全 文 :二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A的分析
陈燕 ,黄志芳 ,刘玉红 ,刘云华 ,刘倩伶 ,易进海*
(四川省中医药科学院 , 成都 610041)
摘要 目的:对二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A进行定性 、定量分析。 方法:采用 TLC和 HPLC检测二十五味绿绒蒿丸中的
马兜铃酸 A。TLC色谱条件:硅胶 G薄层板(10 cm×20cm), 甲苯 -乙酸乙酯 -水 -甲酸(20∶10∶1∶1)的上层溶液为展开剂 ,
展距 12cm,紫外光灯(365 nm)下检视;HPLC色谱条件:采用 PhenomenexLunaC18(2)(4.6 mm×150 mm, 5 μm)色谱柱 , 以
0.05 mol· L-1磷酸二氢钠溶液(含磷酸 1 mL· L-1)-乙腈(62∶38)为流动相 , 流速 1 mL· min-1 ,检测波长 315 nm, 柱温 35
℃。结果:采用 TLC和 HPLC均能检出 5批二十五味绿绒蒿丸中的马兜铃酸 A;样品色谱中 ,在与对照品色谱相应的位置上 ,
显相同颜色的斑点。马兜铃酸 A的 HPLC色谱峰与其他色谱峰分离良好 , 进样量在 0.10 ~ 0.61 μg范围内呈良好线性关系(r
=0.9997),平均加样回收率(n=9)为 96.20%。结论:TLC色谱斑点清晰 , 阴性对照无干扰;HPLC法专属性强 , 重复性好 ,准
确 、灵敏 ,能快速有效地检测二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A的含量 , 并为相关藏成药中马兜铃酸 A的分析提供参考。
关键词:二十五味绿绒蒿丸;马兜铃酸 A;薄层色谱鉴别;高效液相色谱法
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)09-1458-04
AnalysisofaristolochicacidAinErshiwuweiLuronghaopils
CHENYan, HUANGZhi-fang, LIUYu-hong, LIUYun-hua, LIUQian-ling, YIJin-hai*
(SichuanAcademyofChineseMedicineSciences, Chengdu610041, China)
Abstract Objective:ToestablishtheTLCidentificationandHPLCdeterminationmethodsofaristolochicacidAin
ErshiwuweiLuronghaopils.Methods:TLCandHPLCwereadoptedtoidentifyanddeterminearistolochicacidAin
thepils.TLC:UsingsilicagelGmixedwithsodiumcarboxymethylceluloseasthecoatingsubstanceandtoluene-
acetoacetate-water-formicacid(20∶10∶1∶1)upperpartsolutionasthemobilephase.Afterdevelopingabout12
cmfromthebaseline, removaloftheplate, dryinairandexamineunderultravioletlight(365nm).HPLCcondi-
tions:UsingPhenomenexLunaC18(2)(4.6 mm×150mm, 5μm)columnasanalyticcolumnand0.05 mol·L-1
sodiumdihydrogenphosphate(containing1 mL·L-1phosphoricacid)-acetonitrile(62∶38)asthemobilephase,
flowrateat1.0 mL· min-1;Asdetectorspectrophotometersetat315 nm, columntemperatureat35 ℃.Results:
AristolochicacidAcouldbeexaminedbyTLCanddeterminedbyHPLC.Thedarkspotinchromatogramobtained
withthetestsolutioncorrespondsinpositionandcolourtothespotinchromatogramobtainedwiththereferenceso-
lution.ThelinearrangeofaristolochicacidAwas0.10-0.61 μg(r=0.9997), theaveragerecovery(n=9)was
96.20%.Conclusion:ThespotontheTLCplatewereclearly, andthenegativecontrastwasnotdisturbed;The
methodsissimple, accurateandcanbeusedforthequalitycontrolofErshiwuweiLuronghaopils.
