
根 Root 0.17 Aa 0.18 Aa 0.14 Bb鲜重
Fresh weight(g) 地上部 Shoot 0.41Cc 0.67 Aa 0.53 Bb
根 Root 0.022 Aa 0.015Bb 0.012Bb干重
Dry weight(g) 地上部 Shoot 0.11 Bb 0.15 Aa 0.12 Bb
株高 Plant height (cm) 3.28 Bc 3.83 Aa 3.6 Ab

3 讨论
Takei 等认为 Z 型细胞分裂素（Z 和 ZR）是植物
根系感受外界氮水平变化向地上部传递的信号，运输
到叶片的 Z 和 ZR 通过双组分信号系统的作用，引起
叶肉细胞分裂，叶面积扩大[4]。玉米[4]、大麦[19]与烟
草[20]等作物上的研究结果都表明，NO3-处理叶面积显
著高于铵态氮处理更能促进细胞分裂素合成有关，并
且在拟南芥上已证实 NO3-通过上调细胞分裂素合成
基因 IPT3 的表达，而促进细胞分裂素合成[10]。硝态
氮刺激 IPT 基因表达，从而引起细胞分裂素含量增加，
最终导致叶面积增加，这 3 个环节在同一种植物上还
缺乏试验证据，本试验以平邑甜茶为试材提供了这方
面的证据。本试验中 NO3-处理 0.5 h 后，MhIPT3 基因
的表达量开始增加，2 h 后达到最大，NH4 +处理和对
照基本没变化（图 2），平邑甜茶根部 Z+ZR 和 iP+iPA
含量与该基因的表达量虽然并不是一直成正相关，但
二者变化趋势相似（图 3，表 1），并且 NO3-处理植
株第 72 小时测定时叶面积已显著增加（表 3）。
但 Gao 等[5]的研究表明，苹果矮化砧木木质部细
胞分裂素浓度显著高于乔化砧木，并且对矮化砧木而
言，铵态氮处理木质部汁液的细胞分裂素含量显著高
于硝态氮处理，而对乔化砧而言，不同形态氮处理植
株细胞分裂素含量差异不显著。本试验采用的苹果的
乔化砧——平邑甜茶的研究的结果与Gao等在矮化砧
上的研究结果相反，推测乔化砧木与矮化砧木 IPT 基
因家族成员组成与表达特性可能存在差异，苹果矮化
砧木可能是 IPT 超量表达的，并且对铵态氮更敏感，
有关于 IPT 过量表达植物表现出矮化效应的报道[15]，
需要进一步克隆苹果矮化砧木的 IPT 基因，并研究其
表达特性。在不同形态氮养分对乔化砧木细胞分裂素
含量影响方面，本研究的结果与之也存在差异，笔者
认为这可能与采样时间有关，Gao 等的研究主要是针
对不同形态氮素的长期效应，而本试验主要研究不同
形态氮素的短期效应，在拟南芥上的研究结果表明铵
态氮能通过上调 AtIPT5 的表达，促进细胞分裂素合
成，只是该基因响应需要较长的时间。因此，不同形
态氮养分对平邑甜茶生长与细胞分裂素含量影响的长
期效应还需做进一步研究。
除了细胞分裂素，生长素和脱落酸对植物生长发
育和代谢也有着重要调节作用。生长素参与和调控植
物生长发育的多个过程，如根的伸长生长、顶端优势、
细胞的伸长等。本试验中，NO3-和 NH4+处理对 IAA
影响不大，说明 NO3-和 NH4+对平邑甜茶生长产生的
不同影响与 IAA关系不大。脱落酸则会抑制植物生长，
促进衰老。Walch-Liu 等[20]和 Rahayu 等[21]研究认为，
NO3-处理提高了植株 Z+ZR 水平，促进了植株生长，
NH4+处理降低了叶片 Z+ZR 浓度，抑制了植株生长，
而与 iP＋iPA 和 ABA 浓度变化无关。还有研究认为，
NH4+处理抑制叶片生长是由于植株 ABA 含量上升引
起的[22,23]。本试验中，处理 24 h，NO3-处理的 ABA 含
量高于 NH4+处理；而到第 72 与 168 小时，ABA 含量
NO3-处理低于 NH4+处理（表 1，2）。NO3-和 NH4+对
平邑甜茶生长产生的不同影响与 ABA 是否有关，还
有待于进一步的研究。
4 结论
本研究克隆的 MhIPT3 基因与拟南芥的 AtIPT3 基
因具有相同的表达特性，在根际施用 NO3-后上调
MhIPT3 的表达并促进细胞分裂素的合成。NO3-作为
信号诱导 MhIPT3 基因表达，促进细胞分裂素合成可
能是平邑甜茶对硝态氮与铵态氮早期生长反应差异的
重要原因之一。

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（责任编辑 曲来娥）