全 文 ：收稿日期:2000-07-25;修回日期:2000-11-08
中图分类号:Q946.885+.1　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1004-311X(2000)06-0043-03
反相高效液相色谱法测定平邑
甜茶植株内源 ABA 、IAA含量
兰彦平 ,许雪峰 ,韩振海
(中国农业大学园艺植物研究所 ,北京 100094)
摘　要:用高效液相色谱法(HPLC)分析平邑甜茶内源 ABA、IAA , 选用 Spherisorb C18反相柱 , 用 UV 检测
器进行检测 , 使ABA、IAA得到很好的分离 ,测定方法迅速简便 , 流动相为甲醇 、乙酸和水 , 系统研究了 pH
值 、纯化方法对测定结果的影响 ,确定适合平邑甜茶 ABA、IAA 提取的分离条件。方法的精密度为:变异
系数分别为 2.83 和 2.79 , 最低检出限(信噪比=2)分别为 3.27 和 3.26nmol/ L, 线性范围为 50nmol/ L-
1000nmol/ L ,平均回收率为 91.9%和 92.2%。
关键词:高效液相色谱;平邑甜菜;ABA;IAA
　　近年来 ,植物逆境下的信息传递已受到
生物界学者的普遍关注 ,目前 ,对发生在 1-
2年生的作物植株上的根源干旱信号的研究
已比较深入 ,但对多年生的苹果植株的干旱
信号的研究则报道很少。究其原因 ,样品中
富含酚类物质而使激素信号的精确快速测定
极其困难是一个不可忽视的重要原因。平邑
甜茶是苹果重要的砧木 ,因其具有严格的无
融合生殖特性而常用于果树的抗性生理 ,特
别是抗旱生理研究 。ABA和 IAA 是果树体
内重要的激素 ,对果树的生长发育具有重要
的调节作用。ABA 可以作为根源干旱信号
已得到大量实验的证实[ 1 , 2 ,3] ,而根源 IAA则
可以加强干旱后期水信号的调控作用。目前
ABA和 IAA 的测定方法主要有:a气相色谱(GC)法;b免疫法;c 高效液相色谱(HPLC)
法。GC法虽也具有分离效率高 、速度快 、灵
敏度高和易于自动化等优点 ,但由于它要求
一定的设备来对试样进行甲基化 ,因此使其
应用受到了一定限制 。而免疫法则因其测定
结果不太稳定 、重复性差及放射性物质的欠
安全性而受到限制。HPLC在 ABA 、IAA 的定
量测定方面有一定优势。
1　材料与方法
1.1　仪器:E600型液相色谱仪(Waters公司
生产);UV2487检测器 。
1.2　试剂:ABA 、IAA标准液为 Sigma 公司生
产;甲醇为国产色谱纯;其余均为国产 AR
级。
1.3　实验方法
1.3.1　样品的提取与纯化:将平邑甜茶根
系 、叶片用液氮速冻 , -80℃保存 。提取纯化
方法是:材料加少量液氮研磨后 ,用 80%甲
醇在 4℃提取 24h ,离心 ,减压浓缩至水相 ,用
HCl调节 pH 为 2.8 ,冷冻过夜 。溶解后加入
少量 PVP搅拌 ,静置 5min后离心 ,上清液用
石油醚萃取 3 次 , 无水 Na2SO3 , 去水 , 过
DEAE52柱 ,用 Na2SO4 淋洗 ,收集洗出液 ,经
乙酸乙酯萃取后 ,溶解于少量甲醇 ,待 HPLC
分析 。
1.3.2　色谱条件:色谱柱 Spherisorb C18(美
国Waters 公司 , 4.6mm×250mm),流动相为
50%CH3OH+45%H2O+5%乙酸 , pH ≤3 ,流
速为 0.8ml/min;检测器为 UV254nm ,在上述
色谱条件下 ,取相同体积标准液和样品溶液
分别进行 HPLC 测定。实验依保留时间定
性 ,峰高法定量(外标法)。
1.3.3　标准曲线的制作及结果计算:按照上
述方法操作分别测定 ABA 、IAA 标准液为
1.5ng 、2.5ng 、3.75ng 、5.0ng 、7.5ng、 10.0ng 、
12.5ng、15ng时的峰面积 ,按外标法计算样品
ABA含量。
2　结果与讨论
2.1　样品预处理及色谱条件的选择:有机溶
剂萃取是植物激素纯化的重要步骤之一 ,溶
液在酸性条件下 ,激素进入有机相 ,而碱性条
件下则进入水相 。本实验要求在酸性条件
(pH≤3)下萃取。果树体内富含有机酚类物
质 ,如果不去除会严重干扰测定 ,试验中加入
1/10(g/g)聚乙稀吡咯烷酮(PVP)以沉淀酚类
第 10卷第 6期
2000年 12月 　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　Vol.10 ,No.6
Dec ,2000
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2000.06.016
物质 ,收到良好效果 。对流动相的选择 ,大多
数学者采用甲醇-乙腈-水作为流动相 ,用
磷酸缓冲液调节 pH 值 。本文通过比较几个
流动相组合后发现 ,采用甲醇∶水∶乙酸=50∶
45∶5 ,不但使杂质与主成分很容易分离(图
1),而且降低了分析成本。
图 1 Spherisorb C18 混合
标准ABA与 IAA 色谱图
a为标准 IAA;b为标准ABA.
