全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:758-762
文章编号:1001-6880(2015)5-0758-05
收稿日期:2014-11-07 接受日期:2015-02-03
基金项目:云南省高新技术产业发展项目(云发改高技 20121956);国
家自然基金(31260075) ;云南省自然基金(2012FB146)
* 通讯作者 E-mail:52133490@ qq． com
滇重楼的 psbA-trnH条形码分子鉴定研究
刘 涛1，赵英良2，杨 莹2，王 玲1，李 玛1，王欣林2，周 博2，杨生超1*
1云南农业大学;2 云南中烟工业有限责任公司，昆明 650201
摘 要:为探讨滇重楼药材鉴定新方法，本研究通过对重楼样品提取基因组 DNA，PCＲ 扩增叶绿体 psbA-trnH 序
列并进行双向测序，所得序列经 CodonCode Aligner拼接后，采用 MEGA5． 0 软件进行序列比对，计算种内和种间
遗传距离(K2P) ，构建邻接数(neighbor-joining tree)进行结果分析。研究表明，叶绿体 psbA-trnH片段在滇重楼种
内变异较小，平均 K2P遗传距离为 0． 007，而滇重楼与其它重楼种间平均 K2P遗传距离为 0． 025，滇重楼种间最
大 K2P遗传距离明显小于滇重楼与重楼属其它种内的最小 K2P遗传距离。中药材 DNA 条形码鉴定系统比对
和 NJ树鉴定结果均表明 psbA-trnH序列可区分滇重楼及其同属物种，且具有较好的稳定性和准确性，为保障临
床安全用药提供了新的技术手段。
关键词:滇重楼;DNA条形码;psbA-trnH;分子鉴定
中图分类号:S184 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 05． 002
Molecular Identification of Paris polyphylla var．
yunnanensis using psbA-trnH DNA Barcoding
LIU Tao1，ZHAO Ying-liang2，YANG Ying2，WANG Ling1，LI Ma1，WANG Xin-lin2，ZHOU Bo2，YANG Sheng-chao1*
1Yunnan Agriculture University;2China Tobacco Yunnan Industrial Co．，Ltd，Kunming 650201，China
Abstract:To explore a new method of identifying Paris polyphylla var． yunnanensis，the genomic DNA from P． polyphylla
was extracted and the chloroplast psbA-trnH sequence was amplified by PCＲ． After spliced by CodonCode Aligne，the in-
traspecific and interspecific genetic distance (K2P)and neighbor-joining (NJ)tree were built by MEGA5． 0 software．
The result showed that the chloroplast psbA-trnH fragments found in intraspecific variation was small and the average
K2P genetic distance was 0． 007，while interspecific was 0． 025． The maximum interspecific genetic distance of P．
polyphylla was significantly less than the minimum K2P of intraspecific． The DNA barcoding comparison and NJ tree
showed that psbA-trnH sequences can be used to distinguish P． polyphylla． The method was stable，accurate and will pro-
vide new technical means for clinical medication safety．
Key words:Paris polyphylla var． yunnanensis;DNA barcoding;psbA-trnH;molecular identification
重楼属(Paris L．)隶属于百合科(Liliaceae) ，全
属共 28 种，均为多年生草本，分布于欧亚大陆的热
带及温带地区［1］。该属是一个有着重要经济价值
的植物类群，药用历史悠久，但药用重楼的基源一直
比较混乱，本属蚤休亚属(Paris subg． Daiswa sensus)
的所有种类均具有粗壮的根状茎［1］。为澄清药用
重楼基源混乱的问题，李恒对《滇南本草》等古籍文
