全 文 ：收稿日期:2004 - 11 - 07;修回日期:2005- 04- 28
基金项目:国家自然科学基金(30371021)、中国科学院
“百人计划” 项目 、教育部博士学科点专项科研基金
(20040733004)
作者简介:丁路明(1977 -),男 ,博士研究生.
肯塔基草地早熟禾愈伤组织的诱导及再生体系的建立
丁路明1 , 2 ,龙瑞军1 , 3 ,王长庭1
(1. 中科院西北高原生物研究所 , 青海　西宁　810001;
2. 中国科学院研究生院 , 北京　100039;3. 甘肃农业大学草业学院 ,甘肃　兰州　730070)
　　摘要:以肯塔基草地早熟禾成熟种子为外植体 ,研究了影响愈伤组织诱导 、分化以及再生苗生
根 、移栽的主要因素 , 建立了肯塔基草地早熟禾高频再生体系。 结果表明 ,在 MS 培养基上 , 低浓度
的 BA(0. 1mg /L)配合 2 , 4 - D(3. 0 mg /L)诱导肯塔基草地早熟禾种子出愈率达到 74. 9±7. 35%;
0. 1mg /L 2 , 4 - D 在 SH 培养基上诱导愈伤组织分化成芽 , 分化率平均每块愈伤可达 8. 1±0. 36 个
芽;最适生根条件为 1 /2MS+1. 0mg / L NAA。
　　关键词:早熟禾;愈伤组织;再生体系
　　中图分类号:S688. 4　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6311(2005)03-0031-06
Callus Induction and Establishment of the Plant Regeneration System of Kentucky blue-
grass. DING Lu-ming 1 , 2 , LONG Rui-jun1 , 3 , WANG Chang-t ing1(1. Northwest Insti-
tute of P lateau Biology , X ining 810001 , China;2. Graduate School o f the Chinese
Academy of Sciences ,Bei j ing 100039;3. Department o f Grassland Sciences , Gansu
Agricul ture University , Lanzhou 730070 , China):Grassland o f China , No. 3 , 2005 ,
pp. 31 ～ 36.
Abstract:The main facto rs w hich inf luence the callus induction , different iation , ro o-
ting and transplant o f Kentucky blueg rass (Poa pratensis L. ) f rom mature seeds
we re studied. The plant regene rat ion sy stem has been established. The results
show ed that the callus inducing rat io reached 74. 9±7. 35% on the MS medium con-
taining 3. 0 mg /L 2 ,4 - D and 0. 1mg /L 6 - BA. 8. 1±0. 36 sprouts per callus could
be obtained in SH medium containing 0. 1mg /L 2 ,4 - D. The opt imum condit ion for
roo ting w as 1 /2MS+1. 0mg /L NAA.
Key words:Bluegrass;Callus;Regeneration system
　　早熟禾属植物是一年生或多年生禾本科
牧草和草坪草 ,具有兼性无融合生殖特性 ,以
地下茎生长为主 ,是世界范围广泛种植的重
要草坪草和牧草[ 1 , 2] 。草地早熟禾有一些突
出的缺点 ,如生长缓慢 、叶量少 、易感病 、不抗
虫 、耐高低温性能差 、季节变换时易变黄 、抗
—31—
第 27卷　第 3期　　　　　　　　　　　　中　国　草　地　　　　　　　　　　　　2005 年 5 月
Vo l. 27　No . 3　 　　　　　　　　　　　Grassland of China　　　　　　　　 　　　　May . 2005
