全 文 ：范树国 ,江　明 ,邱　璐 ,等.激素和蔗糖浓度对蝴蝶兰愈伤组织诱导的影响 [ J] .江苏农业科学, 2010(3):61-63.
激素和蔗糖浓度对蝴蝶兰愈伤组织诱导的影响
范树国 1, 2 , 江　明 1 , 邱　璐 1, 2 , 李国树1, 2 , 李天星1 , 杨海艳 1 , 张其斌 1
(1.楚雄师范学院化学与生命科学系 ,云南楚雄 675000;2.滇中高原生物资源开发与利用研究所 ,云南楚雄 675000)
　　摘要:以蝴蝶兰杂交种 P.firedance“SFIL” f006(1294)为试验材料 ,探讨在 MS培养基中 NAA、6-BA、蔗糖 3种
因素对蝴蝶兰根切段及叶片切段愈伤组织诱导的影响。结果表明:(1)当培养基中添加 NAA0.1 mg/L+6 -BA
0.3 mg/L+蔗糖 10 g/L时 ,根切段诱导率最高 , 达 20%;(2)叶片切段不适宜诱导愈伤组织。
　　关键词:蝴蝶兰;愈伤组织;根;叶片;激素;蔗糖
　　中图分类号:S682.310.4+3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)03-0061-03
(上接第 60页)
表 5　AgNO3浓度对南盐油 1号下胚轴分化的影响
AgNO3浓度
(mg/L)
接种外植体数
(个)
出芽外植体数
(个)
再生频率
(%)
0 60 12 20.0
5 60 20 33.3
8 60 31 51.7
10 60 28 48.3
15 60 21 35.0
3　结论
本试验研究表明 ,甘蓝型油菜高效再生体系的建立与生
长调节剂 、Ag+、无菌苗苗龄等因素密切相关 , 2 , 4 -D对芽器
官具有很强的诱导作用 ,下胚轴在转化前预培养一定时间可
明显提高转化效率 。南盐油 1号油菜下胚轴外植体的 6d苗
龄在 MS+1.0 mg/L2 , 4-D+0.5 mg/L6-BA培养基预培
养 4 d后 , 转入分化培养基 MS+2.5 mg/L6 -BA+
0.05 mg/LNAA+8mg/LAgNO3培养 ,可以获得较高的芽再
生频率 。
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　　蝴蝶兰(Phalaenopsisspp.),别称蝶兰 ,为兰科蝴蝶兰属
热带或亚热带植物 ,其花形美丽 ,色彩漂亮 ,花期长久 ,深受人
们的喜爱 [ 1 ] 。蝴蝶兰为单轴型兰花 ,很少有侧芽萌发;蝴蝶
兰种子小并且不含有为胚萌发提供营养的胚乳或其他组织 ,
在自然条件下萌发率很低 ,用种子播种方式进行繁殖很难 。
因此蝴蝶兰愈伤组织诱导研究具有重要意义 。
　　兰花的组织培养在国外研究比较早 。据报道 , 1949年利
收稿日期:2009-11-03
基金项目:国家自然科学基金(编号:30660091);云南省应用基础研
究计划(编号:2006C0084M、 2006C0086M);云南省中青年学术技
术带头人后备人才培养计划(编号:2006PY01-61);云南省楚雄
州学术技术带头人项目(编号:200401);楚雄师范学院重点学科建
设项目(编号:05YJSXK03);楚雄师范学院学术带头人专项(编
号:05YJDTR08)。
作者简介:范树国(1965—),男 ,河北青县人 ,博士 ,教授 ,主要从事植
物生理生化及分子生物学研究。 E-mail:fansg@cxtc.edu.cn。
通信作者:邱　璐 ,硕士 ,教授 ,主要从事植物组织培养及转基因研
究。 E-mail:qiulu@cxtc.edu.cn。
用蝴蝶兰花梗休眠芽在无菌条件下发育成完整的植株 ,此法
经改进后曾一度成为蝴蝶兰的主要繁殖方式 ,但因外植体数
量有限而使繁殖系数难以提高 [2 ] 。 1960年 Morel最先成功进
行了兰花的茎尖培养并得到小植株 ,在此基础上 Wenda进一