献进行考证，表明药用重楼应以滇重楼(Pairs
polyphylla Smith var． yunnanensis ［Franch．］ Hand-
Mazz)为正品，其它种类均为代用品［2］。
滇重楼(P． polyphylla)为多年生草本植物，味
苦，有小毒，具有清热解毒、消肿止痛之功效，具有抗
肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，也可用
于疗疮痈肿、咽喉肿痛、惊风抽搐的治疗，是很多中
成药如宫血宁胶囊、三七血伤宁胶囊和清热解毒片
等著名中成药的主要原料［3］。因滇重楼以根状茎
入药，根据形态学、解剖学等特征难以对正品及代用
品进行区分，使得在药材的收购及工厂化生产中无
法将滇重楼与其它种区别开来;鉴于不同种类的重
楼在药用成分甾体皂甙的种类、含量等方面存在显
著的差异［4］，滇重楼及代用品的混用将给中医用药
医药工业生产的质量控制带来了极大的隐患。因
此，对滇重楼及其代用品的鉴定方法和手段进行研
究，摸索一套在药材收购和生产中行之有效的鉴定
方法，对于医药生产的质量控制及保护重楼属植物
中的珍惜、濒危种类有着重要的意义。
对于滇重楼的药材的鉴定目前主要还是利用传
统的形态鉴别方式，尽管也有学者利用滇重楼中皂
甙类物质进行药材品质的判断依据，但由于滇重楼
的药理作用并非仅仅由单一成分决定，同时各品种
所含皂甙类化学成分及含量有较大差别，因此仅用
皂甙类物质鉴别药材的品质和真伪也不具客观性。
分子方面，张金渝等利用 ＲAPD 技术从植物系统分
类的角度对重楼属中的 4 种植物进行多态性分析，
发现不同种类指纹图谱有明显的差异［5］;何俊等采
用 ISSＲ技术对主要分布于云南的滇重楼不同居群
进行多态性分析，发现不同居群的指纹图谱也有明
显的差异，认为遗传多样性主要存在于居群间［6］;
但由于有限的采样数量和所采用分子标记的低分辨
率，加之上述作者并未从分子鉴定的角度对滇重楼
进行研究，因此重楼属不同种类和居群的遗传多样
性和分子鉴定还有待进一步的研究。
DNA条形码(DNA barcoding)技术以稳定的基
因组信息为依据，有望实现对物种鉴定的标准
化［7，8］。但到目前为止，还没有应用 DNA Barcoding
技术对滇重楼进行分子鉴别，更没有滇重楼的专用
条形码的报道。本实验利用 DNA Barcoding 技术对
重楼属下滇重楼进行分子鉴定。为重楼药材的快速
准确鉴定提供保障，也为临床用药安全奠定基础。
1 实验材料
本研究所用材料共 12 个物种 35 个样品，包括
试验样品及 GenBank 下载序列。其中，滇重楼药材
样品 24 个(来自不同局群) ，其余重楼种类样品各 1
个。所有材料经云南农业大学何忠俊教授鉴定，凭
证样品保存于云南农业大学农学与生物技术学院。
实验材料及序列的 GenBank登录号见表 1。
表 1 本实验中所采集的滇重楼样本信息
Table 1 Origins of P． polyphylla samples used in this study
序号
No．
采集地
Ｒesouce
拉丁名
Latin name
中文名
Chinese name
NCBI网站上序列登录号
NCBI accession No．
1 云南省宣威市 Xuanwei city P． polyphylla 滇重楼
2 云南省墨江县 Mojiang city P． polyphylla 滇重楼
3 云南省西昌县 Xichang city P． polyphylla 滇重楼
4 云南省丽江市 Lijiang city P． polyphylla 滇重楼
5 云南省弥渡县 Midu city P． polyphylla 滇重楼
6 云南省禄劝县 Luquan city P． polyphylla 滇重楼
7 云南省镇源县 Zhenyuan city P． polyphylla 滇重楼
8 云南省玉溪市 Yuxi city P． polyphylla 滇重楼
9 云南省普洱市 Puer city P． polyphylla 滇重楼
10 云南省巧家县 Qiaojia city P． polyphylla 滇重楼
11 云南省泸水县 Lushui city P． polyphylla 滇重楼
12 云南省维西县 Weixi city P． polyphylla 滇重楼
13 云南省龙里县 Longli city P． polyphylla 滇重楼
14 云南省永胜县 Yongsheng city P． polyphylla 滇重楼
15 云南省富宁县 Funing city P． polyphylla 滇重楼
16 云南省镇雄县 Zhenxiong city P． polyphylla 滇重楼
17 云南省剑川县 Jianchuan city P． polyphylla 滇重楼
18 云南省会里县 Huili city P． polyphylla 滇重楼
19 云南省永善县 Yongshan city P． polyphylla 滇重楼
20 云南省迪庆县 Diqing city P． polyphylla 滇重楼
21 云南省永平县 Yongping city P． polyphylla 滇重楼