Keywords:ErshiwuweiLuronghaopils;aristolochicacidA;TLCidentification;HPLC
二十五味绿绒蒿丸是由绿绒蒿 、天竺黄 、丁香 、
木香马兜铃等 25味藏药材组成的复方制剂 ,具有解
毒 、清肝热的功效 ,用于中毒及肝热 、肝肿大 、肝硬
化 、肝胃淤血疼痛等新旧肝病 ,收载于 《中华人民共
和国卫生部药品标准 ·藏药 》第一册成方制剂
中[ 1] ,为藏药保护品种。本品中木香马兜铃含有毒
性成分马兜铃酸 ,目前尚未见二十五味绿绒蒿丸中
马兜铃酸的含量测定或限量检测的文献报道 ,为了
保证本品的安全性 ,本文对二十五味绿绒蒿丸中马
兜铃酸 A进行了定性 、定量的研究 ,建立了该制剂
—1458— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)
* 通讯作者 Tel:(028)85210843;E-mail:yijinhai@yahoo.com.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2009.09.006
中马兜铃酸 A的 TLC鉴别及 HPLC含量测定方法 ,
明确其中马兜铃酸 A的含量 ,为其质量控制和临床
应用提供参考。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪包括 Waters1525泵 、
2487双通道紫外检测器 、Waters柱温箱 、Breeze液
相色谱工作站。 Brasson超声清洗仪;LD5-2A离心
机 (北京医用离心机厂), CAMAGREPROSTAR3/
Transiluminator(瑞士)。硅胶 G薄层板(10 cm×20
cm)为自制。马兜铃酸 A对照品(含量测定用 ,中国
药品生物制品检定所 ,批号 0746-200204);二十五
味绿绒蒿丸 5批(市售 ,规格 0.5g·丸 -1)。阴性样
品为自制(取除木香马兜铃外的其他药味按相同处
方和制法制成二十五味绿绒蒿丸阴性样品),甲醇
为美国 Tedia色谱纯 ,水为超纯水 ,硅胶 G由青岛海
洋化工厂生产 ,其他试剂均为分析纯 。
2 薄层色谱鉴别
2.1 供试品溶液和阴性样品溶液的制备 取本品
10丸 ,研细(过 4号筛),取约 3 g,加石油醚(60 ~ 90
℃)20 mL,密塞 ,超声处理(300 W, 40 kHz)10 min,
弃去石油醚 。残渣挥干溶剂 ,加氯仿 20 mL与稀盐
酸 1 mL,密塞 ,超声处理(300 W, 40 kHz)20min,滤
过 ,滤液蒸干 ,残渣加甲醇 1mL使溶解 ,即得供试品
溶液。同法制备阴性样品溶液 。
2.2 对照品溶液的制备 取马兜铃酸 A对照品适
量 ,精密称定 ,加甲醇制成每 1 mL含 0.5 mg的溶
液 ,即得对照品溶液。
2.3 薄层色谱分析 [ 2] 吸取上述 3种溶液各 10
μL,分别点于同一以 0.5%羧甲基纤维素钠为黏合
剂的硅胶 G薄层板(10 cm×20 cm)上 ,使成条状 ,
以甲苯 -乙酸乙酯 -水 -甲酸(20∶10∶1∶1)的上层
溶液为展开剂 ,展开 ,展距 12 cm,取出 ,晾干 ,置紫
外光灯(365 nm)下检视。样品色谱中 ,在与对照品
色谱相应的位置上 ,显相同颜色的斑点。阴性样品
在相应的色谱位置上无干扰。结果见图 1。
3 马兜铃酸 A的含量测定
3.1 色谱条件 PhenomenexLunaC18 (2)分析柱
(4.6 mm×150 mm, 5 μm);柱温 35 ℃;流动相:
0.05mol· L-1磷酸二氢钠溶液 (含磷酸 1 mL·
L-1)-乙腈(62∶38);流速 1 mL· min-1;检测波长
315nm;进样量为 10 μL。理论板数按马兜铃酸 A
峰计算大于 2500。
3.2 对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸 A对
照品 10.16 mg,置 50 mL量瓶中 , 加甲醇溶解并
图 1 二十五味绿绒蒿丸的薄层色谱图
Fig1 TLCchromatogramofaristolochicacidAinErshiwuweiluronghao
pils
1.缺木香马兜铃的阴性样品 (negativesamplewithoutAristolochia
moupinensis) 2 ~ 6.样品(sample) 7.马兜铃酸 A对照品(aristolo-
chicacidAreferencesubstance)
稀释至刻度 ,制成每 1 mL含 0.2032 mg的溶液 ,摇
匀 ,即得对照品储备液;精密量取对照品储备液
2.5 mL,置 10 mL量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇
匀 ,制成 0.0508mg·mL-1的马兜铃酸 A对照品溶
液。
3.3 供试品溶液的制备 取样品 10丸 ,研细(过 4
号筛),取约 4 g,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加甲
醇 100 mL,加热回流提取 4h,取甲醇提取液 ,挥干 ,
残渣加 5%氨水 20 mL分次溶解并转移至离心管
中 ,离心(4000 r· min-1)20 min,倾出上清液 ,移置
分液漏斗中 ,残渣再加 5%氨水 10 mL分次洗涤 ,离
心(4000r·min-1)20min,上清液并入分液漏斗中。
用氯仿提取 3次 ,每次 10 mL,轻轻振摇 ,弃去氯仿
层。氨液加 6mol·L-1盐酸溶液调节至 pH1,用氯
仿提取 4次 ,每次 20mL,合并氯仿液 ,氯仿液用含 6
mol·L-1盐酸溶液 0.1mL的水 25mL振摇洗涤 ,弃
去水层 ,氯仿液蒸干 ,残渣加甲醇溶解并稀释至 10
mL,摇匀 ,即得供试品溶液 。同法制备阴性样品溶
液。
3.4 线性关系考察 分别精密吸取 “ 3.2”项下的