步研究了较容易的无性繁殖兰花苗的方法 , 1956年后在美
国 、法国 、日本先后出现了利用组培繁殖兰花的专业种苗
商 [ 3 ] 。 1974年 Intuwong等 [ 4 ]利用蝴蝶兰茎尖诱导出原球茎
状体 ,再分化成植株 。 1975年日本学者田中 [ 5 ]以兰花实生苗
叶片为外植体诱导出原球茎 , 然后形成再生苗 。 1992年
Kundson[ 2]首次使兰花种子在无菌条件下发芽并良好生长 。
这些研究都为通过组织培养快繁蝴蝶兰打下了基础 。此后兰
花的快繁技术发展很快 ,目前已有 70个属 200 ～ 300种兰花
可通过组织培养方式进行快速繁殖 ,形成了规模宏大的 “兰
花工业 ” [6 ] 。
国内对蝴蝶兰的组织培养研究较晚 ,近年来出现了不少
报道 。伍成厚等以授粉后 30 d的蝴蝶兰子房作为材料诱导
愈伤组织 ,在 1 /4MS+2, 4-D1.0mg/L+6-BA0.1 mg/L+
蔗糖 30 g/L培养基上愈伤组织的诱导率达 90%[ 7] 。范树国
—61—江苏农业科学　2010年第 3期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.03.105
等以蝴蝶兰的根切段和叶片切段为外植体诱导愈伤组织 ,在
MS+NAA0.2 mg/L+6-BA1.0mg/L+活性炭 2.0g/L+椰
乳 100 ml/L培养基中根切段的诱导率达 30%[ 8] 。徐晓薇
等 [ 9 -14 ]学者也对蝴蝶兰组织培养进行了研究 。本试验以蝴
蝶兰杂交种苗 P.firedance“SFIL” f006(1294)为材料 ,研究
了 MS培养基中不同激素和添加物的种类和浓度对其愈伤组
织诱导的影响 ,试图为蝴蝶兰的再生系统提供更好的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
蝴蝶兰无菌苗 P.firedance“SFIL” f006(1294)的叶片切
段和根切段 。
1.2　培养基的配制
在 MS培养基上添加不同浓度 6 -BA(0、0.1、 0.3、
0.5 mg/L)、NAA(0、0.1、 0.5、1.0 mg/L)、蔗糖 (10、 20、 30、
40 g/L),采用 3因素 4水平 L16 (34 )正交设计(表 1)。 MS培
养基固定加活性炭 2.0g/L、椰乳 150 mL/L,调 pH值为 5.8。
表 1　蝴蝶兰f006愈伤组织诱导正交试验设计
处理号
因素及水平
A:NAA
(mg/L)
B:6-BA
(mg/L)
C:蔗糖
(g/L)
1 0 0 10
2 0 0.1 20
3 0 0.3 30
4 0 0.5 40
5 0.1 0 30
6 0.1 0.1 40
7 0.1 0.3 10
8 0.1 0.5 20
9 0.5 0 40
10 0.5 0.1 30
11 0.5 0.3 20
12 0.5 0.5 10
13 1.0 0 20
14 1.0 0.1 10
15 1.0 0.3 40
16 1.0 0.5 30
1.3　诱导培养
将外植体(根切段和叶片切段)接种在不同激素浓度的
MS培养基上 ,培养瓶遮光暗培养 7 d之后光照培养 , 温度
(25±1)℃,光照强度 1 000 ～ 1500 lx,光照时间 15h/d。
1.4　诱导率统计
接种 45d后统计愈伤组织诱导率:诱导率 =(产生愈伤组
织的外植体数 /外植体总数)×100%。诱导率的确定:愈伤组
织大于 1 mm×1mm的进行统计 ,不足1 mm×1mm的则不计。
运用 SPSS软件对试验结果进行统计分析。
2　结果与分析
正交试验结果见表 2 ,方差分析见表 3。从表 3的方差分
析结果可见 , NAA对蝴蝶兰诱导率有极显著影响 , 6-BA对
蝴蝶兰诱导率有显著影响 ,蔗糖对蝴蝶兰诱导率没有显著影
