全 文 ：二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A的分析
陈燕 ,黄志芳 ,刘玉红 ,刘云华 ,刘倩伶 ,易进海＊
(四川省中医药科学院 , 成都 610041)
摘要 目的:对二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A进行定性 、定量分析。 方法:采用 TLC和 HPLC检测二十五味绿绒蒿丸中的
马兜铃酸 A。TLC色谱条件:硅胶 G薄层板(10 cm×20cm), 甲苯 -乙酸乙酯 -水 -甲酸(20∶10∶1∶1)的上层溶液为展开剂 ,
展距 12cm,紫外光灯(365 nm)下检视;HPLC色谱条件:采用 PhenomenexLunaC18(2)(4.6 mm×150 mm, 5 μm)色谱柱 , 以
0.05 mol· L-1磷酸二氢钠溶液(含磷酸 1 mL· L-1)-乙腈(62∶38)为流动相 , 流速 1 mL· min-1 ,检测波长 315 nm, 柱温 35
℃。结果:采用 TLC和 HPLC均能检出 5批二十五味绿绒蒿丸中的马兜铃酸 A;样品色谱中 ,在与对照品色谱相应的位置上 ,
显相同颜色的斑点。马兜铃酸 A的 HPLC色谱峰与其他色谱峰分离良好 , 进样量在 0.10 ～ 0.61 μg范围内呈良好线性关系(r
=0.9997),平均加样回收率(n=9)为 96.20%。结论:TLC色谱斑点清晰 , 阴性对照无干扰;HPLC法专属性强 , 重复性好 ,准
确 、灵敏 ,能快速有效地检测二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A的含量 , 并为相关藏成药中马兜铃酸 A的分析提供参考。
关键词:二十五味绿绒蒿丸;马兜铃酸 A;薄层色谱鉴别;高效液相色谱法
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)09-1458-04
AnalysisofaristolochicacidAinErshiwuweiLuronghaopils
CHENYan, HUANGZhi-fang, LIUYu-hong, LIUYun-hua, LIUQian-ling, YIJin-hai＊
(SichuanAcademyofChineseMedicineSciences, Chengdu610041, China)
Abstract Objective:ToestablishtheTLCidentificationandHPLCdeterminationmethodsofaristolochicacidAin
ErshiwuweiLuronghaopils.Methods:TLCandHPLCwereadoptedtoidentifyanddeterminearistolochicacidAin
thepils.TLC:UsingsilicagelGmixedwithsodiumcarboxymethylceluloseasthecoatingsubstanceandtoluene-
acetoacetate-water-formicacid(20∶10∶1∶1)upperpartsolutionasthemobilephase.Afterdevelopingabout12
cmfromthebaseline, removaloftheplate, dryinairandexamineunderultravioletlight(365nm).HPLCcondi-
tions:UsingPhenomenexLunaC18(2)(4.6 mm×150mm, 5μm)columnasanalyticcolumnand0.05 mol·L-1
sodiumdihydrogenphosphate(containing1 mL·L-1phosphoricacid)-acetonitrile(62∶38)asthemobilephase,
flowrateat1.0 mL· min-1;Asdetectorspectrophotometersetat315 nm, columntemperatureat35 ℃.Results:
AristolochicacidAcouldbeexaminedbyTLCanddeterminedbyHPLC.Thedarkspotinchromatogramobtained
withthetestsolutioncorrespondsinpositionandcolourtothespotinchromatogramobtainedwiththereferenceso-
lution.ThelinearrangeofaristolochicacidAwas0.10-0.61 μg(r=0.9997), theaveragerecovery(n=9)was
96.20%.Conclusion:ThespotontheTLCplatewereclearly, andthenegativecontrastwasnotdisturbed;The
methodsissimple, accurateandcanbeusedforthequalitycontrolofErshiwuweiLuronghaopils.