旱力不强[ 3] 等 , 因此 ,需要对其进行品种改
良。通过组织培养技术建立高效早熟禾再生
体系 ,是应用生物技术手段改良和培育早熟
禾品种的前提和基础 。在组织培养过程中 ,
愈伤组织和胚状体的形成是能否培育出新植
株的关键一步。1984年 ,McDonnell和 Con-
ger从早熟禾成熟种子成功地诱导愈伤组织
并得到再生植株[ 4] 。此后 ,人们通过幼穗培
养[ 5] 、胚芽鞘[ 6] 、原生质体培养[ 7] 等方式获得
了再生植株。在基因工程育种过程中 ,不论
是用基因枪 ,还是通过农杆菌介导的转基因 ,
都需要细胞的脱分化 、再分化等过程。本试
验以肯塔基草地早熟禾成熟种子作为外植体
培养 ,诱导愈伤组织和芽 ,探索不同植物生长
调节剂对愈伤组织 、芽和根诱导的影响 ,建立
高效再生体系 ,为分化培养提供有效材料 ,并
为肯塔基草地早熟禾基因工程育种奠定基
础。
1　材料和方法
1. 1　材料
以草地早熟禾(Poa pratensis L.)品种
kentucky(引自澳大利亚)成熟种子为外植体。
1. 2　方法
1. 2. 1　种子发芽试验
选取饱满的肯塔基草地早熟禾种子置于
铺有湿润滤纸的培养皿(Υ=9cm)中 ,每皿
80 ～ 100粒 ,共 5皿。置于 25℃培养箱中 ,黑
暗培养 ,每天观察记录并保持滤纸湿润 ,2周
后统计出芽率。
1. 2. 2　愈伤组织的诱导
筛选早熟禾种子 ,去除杂质 ,用干净纱布
包住在自来水下冲洗 30min ,然后置于体积
比分数为 50%的硫酸中搅拌 30min ,自来水
下洗净。在超净工作台上 ,以 70%(体积比)
的酒精消毒 30 ～ 40s ,无菌水冲洗 3 ～ 5 次 ,
再用 0. 1%升汞溶液消毒 3 ～ 4min ,无菌水冲
洗 8 ～ 10次 , 将消毒后的种子接种于愈伤组
图 1　愈伤组织诱导 、芽的分化和组培苗移栽
F ig . 1　Callus induction , plant regenera tion and
tube-plants transfer testing
　　A为成熟种子诱导 2周后形成的愈伤组织;
B为 5周后形成的小苗;C为组培苗转移到土壤。
—32—
中国草地　2005 年　第 27卷　第 3期
织诱导培养基上 ,于 25℃黑暗培养 ,3周继代
一次 ,6周后统计愈伤组织诱导率 。
1. 2. 3　愈伤组织分化
选取淡黄色 、块状愈伤组织转接到含有
激素的分化培养基上 ,置于培养室内 ,给予
16h光照 ,光照强度 2000 ～ 3000lx ,日间温度
25℃,夜间温度 18℃,诱导分化成芽。
1. 2. 4　再生苗的生根和移栽
分化培养基上的芽长至 3叶期时 ,转移到
生根培养基上进行生根培养 ,培养条件同分化
培养。生根培养基为 1 /2MS 培养基 ,附加不
同浓度的 NAA 。当大量根出现 ,并长至 2 ～
3cm时 ,进行移栽。选取根量丰富 、生长健壮
的组培苗进行移栽。移栽前 ,在温室内打开瓶
口封口膜 ,在有菌环境下锻炼 1周 ,期间保持
温室内湿度 70%以上。将炼苗后的早熟禾幼
苗从培养基中取出 ,在 23 ～ 25℃的温水中洗
净根部的培养基 ,转入无菌沙质土壤中 ,注意
器皿的消毒 。驯化过程中 ,要逐渐降低室内的
湿度 ,使幼叶逐渐形成蜡质 ,产生表皮毛 ,降低
气孔开口度 ,逐渐恢复气孔功能 ,减少水分散
失 ,促进新根的发生 ,以适应周围环境。
2　结果与分析
2. 1　肯塔基草地早熟禾种子愈伤组织的诱导
2. 1. 1　不同培养基和 2 , 4 - D 浓度对愈伤
组织诱导的影响
发芽实验中 , 2周后统计种子发芽率为
97%。表 1列出了肯塔基草地早熟禾种子在
不同培养基 MS 和 N6 上愈伤组织诱导的结
果。接种 2周后 ,种子被诱导出畸形芽 ,并出
现乳白色愈伤组织(图 1)。试验表明肯塔基
草地早熟禾种子在含有不同浓度 2 , 4 - D的
MS 和 N6培养基中诱导愈伤组织差异明显
(P<0. 05), MS 培养基的诱导效果要好于
N6培养基。
表 1　不同浓度 2 , 4 - D和培养基对肯塔基草地早熟禾愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effect of different concentrations of 2 , 4 - D and media on callus induction of Kentucky(Poa pratensis L.)