响 。因此利用 LSD法对不同浓度 NAA和 6-BA的影响进行
多重比较 ,结果见表 4、表 5和图 1。
表 2　蝴蝶兰f006根切段和叶片诱导愈伤组织结果
处理号
根切段
接种数(个)
产生愈伤组织数(个)
诱导率　(%)
处理号
叶片切段
接种数(个)
产生愈伤组织数(个)
诱导率(%)
1 20 0 0 1 20 0 0
2 20 0 0 2 20 0 0
3 20 0 0 3 20 0 0
4 20 0 0 4 20 0 0
5 20 0 0 5 20 0 0
6 20 0 0 6 20 0 0
7 20 4 20 7 20 0 0
8 20 3 15 8 20 0 0
9 20 0 0 9 20 0 0
10 20 2 10 10 20 0 0
11 20 3 15 11 20 0 0
12 20 1 5 12 20 0 0
13 20 1 5 13 20 0 0
14 20 1 5 14 20 1 5
15 20 2 10 15 20 0 0
16 20 1 5 16 20 0 0
表 3　蝴蝶兰f006愈伤组织诱导试验结果的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 相伴概率
模式 l 659.375(a) 9 73.264 4.159 0.003
处理间 903.125 1 903.125 51.274 0.000
NAA 353.125 3 117.708 6.683 0.002
6-BA 253.125 3 84.375 4.790 0.010
蔗糖 53.125 3 17.708 1.005 0.409
误差 387.500 22
总变异 1046.875 31
表 4　NAA的 LSD法多重比较结果分析
(I)NAA (J)NAA P值 显著性
0mg/L 0.1mg/L 0.001 <0.01
0.5mg/L 0.001 <0.01
1mg/L 0.026 <0.05
0.1mg/L 0.5mg/L 1.000 >0.05
1.0mg/L 0.151 >0.05
0.5mg/L 1.0mg/L 0.151 >0.05
表 5　6-BA的 LSD法多重比较结果分析
(I)6-BA (J)6-BA P值 显著性
0mg/L 0.1mg/L 0.381 >0.05
0.3mg/L 0.002 <0.01
0.5mg/L 0.049 <0.05
0.1mg/L 0.3mg/L 0.014 <0.05
0.5mg/L 0.246 >0.05
0.3mg/L 0.5mg/L 0.151 >0.05
　　由表 4可以看出 , NAA的 2水平和 3水平的相伴概率为
1.000 , 2水平和 4水平的相伴概率为 0.151 , 3水平和 4水平
的相伴概率为 0.151 ,都大于 0.05 ,说明 NAA的 2水平和 3
水平 、2水平和 4水平 、3水平和 4水平间没有显著差异;NAA
的 1水平和 2水平的相伴概率为 0.001,说明 1水平和 2水平
有极显著差异 , 1水平和 3水平的相伴概率为 0.001 ,说明 1
水平和 3水平有极显著差异 , 1水平和 4水平的相伴概率为
0.026,说明 1水平和 4水平有显著差异。
由表 5可以看出 , 6 -BA的 1水平和 2水平的相伴概率
—62— 江苏农业科学　2010年第 3期
为 0.381, 2水平和 4水平的相伴概率为 0.246 , 3水平和 4水
平的相伴概率为 0.151 ,都大于 0.05,说明 6-BA的 1水平和
2水平 、2水平和 4水平 、3水平和 4水平间没有显著差异 。
而 6-BA的 1水平和 3水平相伴概率为 0.002,说明 1水平
和 3水平有极显著差异 , 1水平和 4水平的相伴概率为
0.049,说明 1水平和 4水平有显著差异 , 2水平和 3水平的相