2.2　ABA 与 IAA 测定的线性:为考察 ABA
与 IAA测定的线性 ,使用标准溶液工作曲线进行色谱测定 ,结果如表 1 ,证明本法有良好
的线性。
表 1　HPLC 法线性试验
ABA IAA
进样量
X(μg) 峰面积 Y(×10-5μV) 进样量X(μg) 峰面积Y(×10-5μV)
1.5 322614 1.5 198277
2.5 333075 2.5 200587
3.75 346159 3.75 201964
5.0 359137 5.0 205667
7.5 385297 7.5 209353
10 411223 10 213046
12.5 437085 12.5 216759
15 463682 15 220526
线性方程
(n=8)
Y=3.07×105+
1.04×104X
Y=1.96×105+
1.63×103X
相关系数(r)　r=0.9994 r=0.9991
2.3　精密度与回收率:对同一样品的 ABA和 IAA进行重复测定 8次 ,测定方法的精密度;在样品溶液中加入已知量的标准溶液 ,测定其回收率 ,结果如表 2 。表明本法测定的
ABA 与 IAA 的回收率分别为 91.9%和
92.2%。
2.4　检测限:最低检测由基线噪音相当于信噪比为2时(S/N=2)的浓度计算 ,分别为 3.
27nmol/L 和 3.26nmol/L。
2.5　样品测定结果:用 30%PEG-6000 对
8w龄平邑甜茶幼苗进行水分胁迫 ,分别测定根系和叶片 ABA 和 IAA 含量 , 结果表明 ,
ABA在干旱胁迫的初始阶段即快速升高 ,短时间内(40min)即达到最大值 ,且根系和叶片的变化趋势基本上是一致的。随干旱时间的延长 ,ABA 浓度不再继续升高 ,而是维持在一个较高水平;植株中的 IAA对干旱的反应较为迟缓 ,处理与对照间无显著差别。根系与叶片对两种激素的反应一致(图 2 、图 3)。表明平邑甜茶遭受水分胁迫时 ABA可能作为信号物质灵敏地调节地上部的反应 ,而
IAA则对干旱的反应无明显规律。
图 2　干旱胁迫下内源 ABA 含量的变化
图 3　干旱胁迫下内源 IAA 含量的变化
表 2　HPLC法重复性试验
试验
次数
本底值(ng)加入量(ng)测得值(ng)回收率(%)
ABA IAA ABA IAA ABA IAA ABA IAA
1 798 145 500 150 1249 282 90.2 91.0
2 782 148 500 150 1237 292 91.0 94.7
3 794 152 500 150 1243 288 89.8 90.7
4 789 143 500 150 1238 286 89.8 95.1
5 796 146 500 150 1282 283 98.2 91.3
6 798 148 500 150 1257 281 94.9 88.6
7 794 150 500 150 1229 289 87.0 92.7
8 795 151 500 150 1248 291 94.1 93.3
平均值 793.3 147.9 91.9 92.2
RSD(%)3.88 2.76
CV(%)2.83 2.79
44　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　第 10卷第6期
参考文献:
[ 1] Zhang J., Davies WJ.Abscisic acid produced in dehydrating
roots may enable the plant to measure the water status of thew
soil[ J] .Plant cell and Environ , 1989 , 12:73-81.
[ 2] Gowing DJG , Jones HG , Davies WJ.Xylem -transported ab-
scisic acid:the relative importance of it s mass and its concen-
tration in the control of stomatal aperture[ J] .Plant cell and
Environ , 1993 , 16:453-459.