对照品溶液(0.0508 mg· mL-1)2.0, 4.0, 6.0, 8.0,
10.0, 12.0 μL,注入液相色谱仪中测定。结果马兜
铃酸 A进样量在 0.10 ~ 0.61μg范围内与峰面积值
呈良好的线性关系 ,以进样量(μg)为横坐标 ,峰面
积为纵坐标作回归曲线 ,回归方程为:
Y=1.962×106X+3.165×103 r=0.9997
3.5 系统适用性试验 取对照品溶液 、供试品溶液
和阴性样品溶液各 10 μL,按上述色谱条件进样测
—1459—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)
定 ,记录色谱图。结果表明 ,供试品溶液色谱图中出
现与对照品溶液色谱图中相同保留时间的马兜铃酸
A色谱峰 ,并与相邻杂质峰达到基线分离 ,样品中其
他成分对马兜铃酸 A的测定无干扰 ,结果见图 2。
图 2 对照品(A)、样品(B)、阴性样品(C)的 HPLC图
Fig2 HPLCchromatogramsofreferencesubstance(A), sample(B)and
negativesample(C)
1.马兜铃酸 A(aristolochicacidA)
3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液 10 μL,重
复进样 6次 , 测定峰面积 , 计算 RSD(n=6)为
0.94%。
3.7 重复性试验 取样品(批号 060212)中粉 4 g,
精密称定 5份 ,照 “3.3”项下方法分别制成供试品
溶液 ,依法测定 ,结果样品中马兜铃酸 A的平均含
量(n=5)为 0.204 mg· g-1 , RSD为 1.2%。
3.8 稳定性试验 制备同一样品(批号 060212)的
供试品溶液 ,室温放置 0, 2, 4, 6, 8, 24 h,依法测定 ,
记录色谱峰面积 ,计算 RSD(n=6)为 1.0%,表明供
试品溶液在 24 h内稳定。
3.9 加样回收率试验 取已知马兜铃酸 A含量的
样品(批号 060212, 0.204 mg· g-1)2 g,精密称定 ,
共 9份 ,平均分为 3组 ,依次加入相当于样品中马兜
铃酸 A含量的 80%, 100%, 120%的对照品 , 照
“3.3”项下方法制成所需溶液。依法测定 ,计算回
收率 。结果低 、中 、高 3种浓度的回收率 (n=3)分
别为 95.73% (RSD=1.2%), 96.24% (RSD=
1.1%), 96.62%(RSD=1.1%);平均回收率 (n=
9)为 96.20%。
3.10 样品测定 取不同批号的样品各 3份 , 照
“3.3”项下方法制成供试品溶液 ,依法测定 ,采用外
标二点法计算样品中马兜铃酸 A含量 ,结果见表 1。
表 1 样品测定结果(n=3)
Tab1 Resultsofsampledetermination
批号(LotNo.) 平均含量(averagecontent)/mgperpil RSD/%
060212 0.102 1.1
060227 0.114 1.0
060305 0.110 1.2
061011 0.099 1.1
061020 0.101 1.1
4 讨论
4.1 曾采用中国药典 2005年版一部马兜铃项下的
TLC试验条件[ 2] ,因阴性样品干扰大 ,无法检出二十
五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A,需针对性地提取 、净
化。本文先用石油醚脱脂 ,后用带酸的有机溶剂提
取样品 ,可排除极性小的脂溶性成分和其他碱性杂
质的干扰 ,即可检出本品中的马兜铃酸 A,而阴性样
品无干扰 。
4.2 本品药味较多 ,曾将丙酮(含 10%甲酸)或甲
醇超声提取 、甲醇索氏提取所得提取液直接进样分
析[ 3 ~ 5] ,结果供试品溶液中杂质峰较多 ,无法检测主
峰。而采用甲醇索氏提取 ,酸 、碱处理 ,有机溶剂萃
取所得供试品溶液 ,杂质峰明显减少 ,主峰对称稳
定 ,检测结果可靠。
4.3 曾对样品提取时间 2, 4, 6 h进行考察 ,结果表
明提取 4 h与 6h含量差异不大 ,故选择提取时间 4
h。
4.4 曾试用乙腈 -2%醋酸(40∶60)、甲醇 -水 -
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冰醋酸(68∶32∶1)[ 6]等流动相 ,前者分离度差 ,后者
阴性样品对主峰干扰大 ,改用本法采用的流动相后 ,
明显改善了马兜铃酸 A的分离度 ,提高了定量结果
的准确性。本方法特别适用于药味多 ,干扰大的复
方制剂中马兜铃酸 A的含量测定 。
4.5 二十五味绿绒蒿丸收载于 《中华人民共和国
卫生部药品标准 ·藏药 》第一册 ,为藏药保护品种 ,
是藏区治疗肝病的常用药物 ,且疗程长 ,为了避免马
兜铃酸肾损害的风险 ,建议在使用含木香马兜铃药
材的复方藏药制剂时应严格控制剂量和疗程 ,明确
肾脏病患者 、孕妇 、新生儿禁用 ,儿童及老人一般不
宜使用 ,长期使用者须定期复查肾功能。
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及制剂中马兜铃酸 A的含量).ChinJPharmAnal(药物分析杂
志), 2003, 23(3):215
(本文于 2008月 10月 7日收到)
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速定量问题;总结了药品残留溶剂测定中的各类常见问题 ,并提出解决方案;介绍了如何利用计算机辅
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(摘自化学工业出版社)
—1461—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(9)