957Vol. 27 刘 涛等:滇重楼的 psbA-trnH条形码分子鉴定研究
22 云南省石屏县 Shiping city P． polyphylla 滇重楼
23 云南省中甸县 Zhongdian city P． polyphylla 滇重楼
24 云南省临沧县 Lincang city P． polyphylla 滇重楼
25 海南省五指山 Wuzhishan city P． dunniana 海南重楼 DQ404259
26 云南省剑川县 Jianchuang city P． daliensis 大理重楼 DQ404260
27 云南省勐腊县 Mengla city P． vietnamensis 南重楼 DQ404246
28 云南省巍山县 Weishan city P． mairei 毛重楼 DQ404247
29 云南省西畴县 Xichou city P． cronquistii 凌云重楼 DQ404255
30 重庆市南川区 Nanchong district P． delavayi var． delavayi 金线重楼 DQ404249
31 云南省福贡县 Fugong city P． thibeitca var． apetala 黑籽重楼 DQ404250
32 湖南省桑植县 Sangzhi city P． fargessi 球药隔重楼 DQ404251
33 云南省屏边县 Pingbian city P． delavayi var． petiolata 卵叶重楼 DQ404254
34 云南省巧家县 Qiaojia city P． marmomata 花叶重楼 DQ404256
35 云南省宜良县 Yiliang city P． axialis 五指莲重楼 DQ404244
2 实验方法
2． 1 样本 DNA的提取
硅胶干燥样品各 0． 5 g，液氮研磨，用植物基因
组 DNA 提取试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit，QIA-
GEN)提取基因组 DNA。
2． 2 PCＲ扩增及测序
引物为 psbA / trnH 引物，引物 psbA 的碱基序
列:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，下游引物 trnH
的碱基序列:CGCGCATGGTGGATTCACAAATC;样
本 DNA加入 psbA / trnH引物进行扩增，反应热循环
程序为:94 ℃预变性 5 min;然后进入循环，每个循
环 94 ℃变性 30sec，54 ℃退火 30 sec，72 ℃延伸 90
sec，共 30 个热循环，最后延伸 72 ℃延伸 7min;4 ℃
冷却后取出;扩增反应在 PCＲ仪上进行。PCＲ反应
体系(25 μL) :ddH2O 17． 8 μL，10 × PCＲ buffer
(Mg +2 + Plus)2． 5 μL，dNTPs(2． 5 mmol /L)1． 5 μL，
Tag酶(5 u /μL)0． 2 μL，正向引物(10μmol /L)1
μL，反向引物(10 μmol /L)1 μL，模板 DNA(50 ng /
μL)1． 0 μL。将扩增成功的 PCＲ 产物(出现明显
PCＲ条带)进行纯化后(采用上海生工核酸凝胶纯
化试剂盒) ，送上海生工测序中心使用 ABI3730XL
测序仪(Applied Biosystems Co．，USA)双向测序。
ＲNA酶、dNTP、PCＲ reaction buffer，均购自宝生生物
公司。
2． 3 数据处理和分析
测序峰图采用序列拼接软件 Codoncode Aligner
v2． 06(CodonCode Co，USA)校对拼接，去除低质量
序列及引物区，利用 ClustalX v2． 0 进行多序列比对
并查错。利用软件 MEGA5． 0(Molecular Evolution-
ary Genetics Analysis)分析比对［9］，并基于 Kimura 2-
parameter(K2P)模型进行种内种间遗传距离分析，
用邻接(NJ)法构建系统聚类树。利用 BLAST 比对
和 NJ树对滇重楼及其同属近缘种进行鉴定分析。
3 实验结果
3． 1 基因组 DNA提取及 PCＲ扩增
提取的重楼样品基因组 DNA 电泳检测显示条
带主带明显，边缘有弥散状出现，说明 DNA 有少部
分降解。NanoDrop 检测结果表明所提取基因组
DNA的 A260 /A280 值均处于 1． 6 ～ 1． 8 间，且 DNA
浓度均较高(＞ 100 ng /μL) ，说明样品污染小，可作
为 PCＲ反应模版扩增。经 PCＲ 反应，所有样品的
均显示较亮条带，可用于测序分析。PCＲ 扩增效率
和测序成功率是评价 DNA 条形码序列的一个重要
指标，实验表明，psbA-trnH 片段在重楼属植物中扩
增非常容易，测序成功率高，适合做为重楼属植物的
条形码序列。
3． 2 滇重楼及其它种重楼 psbA-trnH序列分析
本研究中重楼药材的 psbA-trnH 序列分析表明，
基于 K2P模型的遗传距离分析，滇重楼种内变异较
小，其 K2P遗传距离为 0 ～ 0． 018，平均 K2P 遗传距
离为 0． 007，不同重楼种间变异较大，平均 K2P遗传