Keywords:ErshiwuweiLuronghaopils;aristolochicacidA;TLCidentification;HPLC
二十五味绿绒蒿丸是由绿绒蒿 、天竺黄 、丁香 、
木香马兜铃等 25味藏药材组成的复方制剂 ,具有解
毒 、清肝热的功效 ,用于中毒及肝热 、肝肿大 、肝硬
化 、肝胃淤血疼痛等新旧肝病 ,收载于 《中华人民共
和国卫生部药品标准 ·藏药 》第一册成方制剂
中[ 1] ,为藏药保护品种。本品中木香马兜铃含有毒
性成分马兜铃酸 ,目前尚未见二十五味绿绒蒿丸中
马兜铃酸的含量测定或限量检测的文献报道 ,为了
保证本品的安全性 ,本文对二十五味绿绒蒿丸中马
兜铃酸 A进行了定性 、定量的研究 ,建立了该制剂
—1458— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)
＊ 通讯作者　Tel:(028)85210843;E-mail:yijinhai@yahoo.com.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2009.09.006
中马兜铃酸 A的 TLC鉴别及 HPLC含量测定方法 ,
明确其中马兜铃酸 A的含量 ,为其质量控制和临床
应用提供参考。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪包括 Waters1525泵 、
2487双通道紫外检测器 、Waters柱温箱 、Breeze液
相色谱工作站。 Brasson超声清洗仪;LD5-2A离心
机 (北京医用离心机厂), CAMAGREPROSTAR3/
Transiluminator(瑞士)。硅胶 G薄层板(10 cm×20
cm)为自制。马兜铃酸 A对照品(含量测定用 ,中国
药品生物制品检定所 ,批号 0746-200204);二十五
味绿绒蒿丸 5批(市售 ,规格 0.5g·丸 -1)。阴性样
品为自制(取除木香马兜铃外的其他药味按相同处
方和制法制成二十五味绿绒蒿丸阴性样品),甲醇
为美国 Tedia色谱纯 ,水为超纯水 ,硅胶 G由青岛海
洋化工厂生产 ,其他试剂均为分析纯 。
2 薄层色谱鉴别
2.1　供试品溶液和阴性样品溶液的制备 取本品
10丸 ,研细(过 4号筛),取约 3 g,加石油醚(60 ～ 90
℃)20 mL,密塞 ,超声处理(300 W, 40 kHz)10 min,
弃去石油醚 。残渣挥干溶剂 ,加氯仿 20 mL与稀盐
酸 1 mL,密塞 ,超声处理(300 W, 40 kHz)20min,滤
过 ,滤液蒸干 ,残渣加甲醇 1mL使溶解 ,即得供试品
溶液。同法制备阴性样品溶液 。
2.2　对照品溶液的制备 取马兜铃酸 A对照品适
量 ,精密称定 ,加甲醇制成每 1 mL含 0.5 mg的溶
液 ,即得对照品溶液。
2.3　薄层色谱分析 [ 2] 吸取上述 3种溶液各 10
μL,分别点于同一以 0.5%羧甲基纤维素钠为黏合
剂的硅胶 G薄层板(10 cm×20 cm)上 ,使成条状 ,
以甲苯 -乙酸乙酯 -水 -甲酸(20∶10∶1∶1)的上层
溶液为展开剂 ,展开 ,展距 12 cm,取出 ,晾干 ,置紫
外光灯(365 nm)下检视。样品色谱中 ,在与对照品
色谱相应的位置上 ,显相同颜色的斑点。阴性样品
在相应的色谱位置上无干扰。结果见图 1。
3　马兜铃酸 A的含量测定
3.1　色谱条件 　PhenomenexLunaC18 (2)分析柱
(4.6 mm×150 mm, 5 μm);柱温 35 ℃;流动相:
0.05mol· L-1磷酸二氢钠溶液 (含磷酸 1 mL·
L-1)-乙腈(62∶38);流速 1 mL· min-1;检测波长
315nm;进样量为 10 μL。理论板数按马兜铃酸 A
峰计算大于 2500。
3.2　对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸 A对
照品 10.16 mg,置 50 mL量瓶中 , 加甲醇溶解并