[ 3] Ling J , Zhang J , Wong MH.Can stomatal closure caused by
xylem ABA explain the inhibition of leaf photosynthesis under
soil drying? [ J] .Photosyn Res ,1997 , 51;149-159.
收稿日期:2000-09-11
中图分类号:R446.11+1　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1004-311X(2000)06-0045-02
抗核糖核蛋白(RNP)抗体的测定
张欣松1 ,赵锡福2 ,王丽君3
(1.黑龙江省临床检验中心 ,黑龙江 哈尔滨 150008;
2.黑龙江省第三医院 , 黑龙江 北安 164300;3.逊克县医院 , 黑龙江 逊克 164400)
　　抗可提取核抗原(ENA)抗体是一种自身
免疫性抗体 ,主要包括抗核糖核蛋白(RNP)抗
体 、抗 Sm抗体等种类[ 1] 。常用的检测方法为
双向扩散(DID)法 ,该法虽特异性好但敏感性
很低 ,常造成漏检。本文应用国内较少报道的
日本新一代 ELISA法对 264例自身免疫病患
者进行了抗 RNP 抗体测定研究 ,并与常规的
双向扩散法作了对比试验 ,现报道如下 。
1　材料与方法
1.1　待检对象;38名混合结缔组织病(MCTD)
患者 ,70名系统性红斑狼疮(SLE)患者 ,98名
干燥综合征(SJS)患者 ,58名全身进行性硬化
症(PSS)患者 ,180名健康者。
1.2　试剂:ELISA 法抗 RNP 抗体测定用试剂
盒 、双向扩散(DID)法抗 RNP 抗体测定试剂
盒 ,均为日本医学生物学研究所产品。
1.3　方法:待检对象按常规方法取血清后 ,按
ELISA法试剂说明书操作 。待反应完全后于
450nm处测定吸光度(A450),计算 index(%)。
index(%)=(标本的 A450 -阴性标准液的
A450)/(阳性标准液的 A450 -阴性标准液的
A450)×100%。本试剂盒 Cut off值定为 15.0
(index)。同时用 DID法平行进行测定。
2　结果
对 38例 MCTD患者 , 70 名 SLE 患者 , 98
名SJS 患者 , 58 名 PSS 患者 , 180 名健康人用
ELISA法与DID法进行抗 RNP 抗体测定研究 ,
结果见表 1。
表 1　ELISA 法及 DID法测定抗 RNP抗体结果比较
组别 例数
ELISA 法
平均值
( X)
标准差
(SD) 阳性数
阳性率
(%)
DID法
阳性数阳性率(%)
MCTD 38 182.1 119.2 36 94.7 28 73.7
SLE 70 55.6 99.5 21 30 11 15.7
SJS 98 30.8 72.3 19 19.4 5 5.1
PSS 58 46.5 101.6 10 17.2 3 5.2
正常
对照 180 1.08 1.12 0 0 0 0
　　以上结果表明MCTD患者的抗 RNP 抗体
阳性率最高 ,其次是 SLE患者。ELISA 法的敏
感度明显高于 DID法。
3　讨论
自身免疫性疾病(AID)是指机体产生针
对自身组织抗原成分的抗体或免疫细胞 ,并因
此引起组织损伤导致的疾病。抗可提取核抗
原(ENA)抗体是一种自身免疫性抗体 ,但 ENA
在细胞中含量极少 ,从动物脏器中大量抽提精
制 ENA 来建立 ELISA 测定法是十分困难的 。
本文所采用的 ELISA 法是利用基因重组技术
获得大量纯化抗原而建立的 ,包被的 RNP 抗
原主要包括 70K 与 A 两种组分 ,这就大大地
提高了检测的敏感度[ 2] 。通过对 264例 4种
自身免疫性疾病患者的测定结果表明 ,抗 RNP
抗体主要存在于 MCTD 患者中 ,ELISA 法阳性
率高达 94.7%,具有诊断价值。ELISA 法比以
往采用的双向扩散(DID)法更为敏感 ,大大提
高了阳性检出率 ,建议国内有关实验室尽快采
用 ELISA法来检测自身免疫性抗体。
致谢:本研究承蒙日本山形大学山口英男教授
第 10卷第 6期
2000年 12月 　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　Vol.10 ,No.6
Dec ,2000