距离为 0． 025，滇重楼与其它种最小种间 K2P 遗传
距离为 0． 040。种间最小遗传距离明显大于滇重楼
067 天然产物研究与开发 Vol. 27
的种内最大遗传距离。利用中药材 DNA 条形码鉴
定系统对滇重楼及其它重楼的序列进行比对，显示
所有地区的滇重楼在位点 1-4 上的碱基都为 CTGA，
而其余重楼为 AGAC;所有地区的滇重楼在位点 19
上的碱基缺失，而其余重楼为 A;所有地区的滇重楼
在位点 77 上的碱基都为 C，而其余重楼为 T;所有
地区的滇重楼在位点 138 上的碱基都为 C，而其余
重楼为 T;所有地区的滇重楼在位点 792 上的碱基
都为 G，而其余重楼为 T或 C;所有地区的滇重楼在
位点 1110-1113 上的碱基都为 GGCG，而其余重楼为
TCGA;所有地区的滇重楼在位点 1116 上的碱基都
为 G，而其余重楼为 T;所有地区的滇重楼在位点
1119-1120 上的碱基都为 CC，而其余重楼为 TA、TG
或 GA。详细情况见表 2。通过这些滇重楼的 DNA
条形码可以非常容易的对滇重楼进行鉴定。
表 2 实验样本的 psbA-trnH片段信息位点统计情况
Table 2 The informative sites statistics of psbA-trnH fragment in
this experiment
样品来源
Sample resource
滇重楼
P． polyphylla
重楼属下其它重楼种
Other Paris
位点 site (1-4) CTGA AGAC
位点 site (19) 缺失 A
位点 site (77) C T
位点 site (138) C T
位点 site (792) G T或 C
位点 site (1110-1113) GGCG TCGA
位点 site (1116) G T
位点 site (1119-1120) CC TA、TG或 GA
基于 psbA-trnH序列构建的 NJ系统聚类树见图
1，结果显示，滇重楼单独聚为一支，其近缘种聚为一
支，表现出良好的单系性。因此，psbA-trnH 序列作
为条形码可快速准确鉴别滇重楼及其它重楼。理想
的 DNA条形码序列应当具有明显的种间变异，同时
种内变异足够小。实验表明，psbA-trnH 片段在滇重
楼种内变异幅度在 0． 0% ～ 1． 8%之间，而种间变异
程度在 4． 0% ～6． 2%之间，因此该序列适合做为重
楼属植物的条形码序列，且很容易将不同种重楼鉴
别开来。
4 讨论
近年来，由于 DNA分子标记技术在植物学中的
广泛应用，使药用植物的鉴别工作也取得了空前的
图 1 基于 psbA-trnH序列构建的 NJ树
Fig. 1 NJ tree based on psbA-trnH sequences
发展。传统的鉴定手段人为干扰因素较多，而 DNA
分子标记在中药鉴别中不受生长发育阶段、供试部
位、环境条件的影响，能从分子水平上客观地反映待
测材料之间的差异，特别适合药材近缘品种和道地
药材的鉴定。从国内外研究状况来看，由于 DNA分
子标记技术能客观反映物种间亲源关系和遗传多样
性，近年来，不少学者都已成功尝试把它们用于药用
植物的鉴定。但这些分子标记技术往往表现出通用
性低，可重复性不强的特点［10］。与其他分子鉴定方
法相比，DNA条形码技术可使鉴定过程更加趋于标
准化，在中药鉴定领域中展示了广阔的应用前
景［8］。
滇重楼是我国重要的民族中药，因同属重楼在
形态上难以区分，使得在药材的收购及工厂化生产
中无法将滇重楼与其它种区别开来，给中医用药医
药工业生产的质量控制带来了极大的隐患。为了确
保临床用药安全，本研究采用 DNA条形码技术对中
药材滇重楼及同属其他种进行鉴定研究。结果表明
psbA-trnH条形码序列可有效鉴别滇重楼药材，为滇
167Vol. 27 刘 涛等:滇重楼的 psbA-trnH条形码分子鉴定研究
重楼药材鉴定的标准化奠定了基础，具有重要的应
用和参考价值。
本研究为排除滇重楼不同产地个体间存在的变
异信息，找到滇重楼特有的区别与其它重楼的信息
位点，便从取样策略上，广泛采集了滇重楼所分布的
区域，以此来确保滇重楼条形码的准确性。通过比
对发现，叶绿体上的 psbA-trnH片段在滇重楼种内变
异很小，即不同产地间个体的序列相似性达到
(98. 2% ～ 100%) ，说明该片段在滇重楼种内的信
息位点很稳定;而种间比较发现，滇重楼与重楼属下
的其它重楼种间的序列相似性低于 96%，即该片段
在种间变异幅度较大，可以轻易地将不同种重楼区
分开来。因此仅从序列的相似性程度就可以将滇重
楼与其它重楼种区分开来。
为了找到滇重楼特有的 DNA条形码，发明人通
过序列比对分析，找出了滇重楼内部稳定的信息位
点，而这些位点恰恰区别于重楼属下的其它重楼植
物，详细信息见表 2。通过这些特有的信息位点，可
以轻易的将滇重楼植物与重楼属下的其他重楼植物
鉴别开来。另外，psbA-trnH 片段序列两端的序列都
很保守，便于通用引物的设计，十分适合做滇重楼的
DNA条形码，该条形码的发现对于滇重楼道地药材
的保护利用具有十分重要的作用。
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