图 1　二十五味绿绒蒿丸的薄层色谱图
Fig1　TLCchromatogramofaristolochicacidAinErshiwuweiluronghao
pils
1.缺木香马兜铃的阴性样品 (negativesamplewithoutAristolochia
moupinensis)　2 ～ 6.样品(sample)　 7.马兜铃酸 A对照品(aristolo-
chicacidAreferencesubstance)
稀释至刻度 ,制成每 1 mL含 0.2032 mg的溶液 ,摇
匀 ,即得对照品储备液;精密量取对照品储备液
2.5 mL,置 10 mL量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇
匀 ,制成 0.0508mg·mL-1的马兜铃酸 A对照品溶
液。
3.3　供试品溶液的制备 取样品 10丸 ,研细(过 4
号筛),取约 4 g,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加甲
醇 100 mL,加热回流提取 4h,取甲醇提取液 ,挥干 ,
残渣加 5%氨水 20 mL分次溶解并转移至离心管
中 ,离心(4000 r· min-1)20 min,倾出上清液 ,移置
分液漏斗中 ,残渣再加 5%氨水 10 mL分次洗涤 ,离
心(4000r·min-1)20min,上清液并入分液漏斗中。
用氯仿提取 3次 ,每次 10 mL,轻轻振摇 ,弃去氯仿
层。氨液加 6mol·L-1盐酸溶液调节至 pH1,用氯
仿提取 4次 ,每次 20mL,合并氯仿液 ,氯仿液用含 6
mol·L-1盐酸溶液 0.1mL的水 25mL振摇洗涤 ,弃
去水层 ,氯仿液蒸干 ,残渣加甲醇溶解并稀释至 10
mL,摇匀 ,即得供试品溶液 。同法制备阴性样品溶
液。
3.4　线性关系考察 分别精密吸取 “ 3.2”项下的
对照品溶液(0.0508 mg· mL-1)2.0, 4.0, 6.0, 8.0,
10.0, 12.0 μL,注入液相色谱仪中测定。结果马兜
铃酸 A进样量在 0.10 ～ 0.61μg范围内与峰面积值
呈良好的线性关系 ,以进样量(μg)为横坐标 ,峰面
积为纵坐标作回归曲线 ,回归方程为:
Y=1.962×106X+3.165×103 r=0.9997
3.5　系统适用性试验 取对照品溶液 、供试品溶液
和阴性样品溶液各 10 μL,按上述色谱条件进样测
—1459—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)
定 ,记录色谱图。结果表明 ,供试品溶液色谱图中出
现与对照品溶液色谱图中相同保留时间的马兜铃酸
A色谱峰 ,并与相邻杂质峰达到基线分离 ,样品中其
他成分对马兜铃酸 A的测定无干扰 ,结果见图 2。
图 2　对照品(A)、样品(B)、阴性样品(C)的 HPLC图
Fig2　HPLCchromatogramsofreferencesubstance(A), sample(B)and
negativesample(C)
1.马兜铃酸 A(aristolochicacidA)
3.6　精密度试验 精密吸取对照品溶液 10 μL,重
复进样 6次 , 测定峰面积 , 计算 RSD(n=6)为
0.94%。
3.7　重复性试验 取样品(批号 060212)中粉 4 g,
精密称定 5份 ,照 “3.3”项下方法分别制成供试品
溶液 ,依法测定 ,结果样品中马兜铃酸 A的平均含
量(n=5)为 0.204 mg· g-1 , RSD为 1.2%。
3.8　稳定性试验　制备同一样品(批号 060212)的
供试品溶液 ,室温放置 0, 2, 4, 6, 8, 24 h,依法测定 ,
记录色谱峰面积 ,计算 RSD(n=6)为 1.0%,表明供
试品溶液在 24 h内稳定。
3.9　加样回收率试验　取已知马兜铃酸 A含量的
样品(批号 060212, 0.204 mg· g-1)2 g,精密称定 ,
共 9份 ,平均分为 3组 ,依次加入相当于样品中马兜