基本培养基 2 , 4 - D(m g /L) 接种数 /个 出愈数 /块 出愈率(%) 愈伤组织状态 愈伤组织质量
MS 1. 0 89 41 46. 1±4. 81 乳白色 ,团状 +
2. 0 94 61 64. 9±15. 98 乳白色 ,团状 +
3. 0 88 56 63. 6±21. 92 浅白色 ,粒状 +++
4. 0 90 55 61. 1±9. 05 暗白色 ,块状 ++
N6 1. 0 102 26 25. 5±8. 34 乳白色 ,粘稠状 +
2. 0 126 52 41. 3±5. 79 乳白色 ,粘稠状 +
3. 0 142 49 34. 5±8. 91 乳白色 ,粘稠状 +
4. 0 153 51 32. 3±3. 11 乳白色 ,团状 +
　　注:“ +” 越多表明愈伤组织质量越好 ,下表同;基本培养基为(MS或 N6)+3%蔗糖+0. 7%琼脂 , pH=5. 8。
2. 1. 2　不同 2 , 4 - D和 6 - BA 浓度组合对
愈伤组织诱导的影响
细胞分裂素与生长素的种类对不同植物
的敏感性不同 ,因此激素种类的选择应以植
物种类而异。同一植物的不同组织在愈伤组
织诱导和芽分化过程中对激素的要求不同 ,
所要求的水平取决于其内源激素的水平 。由
表 2可以看出 , 2 , 4 - D 附加低浓度 6 - BA
可以显著提高诱导率 ,愈伤组织质量明显提
高 ,当 2 ,4 - D浓度 3. 0mg /L ,6 - BA浓度为
—33—
丁路明　龙瑞军　王长庭　肯塔基草地早熟禾愈伤组织的诱导及再生体系的建立
0. 1mg /L 时 ,出愈率达到 74. 9±7. 35%,诱
导的愈伤组织质量也最好(图 1)。2 , 4 - D
和 6 - BA 之间的交互效应对肯塔基草地早
熟禾愈伤组织诱导影响显著(P<0. 05)。
表 2　不同 2 , 4 - D和 6 - BA浓度对愈伤组织诱导的影响
Table 2　Ef fect of dif ferent concentrations combining with 2 , 4 - D and 6 - BA on callus induction
处理
激素组成(m g /L)
2 , 4 - D 6- BA
接种数 /个 出愈数 /块 出愈率(%) 愈伤组织状态 愈伤组织质量
1 1. 0 0. 1 303 197 65. 0±6. 22 乳白色 ,块状 +
2 2. 0 0. 1 239 160 66. 9±2. 69 淡黄色 ,颗粒状 +++
3 3. 0 0. 1 311 233 74. 9±7. 35 淡黄色 ,颗粒状 +++
4 1. 0 0. 2 306 204 66. 7±2. 26 淡黄色 ,块状 ++
5 2. 0 0. 2 227 108 47. 4±4. 95 淡黄色 ,块状 ++
6 3. 0 0. 2 241 141 58. 5±0. 99 淡黄色 ,颗粒状 +++
7 1. 0 0. 3 206 91 44. 3±5. 80 乳白色 ,块状 ++
8 2. 0 0. 3 271 121 44. 8±7. 21 淡黄色 ,颗粒状 +++
9 3. 0 0. 3 233 79 33. 7±2. 26 淡黄色 ,颗粒状 +++
2. 2　肯塔基草地早熟禾愈伤组织的分化
2. 2. 1　不同培养基对愈伤组织分化的影响
将诱导出的肯塔基草地早熟禾胚性愈伤
组织转移到含有 0. 1mg /L 2 ,4 - D的 MS 和
SH 培养基 , 诱导分化 。20d 继代一次 , 60d
后统计分化率(平均每块愈伤的分化芽数)。
两种培养基在诱导愈伤组织分化方面差异显
著(P <0. 05), SH 的效果好于 MS 培养基
(表 3)。
表 3　不同基本培养基对愈伤组织分化的影响
Table 3　The effect of different medium
on callus differentiation
基本培养基 接种愈伤组织数(个) 诱导出的总芽数(个) 平均分化芽数 SD(个)
SH 61 494 8. 1±0. 36a
MS 52 187 3. 6±1. 25b
　　注:基本培养基为(MS 或 SH)+3%蔗糖+0. 7%琼
脂;pH=5. 8。
2. 2. 2　不同浓度 2 , 4 - D 对愈伤组织分化
的影响
低浓度生长素可诱导芽的分化 。将肯塔
基草地早熟禾的愈伤组织转移到含有不同浓
度 2 ,4 - D的 SH 培养基中 ,诱导芽的分化 。
不同 2 , 4 - D 浓度间差异显著(P <0. 05)。
当 2 , 4 - D 浓度为 0. 1mg /L 时 , 分化率最