伴概率为 0.014,说明 2水平和 3水平有显著差异 。
由图 1可见 , 4条折线平行 ,说明没有交互作用 。从试验
结果直观分析 ,对 NAA来说 , 2水平和第 3水平的均值最大 ,但
第 2、3、4水平差异不显著 ,所以第 2、3、4水平用哪个水平都可
以;对 6-BA来说 ,第 3水平的均值最大 ,第 3水平和第 4水平
差异不显著 ,所以第 3水平和第 4水平用哪个水平都可以 。
3　结论
试验比较了根切段和叶片切段 2种外植体对蝴蝶兰愈伤
组织诱导的影响 ,结果表明:(1)根切断易形成愈伤组织 ,接
种后 45 d从切口处长出淡绿色或白色颗粒状愈伤组织;接种
后 45 ～ 60d,整个愈伤组织会向上突起 ,形成淡绿色瘤状愈伤
组织 。而叶片切段诱导愈伤组织则较困难 ,培养 45 d后 ,接
种的 80瓶叶片切段只有 1个培养瓶中的 1个外植体形成愈
伤组织 。 (2)当激素和蔗糖按 NAA0.1 mg/L+6 -BA
0.3mg/L+蔗糖 10 g/L配比时 ,根切段诱导率最高达 20%。
(3)叶片切段不适宜诱导愈伤组织 。
4　讨论
当激素和蔗糖按 NAA0.1 mg/L+6-BA0.3 mg/L+蔗
糖 10g/L配比时 ,根切段诱导率最高 ,达 20%。 NAA和 6 -
BA用量在所取的四个水平中分别以 0.1 mg/L和 0.3 mg/L
为佳 。在诱导蝴蝶兰愈伤组织时 , NAA与 6-BA经常结合使
用 ,具有促进细胞生长和分裂 、诱导愈伤组织 、促进根分化的
作用 。蔗糖是组织培养中最常用的碳源 ,在植物组织培养中 ,
糖的用量不仅影响着培养物的生长速度和生长量 ,还影响其
代谢水平 、次生代谢物的合成以及细胞的形态和发生 ,是影响
植物组织培养的关键因素之一 。活性炭加入培养基中主要是
利用其吸附能力减少一些有害物质的影响 。椰乳是使用最
多 、效果最明显的一种天然复合物 ,使用效果与其果实成熟度
及产地的关系也很大 ,一般使用浓度在 10% ～ 20%。
愈伤组织诱导是分化再生植株的第一步 ,但是愈伤组织
诱导比较困难 。本试验证明了蝴蝶兰的根切段和叶片切段均
可诱导愈伤组织 ,但是结果不理想 ,诱导率低 ,还需要进一步
研究提高诱导率 。导致这样的结果 ,原因有可能是所选的激
素浓度不合适 ,在以后的研究中应该改变激素浓度的梯度;也
有可能是所选的杂交品系不合适 ,在以后的研究中应该更换
杂交品系;也有可能是所选培养基不合适 ,在以后的研究中应
该另选其他培养基 。
范树国等在做蝴蝶兰愈伤组织诱导试验时 ,当附加 NAA
2.0 mg/L+6 -BA0.5 mg/L+活性炭 4.0 g/L+椰乳
100 mL/L时有一步成苗的现象 ,而在本试验中没有发现此现
象 [ 8] ;范树国等在 MS培养基中加不同浓度激素和有机物
6-BA(2、3、4、5 mg/L)、NAA(0、0.1、0.5、1.0 mg/L)、活性炭
(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L)和椰乳 15%,以 P.firedance“SFIL”
f006(1294)的根切段为外植体诱导类原球茎 ,但诱导率低 ,最
高为 5%[ 15 ];张元国等用试管苗茎尖在附加 6-BA5.0 mg/L
和 NAA0.5mg/L的 MS培养基上诱导原球茎状体 ,诱导率可
达 100%[16] 。近年来 ,虽然国内外在蝴蝶兰的组培快繁方面取
得了一些进展 ,但繁殖系数低、增殖难等问题还未彻底解决 ,加
上不同品种 、不同外植体对培养基和培养条件的要求也不同 ,
所以对其影响因素进行更深入的研究具有重要意义。
本试验所用蝴蝶兰组培苗叶片切段诱导愈伤组织比较困
难 ,是否因为气候 、海拔等因素的影响还有待进一步研究 。
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