铃酸 A含量的 80%, 100%, 120%的对照品 , 照
“3.3”项下方法制成所需溶液。依法测定 ,计算回
收率 。结果低 、中 、高 3种浓度的回收率 (n=3)分
别为 95.73% (RSD=1.2%), 96.24% (RSD=
1.1%), 96.62%(RSD=1.1%);平均回收率 (n=
9)为 96.20%。
3.10　样品测定　取不同批号的样品各 3份 , 照
“3.3”项下方法制成供试品溶液 ,依法测定 ,采用外
标二点法计算样品中马兜铃酸 A含量 ,结果见表 1。
表 1 样品测定结果(n=3)
Tab1　Resultsofsampledetermination
批号(LotNo.) 平均含量(averagecontent)/mgperpil RSD/%
060212 0.102 1.1
060227 0.114 1.0
060305 0.110 1.2
061011 0.099 1.1
061020 0.101 1.1
4　讨论
4.1　曾采用中国药典 2005年版一部马兜铃项下的
TLC试验条件[ 2] ,因阴性样品干扰大 ,无法检出二十
五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A,需针对性地提取 、净
化。本文先用石油醚脱脂 ,后用带酸的有机溶剂提
取样品 ,可排除极性小的脂溶性成分和其他碱性杂
质的干扰 ,即可检出本品中的马兜铃酸 A,而阴性样
品无干扰 。
4.2　本品药味较多 ,曾将丙酮(含 10%甲酸)或甲
醇超声提取 、甲醇索氏提取所得提取液直接进样分
析[ 3 ～ 5] ,结果供试品溶液中杂质峰较多 ,无法检测主
峰。而采用甲醇索氏提取 ,酸 、碱处理 ,有机溶剂萃
取所得供试品溶液 ,杂质峰明显减少 ,主峰对称稳
定 ,检测结果可靠。
4.3　曾对样品提取时间 2, 4, 6 h进行考察 ,结果表
明提取 4 h与 6h含量差异不大 ,故选择提取时间 4
h。
4.4　曾试用乙腈 -2%醋酸(40∶60)、甲醇 -水 -
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冰醋酸(68∶32∶1)[ 6]等流动相 ,前者分离度差 ,后者
阴性样品对主峰干扰大 ,改用本法采用的流动相后 ,
明显改善了马兜铃酸 A的分离度 ,提高了定量结果
的准确性。本方法特别适用于药味多 ,干扰大的复
方制剂中马兜铃酸 A的含量测定 。
4.5　二十五味绿绒蒿丸收载于 《中华人民共和国
卫生部药品标准 ·藏药 》第一册 ,为藏药保护品种 ,
是藏区治疗肝病的常用药物 ,且疗程长 ,为了避免马
兜铃酸肾损害的风险 ,建议在使用含木香马兜铃药
材的复方藏药制剂时应严格控制剂量和疗程 ,明确
肾脏病患者 、孕妇 、新生儿禁用 ,儿童及老人一般不
宜使用 ,长期使用者须定期复查肾功能。
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及制剂中马兜铃酸 A的含量).ChinJPharmAnal(药物分析杂
志), 2003, 23(3):215
(本文于 2008月 10月 7日收到)
《药物残留溶剂分析 》一书出版
　　胡昌勤　编著　978-7-122-03619-3　16开精装　45.00元　2009-01出版
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法的沿革;较系统地介绍了顶空气相色谱法的原理及其在残留溶剂分析中的应用现状;重点探讨了在药
品生产工艺复杂的情况下 ,如何实现对药品中的残留溶剂进行准确定性问题 ,以及残留溶剂分析中的快
速定量问题;总结了药品残留溶剂测定中的各类常见问题 ,并提出解决方案;介绍了如何利用计算机辅
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(摘自化学工业出版社)
—1461—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)