高 ,组培苗生长健康(图 2)。
图 2　不同 2 , 4 - D浓度对愈伤组织分化的影响
Fig . 2　The effect o f 2 , 4 - D concent ration
on callus differentia tion
—34—
中国草地　2005 年　第 27卷　第 3期
2. 2. 3　NAA 和 6 - BA 不同浓度组合对愈
伤组织诱导的影响
适宜的生长素与细胞分裂素浓度配比 ,
是诱导愈伤组织分化芽的关键 。高浓度的细
胞分裂素与低浓度的生长素配比适宜诱导芽
的分化。将肯塔基草地早熟禾的胚性愈伤组
织接入含有不同 NAA 和 6 - BA 浓度配比
的 SH 培养基 ,诱导芽的分化。表 4的结果
表明 ,低浓度的 NAA 配合高浓度的 6 - BA
可以提高愈伤组织的分化率。
2. 3　再生苗的生根 、移栽
将诱导分化的肯塔基草地早熟禾 3叶期
幼芽转移到含有不同浓度 NAA 的诱导生根
培养基 1 /2 M S 上 ,每 15d继代一次 , 30d后
统计结果如图 3 所示 。当 NAA 浓度为
1. 0mg /L 时 ,生根率达到 74. 9%,诱导出的
根健壮 、数量多 ,不同浓度间诱导效果差异显
著(P <0. 05)。
　　选择生长健壮 、根量多的组培苗进行移
栽 ,移栽成活率达到 97%。
图 3　不同 NAA 浓度对幼苗生根的影响
Fig. 3　The effect of different NAA concentra tions
on roo ting f requence
3　讨论
早熟禾是一种重要的牧草和草坪草 ,具
有无融合生殖特性 ,进行组织培养比较困难 ,
关于早熟禾组织培养的报道也比较少。禾本
科植物和豆科植物相比 ,进行组织培养要困
难的多[ 8] 。植物组织培养过程中常加入植物
表 4　不同 NAA 和 6 - BA浓度配比对愈伤组织分化的影响
Table 4　The effect of different combination of NAA and 6 - BA on callus differentiation
培养基序号 植物激素(mg / L)
NAA 6 - BA
接种愈伤组织数(个) 诱导出的总芽数(个) 平均分化芽数 SD(个)
C3 0. 3 2 59 283 4. 8±0. 44a
C6 0. 4 3 52 236 4. 5±0. 44ab
C2 0. 5 2 35 152 4. 3±0. 89b
C4 0. 2 1 48 158 3. 3±0. 36 c
C5 0. 4 1 45 117 2. 6±0. 62d
C7 0 2 40 92 2. 3±0. 66d
C1 0 0 42 12 0. 3±0. 20e
C8 0. 5 0 37 7 0. 2±0. 20e
生长素诱导愈伤组织。2 , 4 - D作为一种常
用植物生长素 ,在愈伤组织诱导中发挥着非
常重要的作用。本实验中 ,单独使用 2 , 4 -
D ,肯塔基草地早熟禾愈伤组织诱导率低下 。
这与马忠华等人报道的实验结果相差甚
大[ 3] ,可能由于不同基因型的原因。2 , 4 - D
—35—
丁路明　龙瑞军　王长庭　肯塔基草地早熟禾愈伤组织的诱导及再生体系的建立
配合低浓度的 6 - BA 可以显著提高肯塔基
草地早熟禾愈伤组织的诱导率和质量。
Vande r Valk 等人(1989)的研究报道也表明
在培养基中添加 BA 可以提高草地早熟禾的
愈伤组织诱导率[ 9] 。这可能是草地早熟禾中
含有内源细胞分裂素的原因[ 10] 。有研究表
明 ,早熟禾幼穗比成熟种子诱导愈伤组织效
果要好[ 9 , 11] ,但是 ,幼穗的获取受季节限制比
较大 ,成熟种子就避免了这一缺点 。
肯塔基草地早熟禾愈伤组织的分化实验
表明 ,不同培养基诱导分化的效果差异明显 ,
SH 培养基比较适合于愈伤组织的分化。这
可能由于 SH 培养基含N 量高于MS培养基
的缘故。本实验表明 , 0. 1mg /L 2 , 4 - D 是
诱导肯塔基草地早熟禾愈伤组织分化的最佳
浓度 。NAA 和 BA 配合使用没有单独使用
2 ,4 - D诱导分化效果好 。肯塔基草地早熟
禾分化芽的诱导生根相对容易些 , 含有
1. 0mg /L 2 ,4 - D 的 1 /2M S 培养基 , 20d左
右就诱导分化芽产生大量毛状根。组培苗的
移栽也比较成功 ,成活率达到 97%,可用作
肯塔基草地早熟禾转基因育种研究 。
参考文献:
[ 1 ] 　Bsshaw E C. Apomict ic grasses[ A ] . Fehr W R.
Principles of cul tivar development[ C] . New Yo rk:
Macmillan Publishing , 1987. 2:40-82.
[ 2 ] 　Kirs ten Annet te Niel sen , Elisabeth Knudsen. Re-
generation of g reen plan ts f rom embryogenic sus-
pension cul tu res of Kentu cky Bluegrass (Poa pra t-
ensis L. )[ J] . J . Plant Physiol. , 1993 , 141:589-
595.
[ 3 ] 　M a Zh - H(马忠华), Zhang Y - F(张云芳), Xu Ch
- X(徐传祥), et al. Tissu e culture and genetic
t ransformation of Kentuck y b lueg ras s (Poa praten-
sis L.) via microprojecti le b om bardm en t[ J] . J ou r-
nal of Fudan Universi ty (Natural Science) (复旦学
报自然版), 1999 , 38(5):540-544.
[ 4 ] 　M cDonnell R E , Conger B V. Callus induct ion and
plan tlet format ion f rom mature em bryo explants of
Kentucky Blueg rass [ J] . Crop S cience , 1984 , 24:
573-577.
[ 5 ] 　Zhu G - F(朱根发), Yu Y - J(余毓君). S tu dies of
tis sue cu lturecondit ion and dif feren tiat ion abili ty of
Poa pratensis L[ J] . Journal of Hu azh ong Agricul-
tu re Universi ty (华中农业大学学报), 1994 , 13(2):
199-203.
[ 6 ] 　KeShangqiang , C hiw on W L. Plan t regeneration in
Kentucky blueg rass (Poa pratensi s L.) via coleop-
t ile tis sue cu lture[ J] . Plan t Cel l Rep ort , 1996 ,
(15):882-887.
[ 7 ] 　Kirsten Annet te Niels en , Eise Larsen , Elisabeth
Knudsen. Regenerat ion of protoplast derived g reen
plan ts of Kentucky blueg rass (Poa P ratensis L.)
[ J] . Plant C ell Report , 1993 , (12):537-540.
[ 8 ] 　Xu Z - Q(徐子勤). Transgenic researches of im por-
tant cereal species[ J] . Biological Advances (生物工
程进展), 2001 , 21(1):59-74.
[ 9 ] 　van der Valk P , Zaal M A C M , Creemers - Mo-
lenaar J. Somatic emb ry ogenesis and plant regener-
ation in inf lorescence and seed derived callu s of Poa
pra tensi s L. (Ken tucky b luegras s)[ J] . Plant Cel l
Rep orts , 1989 , 7:644-647.
[ 10] 　Bhaskaran S , Smith R H. Regenerat ion in cereal
t is sue cul tu re:A review [ J] . C rop Sci. , 1990 , 30:
1328-1336.
[ 11] 　M cDonnell R E , Conger B V. Callus induct ion and
plan tlet format ion f rom mature em bryo explants of
Kentucky Bluegrass[ J] . Crop S ci. , 1984 , 24:573-
577.
—36—
中国草地　2005 年　第 27卷　第 3期